全 文 ：中国农业科学 2011,44(3):439-446
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.03.001

收稿日期：2010-06-19；接受日期：2010-09-19
基金项目：国家转基因专项“高产转基因小麦新品种选育”（2008ZX08002-003）、中央高校基本科研业务费专项（QN2009070）、西北农林科技大学
青年学术骨干支持计划项目
联系方式：唐如春，E-mail：ruchuntang@163.com。通信作者范三红，Tel/Fax：029-87092262；E-mail：sanhong.fan@gmail.com



圆锥小麦 ramosa2 的克隆及其重组蛋白的
DNA 结合特性分析
唐如春 1,杨宇衡 1,范三红 1,2,郭蔼光 1,2
(1 西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 712100；2 陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌 712100)

摘要：【目的】从四倍体圆锥小麦中克隆 ramosa2(TtRa2)，分析其序列特征、组织表达特异性和体外活性，
为阐明 ramosa2 与麦类作物穗形态建成关系奠定基础。【方法】利用半定量 RT-PCR 分析 ramosa2 在不同组织中的
表达水平，将其重组到 pET-21a-MBP 载体并在 T7 Express 菌株中诱导表达。利用 Amylose 亲和层析柱纯化重组蛋
白，通过凝胶阻滞试验对其 DNA 特异结合能力进行鉴定。【结果】TtRA2 含有 LOB 和 RA2 结构域，属于Ⅰ类 LBD 蛋
白家族成员。TtRa2 在幼穗中高丰度表达，而在根、茎、叶、种子中未检测到表达。融合的 TtRA2 主要以可溶性
形式存在，其表达量占总蛋白的 68.6%。重组 TtRA2 可与包含核心序列“GCGGCG”的 DNA 探针特异性结合，两者
形成的复合体的解离常数约为 10 nmol·L-1。【结论】TtRa2 参与圆锥小麦穗形态建成，其编码产物具备 RA2-like
转录因子的典型特征，具有类似拟南芥 LOB 的 DNA 结合特性。
关键词：圆锥小麦；ramosa2；原核表达；LOB 结构域；凝胶迁移阻滞分析

Cloning of Triticum turgidum L. ramosa2 and DNA Binding
Activity Assay of the Recombinant Protein
TANG Ru-chun1, YANG Yu-heng１, FAN San-hong1,2, GUO Ai-guang1,2
(1College of Life Sciences, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi; 2Shaanxi Key Laboratory of
Molecular Biology for Agriculture, Yangling 712100, Shaanxi)

Abstract：【Objective】 The ramosa2 gene (TtRa2) was cloned from tetraploid Tritium turgidum L., and the sequence features,
tissue-specific expression pattern and in vitro activity was analyzed, thus providing a foundation for investigating relationship
between ramosa2 and spike architecture of Triticeae crops. 【Method】 Expression profiles of TtRa2 in different tissues were assayed
via RT-PCR. TtRa2 was recombined into the vector pET-21a-MBP, and recombinant protein was expressed in E.coli strain T7
Express. MBP fusion protein was purified by amylose affinity chromatography, and its specific DNA binding activity was identified
by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). 【Result】TtRA2 contains one LOB domain and one RA2 domain，and it belongs to
ClassⅠLBD protein family. TtRa2 was highly expressed in spike, while in root, stem, leaf and seed, its transcripts were not detected.
Fused TtRA2 mainly existed as soluble form and the percentage of fusion protein was up to 68.6% of total protein. The purified
recombinant protein could bind with the DNA probe specifically，which contains the core sequence “GCGGCG”. 【Conclusion】
TtRa2 involves in the spike morphogenesis process of Triticum turgidum L.. It encodes a typical RA2-like transcription factor, which
has similar specific DNA binding ability with LOB of Arabidopsis thaliana.
Key words: Triticum turgidum; ramosa2 gene; prokaryotic expression; LOB domain; electrophoretic mobility shift assay

440 中 国 农 业 科 学 44 卷
0 引言
【研究意义】禾本科粮食作物小麦、水稻、玉米
等的穗部形态结构直接影响它们的产量。研究禾本科
植物穗形态建成分子机制不仅是一个重要的理论问
题，而且对作物品种改良具有非常重要的指导意义。
【前人研究进展】2005 至 2006 年 Erik 等[1]、Esteban
等[2]和Namiko等[3]分别利用图位克隆技术分离到控制
玉米花序分枝的关键基因 ramosa1（Ra1）、ramosa2
（Ra2）和 ramosa3（Ra3），并提出了控制玉米花序
形态建成的 ramosa 通路。Ra1 编码一包含 C2H2锌指
结构的转录因子，Ra2 编码一包含亮氨酸拉链结构的
LOB（lateral organ boundaries）家族转录因子，Ra3
编码 6-磷酸海藻糖酶（trehalose-PPase，TPP），其中
Ra3 和 Ra2 可调控 Ra1 的表达，Ra1 和 Ra2 为转录因
子通过转录调控实现功能，Ra3 可能通过糖信号转导
实现功能，三者共同决定了小穗对分生组织（spikelet
pair meristem，SPM）的命运。Ra2 非常保守，其控制
玉米、水稻、小麦等禾本科植物花序的发育[4]。【本
研究切入点】有报道显示，普通小麦和圆锥小麦也存
在穗分枝突变，其表型类似于玉米 ramosa 突变[5]。但
麦类作物的穗分枝与玉米穗分枝的不同之处是玉米穗
分枝严重影响结实性能，而麦类作物穗分枝在不影响
结实性能的基础上能显著增加小穗数和单穗籽粒数，
因而具有更好的应用潜力。麦类作物中是否存在
ramosa-like 基因？是否存在类似于玉米中的 ramosa
调控通路？麦类作物的穗分枝现象是否由 ramosa-like
基因的突变引起？目前尚未见报道。【拟解决的关键
问题】本研究拟从圆锥小麦（Triticum turgidum L.，
2n=4X=28，AABB）基因组中克隆 ramosa2（TtRa2），
建立高效的原核表达和纯化系统，并分析 TtRA2 对包
含 6 个核心碱基“GCGGCG”的 DNA 探针的特异结
合能力，为进一步研究麦类作物穗部形态发生的系统
进化过程及其分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
供试圆锥小麦品种为甘 A631，播种于西北农林科
技大学生命科学学院实验田，分别选取幼根、茎、幼
叶、幼穗、种子为试验材料。
1.2 主要试剂
E.coli 菌株 Turbo、T7 Express 和原核表达载体
pET-21a-MBP 由陕西省农业分子生物学重点实验室
保存；2×Phusion（GC）Master Mix、LongAmp Taq 2×
Master Mix、EcoRⅠ、Hind Ⅲ、T4 DNA 连接酶、2-Log
DNA Ladder、Prestained Protein Marker、Amylose Resin、
M-MuLV 反转录酶购自 NEB 公司；AxyPrep PCR Clean
Up Kit 购自 AxyGen 公司；引物合成、DNA 序列测序
由华大基因（北京）完成，其余试剂均为国产分析纯。
1.3 DNA 与 RNA 的提取
DNA 提取参照 Murray 等[6]的 CTAB 法，RNA 提
取参照 TaKaRa 公司 RNAiso Plus 使用手册，每 25 µg
提取的总 RNA 中加入 5 U DNaseⅠ，37℃水浴 30 min
以去除样品中的基因组 DNA 污染。
1.4 TtRa2 的克隆及组织特异性分析
根据 Esteban 等[2]的报道，将玉米 RA2 氨基酸序
列在小麦及近缘种 EST 数据库中进行搜索，以搜索到
的 EST 序列为依据，用 Primer Premier 5.0 软件设计麦
类 Ra2 编码区特异扩增引物，Ra2-P1(上游)：
5′-GGAATTCATGGCGTCCCCGTCGAGCAC-3′（下
划线为 EcoRⅠ位点，方框内为起始密码子)，Ra2-P2
（下游）：5′-CCCAAGCTTCTACATGCTGCTGTCTC
CTCCTTC-3′(下划线为 Hind Ⅲ位点，方框内为终止
密码子)，并设计内参 β-Actin 引物用于 TtRA2 组织特
异性分析，Actin-P1（上游）：5′-GACCTCACGGATAA
TCTAATG-3′，Actin-P2（下游）：5′-ACCATCAGG
CATCTCATAG-3′。
20 µL PCR 扩增体系含模板 DNA100 ng·µL-1、0.1
µmol·L-1 Ra2-P1/Ra2-P2、10 µL 2×Phusion（GC）
Master Mix、1.6 µL DMSO、4 µL 1 mol·L-1甜菜碱和
2.6 µL dd H2O。扩增程序为 94℃ 4 min；94℃ 30 s，
62℃ 30 s，72℃ 40 s，30 个循环；72℃ 10 min。PCR
产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离检测。cDNA 第一链合
成参照 NEB 公司反转录酶 M-MLV 使用手册。20 µL
RT-PCR 扩增体系为 10 µL LongAmp Taq 2×Master
Mix、cDNA 第一链 1 µL、0.1 µmol·L-1 Ra2-P1/Ra2-P2
（或 Actin-P1/Actin-P2）和 8 µL dd H2O。TtRa2 的
RT-PCR 扩增程序为 94℃ 4 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，
72℃ 40 s，25 个循环；72℃ 10 min。β-Actin 的 RT-PCR
扩增程序与 TtRa2 类似，不同处是退火变为 55℃ 30 s。
1.5 重组表达载体的构建与鉴定
用 DNA 凝胶回收试剂盒将目的片段回收纯化，
再用 EcoRⅠ和 Hind Ⅲ双酶切，回收目的片段插入用
同样条件酶切的 pET-21a-MBP 载体相连接，转化
E.coli 菌株，挑取阳性克隆进行 PCR 及酶切鉴定、测
序。pET-21a-MBP 载体由 pET-21a 载体改造而来，在
3 期 唐如春等：圆锥小麦 ramosa2 的克隆及其重组蛋白的 DNA 结合特性分析 441
其 NdeⅠ和 EcoRⅠ位点间插入了麦芽糖结合蛋白
（maltose binding protein，MBP）编码区序列。
1.6 TtRA2 诱导表达及亲和纯化
将鉴定正确的重组质粒导入表达菌株 T7 Express
中，挑取阳性克隆进行诱导表达。首先在含有 50
µg·mL-1 氨苄青霉素的 LB 液体培养基中 37℃、220
r/min 振荡培养至对数生长期，然后加入 IPTG（终浓
度为 0.5 mmol·L-1）继续培养 5 h。10 000 g 离心 5 min
收集菌体，5 mL 菌液沉淀用 1 mL 裂解缓冲液（10
mmol·L-1 Tris-HCl，50 mmol·L-1 NaCl，1 mmol·L-1
EDTA，pH 7.2）重悬，超声破碎，10 000 g 4℃离心
20 min。将上清载入 Amylose 亲和层析柱，用 5 倍柱
体积的低盐缓冲液（10 mmol·L-1 Tris-HCl，50 mmol·L-1
NaCl，1 mmol·L-1 EDTA，pH7.2）和 10 倍柱体积高盐
缓冲液（10 mmol·L-1 Tris-HCl，500 mmol·L-1 NaCl，1
mmol·L-1 EDTA，pH7.2）洗脱杂蛋白，用 2 倍柱体积
含 0.5%麦芽糖的低盐缓冲液进行洗脱，最终获得重组
TtRA2。使用 12% SDS-PAGE 检测融合蛋白的表达情
况及亲和纯化效果；使用 BandScan 5.0 软件分析目的
蛋白的相对含量。
1.7 凝胶迁移阻滞试验
根据 Aman 等[7]的报道，拟南芥 LBD 蛋白家族中
的 LOB 结构域可以与包含 6 个核心碱基“GCGGCG”
的 DNA 探针发生特异结合。参考 Aman 等[7]研究结果
制备了 2 种 FAM（5-羧基荧光素）荧光标记的 DNA
探针，形成 2 种探针的寡核苷酸序列如下（南京金斯
瑞生物工程公司合成）：
P1-Wild-type Sense：5′FAM-GGGGGCACGTAA
ATAGCGGCGTAATATGCG-3′
P1-Wild-type Antisense：5′-GGGGGCGCATATTA
CGCCGCTATTTACGTG-3′
P2-Mutant-type Sense：5′FAM-GGGGGCACGTA
AATAGCAACGTAATATGCG-3′
P2-Mutant-type Antisense：5′-GGGGGCGCATAT
TACGTTGCTATTTACGTG-3′
方框中序列为 LOB 结构域结合的保守序列，下划线表
示保守序列中的突变碱基。其中，P1-Wild-type Sense
和P2-Mutant-type Sense 5′端采用FAM进行荧光标记。
分别将等分子数的 P1-Wild-type Sense和 P1-Wild-type
Antisense、P2-Mutant-type Sense 和 P2-Mutant-type
Antisense 混合，98℃加热 10 min，室温退火 25 min，
即获得荧光标记的 Wild-type 和 Mutant-type 探针。以
Mutant-type 探针为参照分析 TtRA2 对 Wild-type 探针
的特异性结合能力。20 µL 反应体系中包含不同浓度
的重组 TtRA2 蛋白、125 mmol·L-1 Tris-HCl pH 8.8、
250 mmol·L-1 KCl、5 mmol·L-1 DTT（二硫苏糖醇）、
10 mmol·L-1 EDTA、50 mmol·L-1 MgCl2、20% glycerol、
0.5% NP-40 、 200 mmol·L-1 BSA 和 20 nmol·L-1
Wild-type 或 Mutant-type 探针，4℃孵育 45 min。用
6% DNA retardation gel 进行分离，电极缓冲液为
0.5×TBE，置于冰上 100 V 恒压电泳 50 min。用
FUJIFILM FLA-7000 进行荧光扫描照相，激发光波长
为 473 nm，发射光波长为 520 nm。
2 结果
2.1 TtRa2 的克隆、表达及组织特异性分析
由于已知 ramosa2 均不包含内含子，因而，本研
究以圆锥小麦基因组 DNA 为模板，使用基于小麦及
近缘种EST序列设计的麦类Ra2编码区特异扩增引物
Ra2-P1 和 Ra2-P2 进行 PCR 扩增，获得约 800 bp 的特
异扩增片段（图 1）。经测序，得到长度为 774 bp 的
圆锥小麦 TtRa2 的完整编码区序列（ GenBank
accession：HM461855）。



M：2-Log DNA ladder；1：圆锥小麦 Ra2 扩增片段
M: 2-Log DNA ladder; 1: TtRa2 DNA fragment of Triticum turgidum L.

图 1 圆锥小麦 Ra2 的 PCR 扩增结果
Fig. 1 Amplification of Triticum turgidum L. Ra2 gene by
PCR

为进一步确定 TtRa2 的组织特异性表达，应用
RT-PCR 检测了 TtRa2 在圆锥小麦幼根、茎、幼叶、
幼穗、种子 5 种组织中的表达水平。结果表明，TtRa2
仅在幼穗中表达，在幼根、茎、幼叶、种子中均未检
测到表达（图 2）。该结果与 Esteban 等[2]报道的玉米
中 ramosa2 的表达模式一致。水稻中 ramosa2 对应基
442 中 国 农 业 科 学 44 卷

1：幼根；2：茎；3：幼叶；4：幼穗；5：种子
1: Roots at seedling stage; 2: Stem; 3: Leaves at seedling stage; 4: Young
spike; 5: Seed

图 2 圆锥小麦 Ra2 的组织特异性表达
Fig. 2 Tissue-specific expression of Triticum turgidum L. Ra2
gene

因为 Os01g0169400，该基因的表达谱还未有人专门研
究，但 UniGene 数据库给出的该基因对应的 EST 表达
谱结果显示，该基因仅在水稻穗部表达（http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/ESTProfileViewer.cgi?uglist
=Os.18280）。因而，TtRa2 和其它禾谷类植物 ramosa2
表达模式类似，参与植株的花序形态建成。
2.2 TtRA2 序列和结构域分析
TtRa2 编码 257 个氨基酸残基的目标蛋白，其理
论分子量为 26.5 kD，等电点为 6.57。序列同源搜索结
果显示，TtRA2 序列与已知禾本科植物 RA2 蛋白高度
相似，其与普通小麦（Triticum aestivum）、大麦
（Hordeum vulgare）、二穗短柄草（Brachpodium
distachyon）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）
和高粱（Sorghum bicolor）的 RA2 序列一致性分别为
97.3%、94.9%、81.3%、80.1%、77.0%和 75.2%。
图 3 为 7 种禾本科植物 RA2 的多序列比对结果。


方框区域依次为：C 区结构域、GAS 区结构域、亮氨酸拉链卷曲螺旋；下划线区域分别表示 LOB 结构域和 RA2 结构域；Tt：圆锥小麦，HM461855；
Ta：普通小麦，ABK79907；Hv：大麦，ABC54561；Bd：二穗短柄草，EU730901；Os：水稻，ABU44495；Zm：玉米，ACG41691；Sb：高粱，
ABC54562；黑色部分和深灰色部分分别表示相似性达 100%和 75%
The boxed regions represent Cysteine block, GAS block, Leucine zipper coiled coil respectively; The underlined regions represent LOB domain and RA2
domain respectively; Tt: Triticum turgidum L., HM461855; Ta: Triticum aestivum, ABK79907; Hv: Hordeum vulgare, ABC54561; Bd: Brachpodium
distachyon, EU730901; Os: Oryza sativa, ABU44495; Zm: Zea mays, ACG41691; Sb: Sorghum bicolor, ABC54562; Black and dark-gray boxes represent
100% and 75% similarity, respectively

图 3 RA2 多重序列比对及保守结构域分析
Fig. 3 Multiple sequence alignment and conserved domain analysis of RA2
3 期 唐如春等：圆锥小麦 ramosa2 的克隆及其重组蛋白的 DNA 结合特性分析 443
从比对结果可以看出禾本科 RA2 N-端和 C-端各包含
一个大的保守区，2 个保守区之间的序列在不同物种
间变异较大。N-端保守区为植物 LBD 家族蛋白共有
的 LOB 结构域，C-端保守区为 RA2 蛋白特有的 RA2
结构域。与其它 ClassⅠ LBD 蛋白类似，TtRA2 的
LOB 结构域（26—127 位氨基酸）包括典型 C-block、
GAS-block 和 Leu zipper coiled coil 模体。C-block 由
22 个氨基酸组成，包含有 4 个绝对保守的半胱氨酸
（Cys），而形成一个类似于锌指的 CX2CX6CX3C
模体，该类锌指结构可与 DNA 或蛋白质发生相互作
用[8-9]。GAS-block 跨度为 49 个氨基酸，以 FX2VH 序
列开始而以 DP(V/I)YG 序列结束[10]。LOB 结构域末
端还包含 30 个左右氨基酸残基的 Leu zipper coiled
coil 模体，该模体具有 LX6LX3LX6L 特征序列，形成
一个“卷曲螺旋”（coiled coil）形式的二级结构[11]，
该结构可能参与蛋白质二聚化过程。
根据序列相似搜索结果，从 13 种植物中选出与
TtRA2 最相似的蛋白序列，使用 MEGA 4.0 软件的 N-J
算法构建系统发育树，结果如图 4 所示。以番木瓜
（Carica papaya）AS2 为外类群，其余的 TtRA2 同源
序列分在 2 个大的进化枝中，包括普通小麦和圆锥小
麦的单子叶植物处于一个分枝，而双子叶植物处于另



▲为本研究克隆的基因 ▲ The gene cloned by this study
Tt：圆锥小麦 Triticum turgidum L.，HM461855；Ta：普通小麦 Triticum
aestivum，ABK79907；Hv：大麦 Hordeum vulgare，ABC54561；Os：
水稻 Oryza sativa，ABU44495；Zm：玉米 Zea mays，ACG41691；Sb：
高粱 Sorghum bicolor，ABC54562；Bd：二穗短柄草 Brachpodium
distachyon，EU730901； At：拟南芥 Arabidopsis thaliana，NP176739；
Pt：毛果杨 Populus trichocarpa，XP002298499；Rc：蓖麻 Ricinus
communis，XP002511341；Lj：百脉根 Lotus japonicus，AAX21349；
Gm：大豆 Glycine max，ACU23406；Cp：番木瓜 Carica papaya，
EF661026

图 4 TtRA2 及其同源蛋白的系统发育分析
Fig. 4 Phylogenetic tree of TtRA2 and its homologous protein
一进化枝中。
2.3 TtRa2 原核表达载体的构建
采用 EcoRⅠ和 Hind Ⅲ对扩增产物进行双酶切，
然后与 pET-21a-MBP 载体连接。重组质粒经 EcoRⅠ
和 Hind Ⅲ双酶切验证，电泳结果（图 5）显示，有一
条约 800 bp 的酶切插入片段，与预期结果一致。并进
一步测序鉴定，将正确的重组质粒命名为 pET-21a-
MBP-TtRA2。



M：2-log DNA ladder；1：pET-21a-MBP-TtRA2 双酶切产物
M: 2-log DNA ladder; 1: Double digestion fractions of pET-21a-MBP-
TtRA2

图 5 融合表达载体的酶切鉴定结果
Fig. 5 Confirmation of recombinant fusion expression vector
by double digestion

2.4 TtRA2 的表达纯化分析
图 6-A 为 IPTG 诱导时间优化结果的 SDS-PAGE
分析，与未经诱导的重组菌总蛋白相比，经诱导的重
组菌总蛋白均出现一条分子量约为 69 kD 的条带，该
条带大小和 MBP 与 TtRA2 融合蛋白的理论分子量一
致（TtRA2 分子量约为 26.5 kD，MBP 融合标签分子
量约为 42.4 kD）；诱导 4 h 后重组蛋白的表达量达到
最大且杂蛋白最少。图 6-B 为纯化过程中各样品的
SDS-PAGE 分析结果，可知重组蛋白主要以可溶性形
式存在，经 BandScan 5.0 软件分析结果显示纯化后的
重组 TtRA2 最高可达大肠杆菌总蛋白的 68.6%，该样
品将应用于后续的 DNA 结合试验。
2.5 TtRA2 与特异 DNA 序列结合能力的测定
使用凝胶迁移阻滞试验分析重组 TtRA2 对 DNA
序列特异结合能力的结果显示，TtRA2 仅与野生型标
记探针发生特异性结合（图 7）。通过凝胶迁移阻滞
测定 TtRA2 与“Wild-type”探针复合体解离常数（Kd）
的结果，约有半数标记探针发生阻滞（图 8），根据
444 中 国 农 业 科 学 44 卷


M：Prestained protein marker；1：未加 IPTG 的菌体总蛋白。（A）2—8 分别为 IPTG 诱导 1、2、3、4、5、6、7 h 后的菌体总蛋白。（B）2：菌体
总蛋白；3：可溶性蛋白；4：纯化的重组 TtRA2
M: Prestained protein marker; 1: Un-induced control. (A) 2-8: Total protein induced with IPTG after 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 hours respectively. (B) 2: Total protein; 3:
Soluble protein; 4: Purified recombinant TtRA2

图 6 SDS-PAGE 分析 TtRA2 的表达及纯化
Fig. 6 Analysis of expression and purification of TtRA2 by SDS-PAGE



1：野生型标记探针（W）；2：野生型标记探针（W）+TtRA2；3：突
变型标记探针（M）；4：突变型标记探针（M）+TtRA2
1: Wild-type probe (W); 2: Wild-type probe (W)+TtRA2; 3: Mutant-type
probe (M); 4: Mutant-type probe (M)+TtRA2

图7 凝胶迁移阻滞试验分析TtRA2与标记探针的特异结合
Fig. 7 Analysis of the specific binding of RA2 and probe by
EMSA

公式 Kd=([W0]-[P-W])([P0]-[P-W])/[P-W]，当[P-W]=
0.5[W0]时（其中[W0]和[P0]分别为探针和重组 TtRA2
的起始浓度；[P-W]为探针和 TtRA2 复合物的浓度），
Kd=[P0]-0.5[W0]，可得 TaRA2 与探针形成的复合体的
解离常数为 10 nmol·L-1。
3 讨论
LBD 基因家族是 2002 年新发现的高等植物特有
的一个新基因家族，该家族基因的典型特征是其编码
产物中均包含一个100个氨基酸左右的LOB保守结构
域。该结构域通常包括 3 个保守的区块 C-block、GAS-

W：野生型标记探针；1—8：加入 TtRA2 的量依次减半，分别为 320
nmol·L-1、160 nmol·L-1、80 nmol·L-1、40 nmol·L-1、20 nmol·L-1、10 nmol·L-1、
5 nmol·L-1、2.5 nmol·L-1，每一泳道包含等量“Wild-type”探针（20
nmol·L-1）
W: Wild-type probe; 1-8: Concentration of TtRA2 was halved step by step,
320 nmol·L-1, 160 nmol·L-1, 80 nmol·L-1, 40 nmol·L-1, 20 nmol·L-1, 10
nmol·L-1, 5 nmol·L-1, 2.5 nmol·L-1 was used respectively, the concentration
of wild-type probe (20 nmol·L-1) was equal in each lane

图 8 TtRA2 与探针复合体解离常数的测定
Fig. 8 Detecting the Kd of RA2／probe complex

block 和 Leu zipper coiled coil。C-block 中包含 4 个保
守的半胱氨酸残基，可形成类锌指结构参与 DNA 的
特异结合；Leu zipper coiled coil 区段包含保守的 4 个
亮氨酸残基，可能参与蛋白质的二聚化过程；
GAS-block 也非常保守，其功能目前仍未知。根据 LOB
结构域序列的相似性可将 LBD 蛋白家族分为 2 类：
ClassⅠ和 ClassⅡ，2 类最大的区别在于是否包含 Leu
zipper 区段[10]。本研究克隆的 TtRa2 编码产物属于典
型的 LBD 家族 ClassⅠ成员。LBD 蛋白家族除了 LOB
结构以外的其它部分具有较大的变异，一个物种通常
3 期 唐如春等：圆锥小麦 ramosa2 的克隆及其重组蛋白的 DNA 结合特性分析 445
含有多个 LBD 家族成员，如拟南芥中包含有 43 个
LBD 家族成员，目前研究显示 LBD 家族 ClassⅠ成员
基因主要参与植物的发育，而 ClassⅡ成员中 LBD37、
LBD38、LBD39 这 3 个基因参与拟南芥花青素合成及
氮素调控[12]。TtRA2 除了包含 LOB 结构域外，还包
含 RA2 蛋白特有的 RA2 结构域，该结构域的具体功
能目前尚不清楚，其可能参与与其它转录因子的相互
作用。
LBD 基因家族在高等植物中的功能目前尚不完
全清楚，几个研究较为清楚的实例显示，该类基因参
与了侧生器官原基的启动、侧生器官的形态建成以及
侧生器官与茎尖分生组织之间边界的建立，并与茎尖
分生组织中特异表达的部分基因或基因家族间存在相
互作用的关系[13]。LBD 基因通常在侧生器官中表达，
尤其是部分 LBD 基因在侧生器官的基部表达。如拟南
芥的 ARL1 控制不定根的形成[14]；LBD6/AS2 控制叶片
背腹轴的极性，而且下调侧生器官中 KNOX 转录因
子的表达[15-18]；LBD36 调节拟南芥花瓣近端-远端的
发育[19]；LBD16 和 LBD29 是生长素依赖性基因，其
控制拟南芥侧根的形成[20]；LBD18 和 LBD30 控制拟
南芥导管的分化，而且 LBD30 是拟南芥胚发育所必
需的[21-22]。水稻中 DH1 控制颖片的发育[23]。
麦类作物 LBD 基因家族的研究报道甚少。闫晓华
等[24]从普通小麦中同源克隆了 Ra2，但并未对其进行
深入研究。本研究克隆的圆锥小麦 Ra2 与普通小麦
Ra2 高度同源，蛋白序列一致性为 97.3%。Ma 等[25]
克隆了小麦 LBD 基因家族 TaAS2，并将其转入野生型
拟南芥，发现拟南芥转基因植株矮小，子叶较狭长，
叶片的延展受到限制。TtRA2 和 TaAS2 虽然均包含
LOB 结构域，但其在进化中分属不同的进化枝。如图
4 所示，TaRA2 和 TtRA2 与玉米 RA2 同处于一个进
化枝，因而 TaRA2 和 TtRA2 可能与玉米 RA2 具有类
似功能，影响穗部形态的发育。普通小麦和圆锥小麦
种均存在穗分枝突变体，这些突变是否由 Ra2 突变导
致目前仍不清楚，还有待通过遗传、反向遗传等方法
进行更深入的研究。
4 结论
从圆锥小麦中克隆到 ramosa2 （登录号：
HM461855），该基因编码 257 个氨基酸残基的Ⅰ类
LBD 蛋白家族成员。利用半定量 RT-PCR 分析其在不
同组织中的表达水平 TtRa2 在幼穗中高度表达，而在
根、茎、叶、种子中未检测到表达。建立了 TtRa2 的
高效原核表达纯化体系，并获得具有功能的重组
TtRA2。重组 TtRA2 可与核心序列为“GCGGCG”的
DNA 探针特异结合，其与 DNA 探针形成的复合体的
解离常数为 10 nmol·L-1。

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（责任编辑 李 莉）