全 文 ：四倍体菘蓝毛状根的诱导及其植株再生
汪 洪　王晓慧　王艳红　李校堃
　　摘　要　利用发根农杆菌 A4和 R1000感染
四倍体菘蓝子叶 ,毛状根诱导频率和得根率分别
达 72.5%和 27%以上。 A4诱导四倍体菘蓝毛状
根优于 R1000 ,光照对毛状根的诱导起着重要作
用 ,外源激素 IAA能明显地促进毛状根的诱导作
用 。 rolB、rolC基因的 PCR分析表明 , Ri质粒中的
T-DNA片段已整合到毛状根细胞基因组中 。毛状
根能在不含激素的 MS固体培养基上分化出不定
芽 , 6-BA能促进毛状根不定芽的诱导;NAA促进
不定芽生根 ,再生完整植株。
关键词　四倍体菘蓝;毛状根;植株再生
菘蓝(IsatisindigoticaFort.)为十字花科常用
中药板蓝根和大青叶的主要来源 ,具有清热解毒 、
凉血消斑的功效以及抗菌 、抗病毒 、抗内毒素和抗
癌的药理作用 [ 1, 2] 。菘蓝在我国广为栽培 。然而 ,
就栽培品种来讲 ,长时间栽培可能会导致某些品
性的退化。利用毛状根培养技术对菘蓝品系进行
遗传改良是一条有效的途径 。毛状根培养系不仅
具有生长迅速 ,次生代谢合成能力强的优点 ,而且
生长能力稳定 ,不需外源激素 ,利于天然药物的开
发和利用 。目前 ,对菘蓝遗传转化方面的研究已
有少量报道 [ 3, 4] 。本研究利用四倍体菘蓝为试验
材料 ,用发根农杆菌 A4和 R1000对其进行遗传转
化 ,成功地诱导出毛状根优良体系 ,并通过毛状根
建立植株再生体系 ,为四倍体菘蓝的遗传改良奠
定了基础。
1　材料与方法
1.1　菌株与植物材料
发根农杆菌为本实验室保存的 A4和 R1000,
由华南师范大学生命科学学院施和平教授惠赠。
四倍体菘蓝种子由第二军医大学药学院张磊博士
作者简介:汪洪 , 讲师 ,研究方向为植物生物技术 , 温州医学院药学
院;浙江省浙南特色中药研究重点实验室 , 325035,浙江温州
王晓慧 ,王艳红 , 吉林农大教育部生物反应器与药物开发工程中心
李校堃(通讯作者),通讯地址同第 1作者
收稿日期:2008-04-02;修回日期:2008-08-19
惠赠。
1.2　方法
1.2.1　农杆菌的活化 　从 -70℃冰箱中取出保
存的菌种 ,临用前划线接种于 YEB固体培养基上 ,
(25±1)℃条件下纯化 3次 ,挑取单菌落转入 YEB
液体培养基中振荡暗培养 , 100r/min, 振幅 2cm。
将处于对数生长期的菌液用 YEB培养基稀释至
OD600 =0.5 ～ 0.7时用于感染外植体 。
1.2.2　毛状根的诱导与培养　切取萌发 3d的四
倍体菘蓝无菌苗子叶 ,置于附加不同浓度 IAA的
MS培养基上预培养 , 预培养条件为光照强度
3 000Lx,光照 16h/d,温度(25±1)℃。预培养 2d
后转入已活化的菌液中 ,暗条件下感染 10 ～ 15min
后放回原培养基上共培养 2d,再转移到含 300mg/L
Cef的 MS固体培养基上诱导毛状根 ,同时以未经
感染的子叶作对照 。切取约 2cm的根尖转至不含
任何激素 、附加 30mg/L卡那霉素的 MS固体培养
基上培养 ,每 2 ～ 3周继代 1次 ,确认具有卡那霉素
抗性的毛状根再转入无抗生素的培养基上继续培
养 。
1.2.3　毛状根的 PCR检测　质粒 DNA的提取参
照 Sambrook等 [ 5]提取 ,植物 DNA提取参照 Rogers
等 [ 6]的 CTAB法 , 分别提取毛状根和对照根中的
DNA,根据 Furner等[ 7]所述的 rolB和 rolC基因的 DNA
序列设计引物:rolB5′-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3′
和 5′-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3′;rolC5′-CTC-
CTGACATCAAACTCGTC-3′和 5′-TGCTTCGAGTTAT-
GGGTACA-3′。反应条件:94℃变性 1min;53℃退
火 1min, 72℃延伸 1min, 35个循环;72℃延伸
6min。 rolB和 rolC基因扩增长度约分别为 383bp
和 560bp。
1.2.4　毛状根再生苗的获得　切取优良毛状根
系 1 ～ 1.5cm长的根尖分别置于不含激素或添加
不同浓度配比的 NAA和 6-BA的 MS固体培养基
上诱导不定芽 ,每一处理 30个根尖 ,重复 3次 ,待
不定芽长至 2 ～ 3cm时 ,切下移至生根培养基上诱
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作物杂志　Crops 2008.5DOI :10.16035/j.issn.1001-7283.2008.05.011
导生根 。培养条件为(25 ±1)℃,光照 16h/d,光照
强度 3 000Lx。
2　结果与分析
2.1　毛状根的诱导和培养
20d后统计毛状根诱导频率及得根率 ,表 1结
果表明 ,光照对四倍体菘蓝子叶毛状根的诱导影
响比较明显 。暗条件下诱导的子叶在 10d后 80%
以上均发生不同程度的黄化 ,其生理状况极为不
佳 ,但转入 16h/d光照培养后 ,发生黄化的子叶均
有不同程度的转绿 ,并伴随根的产生 。转入光照
培养 20d后统计毛状根的诱导频率及得根率(表
2),结果显示 , 毛状根的诱导频率由原来的 0 ～
表 1　不同培养条件对四倍体菘蓝子叶毛状根诱导的影响
处理组 激素 光照(h/d)
毛状根诱导频率(%)
A4 R1000
得根率(%)
A4 R1000
1 - 0 0 0 0 0
2 - 16 32.2 28.9 17.5 13.6
3 IAA 0 5.6 3.3 3.4 3.3
4 IAA 16 72.5 31.9 31.9 27.6
　注:-,无激素;得根率(%)=根总数 /诱导出根的外植体数 ×
100,下同
表 2　转入光照培养 20d后四倍体菘蓝子叶
毛状根的诱导结果
激素 诱导频率(%)A4 R1000
得根率(%)
A4 R1000
- 18.4 17.9 7.6 6.7
IAA 48.1 39.1 11.3 8.9
5.6%显著提高到 17.9% ～ 48.1%,得根率由 0 ～
3.4%提高到 6.7% ～ 11.3%。由此可见 ,光对四
倍体菘蓝子叶毛状根的诱导极为重要 ,同时说明
了光照可逆转暗培养条件下所不能进行的毛状根
的诱导作用 ,但早期缺光培养对依赖光的毛状根
的诱导仍有一定的影响 。根的发生多从伤口直接
长出(图 1),也有少量根从伤口附近的愈伤组织
中长出(图 2)。
图 1　从子叶伤口处诱导出毛状根
图 2　从子叶愈伤组织处诱导出毛状根
　　表 1表明 ,激素 IAA对四倍体菘蓝毛状根的
诱导有明显的促进作用 。添加了 IAA的四倍体菘
蓝毛状根的诱导频率和得根率可分别达 72.5%和
27.6%,单个子叶出根数可达 70条以上 。在光照 、
不添加任何激素条件下 ,仍有少量毛状根的产生 ,
可能是整合进外植体基因组上的外源 RiT-DNA
上含有生长素合成酶基因的作用 。由于植物体本
身含有一定浓度的生长素 ,因此也有可能在不含
外源激素的培养基上诱导 rolB基因表达 ,从而诱
导出相当比例的毛状根 。
表 1还表明 ,对四倍体菘蓝子叶毛状根的诱导
A4优于 R1000。 A4诱导出的根较粗壮且平直 ,色
较淡(图 3),且生长速度快;而由 R1000诱导出的
根卷曲 ,色较白(图 4),生长速度比较缓慢。对照
子叶仅长出少量的根 。就同一外植体而言 ,不同
的菌株具有不同的致根能力 [ 8] 。
32
作物杂志　Crops2008.5
　　经感染诱导出的毛状根均能在不含激素的培
养基上快速生长 , 且失去向地性 ,贴着培养基表
面 、沿着瓶壁向上生长(图 5),而未经感染的根不
能生长 。
图 5　毛状根的生长
2.2　毛状根的 PCR鉴定
选择经过 Kanr试验初步鉴定为阳性的毛状根
和对照的子叶长出的自然根提取 DNA,以 rolB、
rolC基因的序列设计的引物进行基因组 PCR(图
6)。结果正常根无特异扩增产物 (图 6中 5、6泳
道),而经 Kanr试验鉴定为阳性的毛状根共有两
条明显的特异扩增条带(图 6中 1、3泳道),通过
Marker比较 ,分别是 383bp的 rolB基因扩增产物
和 560bp的 rolC基因产物 ,从分子水平上证明四
倍体菘蓝毛状根基因组中已整合了外源 Ri质粒的
T-DNA片段 。
图 6　四倍体菘蓝毛状根中 rolB、rolC基因的 PCR鉴定
1.毛状根 +引物 rolB;2.发根农杆菌 +引物 rolB;3.毛状根发根
农杆菌 +引物 rolC;4.发根农杆菌 +引物 rolC;5.CK+引物 rolC;
6.CK+引物 rolB
2.3　毛状根再生苗的获得
激素对毛状根不定芽的诱导结果列入表 3。
表 3　NAA和 6-BA对菘蓝毛状根不定芽分化能力的影响
处理组 激素(mg/L)NAA 6-BA
芽诱导数量
45d 90d
1 0 0 9 21
2 1 0 11 25
3 0 0.5 21 43
4 1 0.5 29 67
　注:每一处理组不定芽的数目来源于 30个根段培养物
6-BA能不同程度地提高毛状根再生不定芽的频
率 ,而 NAA对毛状根不定芽的诱导作用不明显 ,
但配合使用 NAA和 6-BA不定芽诱导效果较好 ,
芽生长较粗壮。芽的诱导可通过毛状根的尖端逐
渐膨大并转绿(图 7),进而分化出不定芽(图 8),
也有不经毛状根转绿阶段 ,直接从白色毛状根分
化出不定芽 (图 9)。本试验还观察到 ,添加了激
素比不添加激素出芽的时间更早 。
　　所有的不定芽均能在含 NAA的激素上长根 ,
再生完整植株 ,而在无激素的 MS固体培养基上很
少生根 ,说明激素 NAA对不定芽的生根诱导有明
显的作用 。
3　讨论
发根农杆菌种类 、被感染的部位细胞类型以
及生理状况等方面的不同 ,使 T-DNA插入植物基
33
作物杂志　Crops 2008.5
因组的位置 、长度和拷贝数千差万别 [ 9] 。因此 ,植
物感染部分产生在形态 、生长和有效成分含量等
方面各异的毛状根系 。光照对毛状根的诱导是必
需的 ,可能是光照条件下有利于外植体的存活 ,保
持其良好的生理状态 ,同时又部分地抑制了农杆
菌的繁殖 ,从而有利于转化;激素能提高植物毛状
根的诱导频率 ,因为外源激素使外植体更容易形
成愈伤组织或分裂态的细胞 ,而 Ri质粒对于先形
成的愈伤组织及分裂态的细胞更容易整合 ,可提高
外源基因的瞬时表达和转化率 [ 10] ;Michael[ 11]则认
为 ,生长素是 rol基因表达的诱导物 ,尤其是对 rolB
基因 ,可使 rolB表达量提高 20 ～ 100倍。 Filippini
等 [ 12]用玉米 ABP的抗体和 rolB基因编码蛋白的抗
体试验证实了烟草细胞膜上存在有 1个专一的与
rolB基因编码蛋白有关的生长素 -转导途径 。
毛状根能在不含任何激素的条件下自发地分
化出不定芽 ,可能与光照条件及毛状根内生长素
的作用有关 ,光照条件下 ,毛状根局部组织转绿 ,
在生长素基因的作用下 , 毛状根内逐渐合成并积
累较高浓度的生长素 ,在两者的共同作用下 ,使得
毛状根自然分化出不定芽 。由毛状根直接再生植
株 85%表型正常 ,少数植株出现叶片边缘皱缩 ,节
间缩短 ,植株矮化等现象 ,而有些植株则是在生长
的某个时期才表现出这些现象 , 可能与整合进外
源基因的拷贝数不同有关 。在农杆菌介导的烟草
再生植株中 ,叶片的皱缩与 TL-DNA有关 ,与 TR-
DNA无关 [ 13] , rolC基因的表达导致植株矮化 ,顶
端优势减弱;rol基因的表达还受发育进程的调
控 [ 14] ,在营养生长时 , rolC基因表达限于伴胞和原
生韧皮部细胞中 [ 15] 。
本试验利用 A4和 R1000建立了四倍体菘蓝
的遗传转化体系 ,为进一步引入抗病 、抗虫等目的
基因改良品种奠定了良好的基础 。
参考文献
1国家药典委员会.中华人民共和国药典.北京:化学工业出版社 ,
2005:142
2胡娅 ,方建国 ,刘云海.板蓝根的药理作用与临床应用.医药导报 ,
2005, 24(10):921 ～ 922
3李博华 ,张汉明 ,范国荣等.四倍体菘蓝毛状根的培养及其抗内毒
素成分分析.中国药学杂志 , 2000, 35(11):728 ～ 731
4李博华 ,张汉明 ,王寅等.四倍体菘蓝毛状根的抗内毒素作用.第
二军医大学学报 , 2000, 21(3):201 ～ 203
5SambrookJ, FritschEF, ManiatisT.MolecularCloning.金冬雁 ,黎孟
枫等译.分子克隆实验指南(第二版).北京:科学出版社 , 1996
6RogersSO, BendichAJ.ExtranctionofDNAfrommiligramamountsof
fresh, herbariumandmummifiedplanttissue.PlantMolBiol, 1985,
(5):69 ～ 76
7 FurnerIJ, HufmanGA, AmasinoRM, etal.AnAgrobacteriumtrans-
formationintheevolutionofthegenusNicotiana.Nature, 1986, 319:
422 ～ 427
8付春祥 ,金治平 ,杨睿等.新疆雪莲毛状根的诱导及其植株再生体
系的建立.生物工程学报.2004, 20(3):366～ 371
9 DavidC, PetitA, TempeJ.T-DNAlengthvariabilityinmannopine
hairyroot:morethan50kilobasepairsofpRiT-DNAcanintegratein
plantcels.PlantCelReports, 1988, 7:92
10 TakafumiYoshikawa, TsutomuFuruya.Saponinproductionbycul-
turesofPanaxginsengtransformedwithAgrobacteriumrhizogenes.
PlantCelReports, 1987, 6:449
11 MichaelT.TheplantoncogenerolA, BandCfromAgrobacterium
rhizogenes;efectsonmorphlogy, developmentandhormonemetabo-
lism.MethodsMolBiol, 1995, 44:207～ 222
12FilippiniF, SchiavoF, TerziM, etal.TheplantoncogenerolBalters
bindingofauxintoplantcelmembranes.PlantCelPhysiol, 1994,
35:767～ 771
13 BrainHTaylor, RichadMAmsino, FrankRWhite, etal.T-DNAa-
nalysisofplantsregeneratedfromhairyroottumors.MolGenGenet,
1985, 201:554 ～ 557
14FujiN, etal.AnalysisoftherolCpromoterregioninvolvedinsomatic
embryogenesis-relatedactivationincarrotcelcultures.PlantPhysi-
ol, 1994, 104:1151 ～ 1157
15GuivarchA, etal.ThepleitropicefectsinducedbytherolCgenein
transgenicplantsarecausedbyexpressionrestrictedtoprotophloem
andcompanioncels.TransgenicRes, 1996, 5:3～ 11
HairyRootInductionofIsatisIndigoticaFort.and
PlantletRegeneration
WangHong1, 2 , WangXiaohui3 , WangYanhong3 , LiXiaokun1, 2
(1PharmacySchool, WenzhouMedicalCollege, Wenzhou325035, Zhejiang;2KeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicine
ResearchinSouthernZhejiang, Wenzhou325035, Zhejiang;3EngineeringResearchCenterofBioreactorandPharmaceutical
DevelopmentoftheMinistryofEducation, JilinAgriculturalUniversity, Changchun130118, Jilin, China)
Abstract　HairyrootclonesofIsatisindigoticaFort.transformedwithAgrobacteriumrhizogenestrainsA4and
R1000 wereestablished.A4 hadhigherroot-inducingcapabilitythanR1000.Thepercentagerootinductionby
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作物杂志　Crops2008.5
干旱胁迫下外源冠菌素对玉米幼苗
生长和内源激素含量的影响＊
汪宝卿　李召虎　段留生　翟志席
　　摘　要　采用 PEG-6000模拟干旱研究植物生
长调节物质冠菌素 (COR)在干旱条件下对玉米幼
苗生长及内源激素系统的影响 ,结果表明:干旱处理
8d,与 PEG处理相比 , COR+PEG处理显著提高玉
米幼苗的株高 、根长 、根条数和根冠比;在正常情况
下 , COR能诱导茉莉酸甲酯(MeJA)的增加;干旱条
件下 COR处理的幼苗叶片和根中 ABA和 MeJA的
同时显著升高;COR处理的玉米幼苗叶片和根中
GA3含量在干旱第 2天和第 3天与 MeJA含量同时
显著增加;干旱胁迫第 2天 , COR处理中的 IAA和
ZR含量在叶片同时降低 ,而在根中则同时升高 ,至
干旱第 3天 ,其 ZR含量在叶中降低 ,而在根中则增
加 。初步认为 ,干旱胁迫下 ,冠菌素可通过调节玉米
幼苗体内的激素系统平衡以诱导其形态改变 ,并增
强其抵抗逆境的能力 。
关键词　干旱;冠菌素;玉米;激素
干旱胁迫常常影响植物的生长发育 ,造成作物
作者简介:汪宝卿 ,博士 ,主要研究方向为作物激素抗逆生理 ,山东省
农业科学院作物研究所 , 250100,山东济南
李召虎 ,段留生 ,翟志席 ,中国农业大学作物化学控制研究中心
＊基金项目:国家高技术 研究发展 计划 (863 计 划)项目
(2003AA241170)
收稿日期:2008-04-29;修回日期:2008-08-25
严重减产 。全球干旱 、半干旱地区约占土地总面积
的 36%,占耕地面积的 43%。我国的干旱 、半干旱
区主要分布在华北 、西北 、内蒙古和青藏高原等地
区 ,其面积约占全国土地面积的 1 /2。干旱对农作
物造成的损失在所有的非生物胁迫中居首位 ,仅次
于生物胁迫病虫害。因此 ,作物抗旱和水分高效利
用问题一直是我国农业科研的热点。
植物激素是植物细胞内部接受特定环境信息的
诱导而形成的代谢产物 。植 物内 源激素 虽然 是微 量
的 , 却 是调 控植 物生 长发 育和 逆境 的重 要信 号物 质 。
外施 植物 激素 可作 为调 控植 物抗 旱能力 的重 要途 径
之一 。许 多植 物生 长调 节物 质均 能调节 植物 抵御 干
旱的 能 力 , 如 脱落 酸 、多 胺 、茉 莉 酸 、水杨 酸 、油 菜 素
内脂 和甜 菜碱 等 [ 1 ～ 6] 。
　　冠 菌 素 (Coronatine, COR)是 丁 香 假 单 胞 菌 属
(Pseudomonassyingae)的 代 谢 产 物 , 与 茉 莉 酸 (Jas-
monicacid, JA)都有 环五 烷结 构 ,两 者的 许多 生理 功
能类 似 [ 7 ～ 10] , COR生 物 活 性 极 高 , 是 JA的 100 ～
10 000倍 [ 11] 。JA可 增强 大 麦 和苹 果 幼苗 抗 渗透 胁
迫能 力 [ 3, 12] 。闫芝 芬等 [ 13] 报 道 , COR可提 高 高粱 幼
苗的 耐水 分胁 迫 能 力 。但 COR调 节 干 旱 胁 迫 应 答
的机 制尚 不清 楚 。本试 验主 要研 究干旱 胁迫 条件 下
COR对玉 米幼 苗生长 和内 源激 素含 量的 影响 。
A4 was72.5% andaveragerootnumberpercotyledonwasover27.BothIAAandlighthadsignificantefectson
root-inducingefeciency.Forexample, thepercentageofrootinductioncouldbeenhancedwithMSmediumsupple-
mentedwithIAAof0.5mg/Landnorootoccurredwithoutlight.ThepresenceoftherolBandrolCgenesinthe
hairyrootswasconfirmedbyPCRanalysis.ThepositiveresultobtainedintheamplicationoftherolBandrolCin
hairyrootscouldbeatributedtosuccessfultransformationratherthantoresidualAgrobacterium.Thesehairyroots
grewwelonMSagarmediumorliquidmediumwithoutgrowthregulatorforoveroneyear.Fourhairyrootclones,
namelyTRA1 , TRA2, TRA3andTRA4, wereestablished.Theygrewvigorouslyandproducednumerouslateralbran-
ches.Twentyonebudsfrom30 rootsegmentcultureswereobtaineddirectlyfromhairyrootsaftersubculturingon
mediumlackinggrowthregulatorfor90 days.6-BAhadsignificantefectonbuddiferentiationandthustheopti-
mizedmediumforbuddiferentiationwasMS+NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L.Thebudswererootedonrootin-
ductionmediumsupplementedwithNAAanddevelopedintoregeneratedplants.
Keywords　AutotetraploidIsatisindigotica;Hairyroot;Plantletregeneration
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