全 文 ：中国农学通报 2011,27(13):126-129
Chinese Agricultural Science Bulletin
基金项目：重大新药创制课题“中药材种子种苗和种植（养殖）标准平台”（2009ZX09308-002）；科技基础性工作专项“云南及周边地区农业生物资源
资源调查”（2006FY110707）。
第一作者简介：郑娜，女，1986年出生，硕士，主要从事药用植物分子生物学研究。通信地址：100094北京海淀区马连洼北路151号中国医学科学院
药用植物研究所科研楼108室，Tel：010-62812675，E-mail：zhengna08@163.com。
通讯作者：李先恩，男，1964年出生，北京人，研究员，博士，主要从事药用植物遗传发育与资源保护利用研究。通信地址：100094北京海淀区马连洼
北路151号中国医学科学院药用植物研究所科研楼107室，Tel：010-62810019，E-mail：xeli@implad.ac.cn；秦民坚，男，1962年出生，江苏人，博士生导
师，博士，研究方向：药用植物资源与质量评价，Tel：025-86185130，Email：minjianqin@163.com。
收稿日期：2010-11-15，修回日期：2011-05-06。
高质量的滇重楼胚总RNA的提取方法研究及LD_PCR检测
郑 娜 1，祁建军 2，孙 鹏 2，秦民坚 1，李先恩 2
（1中国药科大学中药学院，南京 222100；2中国医学科学院/中国协和医科大学/药用植物研究所，北京 100094）
摘 要：探讨一种有效提取滇重楼胚总RNA方法。以滇重楼的胚为试验材料，将常规的SDS提取植物总
RNA的方法做了改进：在RNA提取缓冲液中加入SDS的步骤上进行了调整，结合异丙醇和醋酸钠室温
沉淀能更有效的去除多糖；醋酸-醋酸钠的缓冲体系维持提取液较低 pH值，有效抑制RNA酶活性；将
SDS的浓度提高到5%，并结合酸酚/氯仿抽提去除蛋白质污染，首次建立了一种简单有效的从滇重楼胚
中提取总RNA的方法。该方法所提RNA的A260/A230均大于2.0，A260/A280的值为1.8~2.0，电泳条带清晰，
RNA完整性好。利用该方法提取的滇重楼幼胚总RNA具有很高的纯度和质量，可以满足后续LD-PCR
及文库构建等分子生物学研究。
关键词：滇重楼；多糖；蛋白；总RNA；提取
中图分类号：Q75 文献标志码：A 论文编号：2010-3297
An Efficient Method for Total RNA Extraction and LD_PCR Detection
of Paris polyphylla var. yunnanensis
Zheng Na1, Qi Jianjun2, Sun Peng2, Qin Minjian1, Li Xianen2
(1School of TCM, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009;
2Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences,
Peking Union Medical College, Beijing 100094)
Abstract: The aim was to extract RNA from Paris polyphylla var. yunnanensis and lay a foundation for
studying the formation mechanism of Paris polyphylla var. yunnanensis. By modifying the method
recommended by SDS/phenol for extracting total RNA from plant tissue rich in polysaccharidic and protein
compounds, a simple and convenient method for extraction of total RNA from the embryo of Paris polyphylla
var. yunnanensis containing abundant polysaccharides and protein was established. In RNA extraction buffer
added to the steps of SDS was adjusted, combined with isopropanhol and sodium acetate at room temperature
for more effective removal of precipitated polysaccharide, high concentrated SDS integrated with acid phenol/
chloroform extraction were used to eliminate proteins; acetic acid-sodium acetate extraction buffer system to
maintain a lower pH, inhibit the activity of RNA enzyme. The A260/A230 value of RNA extracted with imp roved
method was all over 2.0 and the values of A260/A280 were between 1.8 and 2.0. The electrophoresis bands were
cleared on agarosegel and integrity of RNA was good. The results showed that RNA obtained from the embryo
of Paris polyphylla var. yunnanensis with this method had high purity and quality and could be used in
molecular biological research, as LD-PCR and cDNA-library construction.
Key words: Paris polyphylla var. yunnanensis; polysaccharide; protein; total RNA; extraction
郑 娜等：高质量的滇重楼胚总RNA的提取方法研究及LD_PCR检测
0 引言
在药用植物开展分子生物学研究时，首先面临的
困难就是一些组织器官的RNA提取困难，RNA的纯
度和完整性直接影响 RT-PCR、cDNA文库的构建和
RACE等试验[1]。分子生物学研究后续工作的进展及
成效在很大程度上决定于 RNA的质量，所以提高
RNA的纯度并且经济快捷的获得足够量的RNA就显
得至关重要。目前针对幼嫩胚的RNA提取已有一些
报道[2-5]，但是目前还没有关于滇重楼胚的RNA的提取
的报道。本试验对常规的SDS-酚法进行了改进，改良
后的方法对于提取滇重楼胚的总RNA具有良好的提
取效果。产物经琼脂糖凝胶电泳和 LD-PCR检测分
析，所提取的RNA的完整性和纯度较高，满足建库要
求，为进行滇重楼的分子生物学实验奠定了良好的基
础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
滇 重 楼 [Paris polyphylla var. yunnanensis
(Franch.) Hand.-Mazz]系延龄草科重楼属多年生草本，
种子由云南白药集团中药材优质种源繁育有限责任公
司。种子经低温沙藏处理 30天后，形成具有完整子
叶、胚轴和胚根的种子，取胚根突破种皮的重楼种子用
自来水清洗干净，吸水纸擦干水分，再用解剖刀小心剖
取幼胚，锡箔纸包好后迅速液氮冷冻放入-80℃冰箱贮
存待用。
1.2 提取RNA的方法
1.2.1 改良SDS-酚法 操作步骤：（1）取滇重楼幼嫩的
胚 0.1 g，加液氮迅速研磨成粉末，转入盛有 900 µL提
取液[2 mol/L NaAc（pH 4.1）、20% HAc（V/V）水饱和
酚、（pH 4.3）氯仿=3:2:1:4:2]的 1.5 mL离心管中，涡旋
震荡混匀，室温放置10 min。（2）加入300 µL 5% SDS，
混匀，室温静置 5 min后于 4℃下 12000 r/min下离心
15 min，将上清小心的转移到新的离心管中。（3）加入
等体积的酚 -氯仿（2:1，v/v）剧烈震荡混匀于 4℃下
12000 r/min离心 10 min，小心吸取上清并转移到新的
离心管中。（4）加入等体积的氯仿剧烈震荡混匀于4℃
下12000 r/min离心10 min，小心吸取上清并转移到新
的离心管中。（5）加入1/10体积的NaAc（3 mol/L）混匀
再加入等体积的异丙醇，常温放置 30 min，4℃下
12000 r/min离心 15 min，弃去上清。（6）沉淀用 75%乙
醇洗涤 2次，在超净工作台上吹干后溶于DEPC水溶
液中保存。
1.2.2 异硫氰酸胍法（1）取滇重楼幼嫩的胚 0.1 g，加
液氮迅速研磨成粉末，转入盛有1 mL异硫氰酸胍裂解
液[4 mol/L异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠，0.5%十
二烷基肌氨酸]的1.5 mL离心管中涡旋震荡混匀，再加
入 200 µL 水饱和酚，室温放置 10 min，于 4℃下
12000 r/min下离心10 min。（2）将上清小心的转移到新
的离心管中，加入200 µL氯仿，盖紧离心管，用手剧烈
摇荡离心管15 s，室温放置3min后于4℃下12000 r/min
下离心10 min。（3）小心吸取上清并转移到新的离心管
中，加入等体积的异丙醇和 1/10 体积的 NaAc
（3 mol/L），常温放置 30 min，4℃下 12000 r/min离心
10 min，弃去上清。（4）沉淀用75%乙醇洗涤两次，在超
净工作台上吹干后溶于DEPC水溶液中保存[6]。
1.2.3 Trizol法（1）取滇重楼幼嫩的胚0.1 g，加液氮迅
速研磨成粉末，转入盛有1 mL Trizol液的离心管中，涡
旋震荡混匀，室温放置10 min，于4℃下12000 r/min下
离心 10 min。（2）将上清小心的转移到新的离心管中，
加入 200 µL氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管
15 s，室温放置 3 min后于 4℃下 12000 r/min下离心
10 min。（3）小心吸取上清并转移到新的离心管中，加
入等体积的异丙醇和 1/10体积的 NaAc，常温放置
30 min，4℃下 12000 r/min离心 10 min，弃去上清。（4）
沉淀用 75%乙醇洗涤 2次，在超净工作台上吹干后溶
于DEPC水溶液中保存[7]。
1.2.4 SDS-酚法（1）取滇重楼幼嫩的胚 0.1 g，加液氮
研磨成粉末，转入盛有600 µL提取缓冲液 [0.5% SDS、
0.02 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.005mol/L EDTA]的
1.5 mL离心管中涡旋混匀，再加入 400 µL水饱和酚，
200 µL氯仿，剧烈混匀，室温下放置5 min。（2）于4℃下
12000 r/min离心 10 min，将上清液小心的转移到另一
支新离心管中。（3）加入等体积异丙醇，混匀后放置
10 min，然后 4℃下 12000 r/min离心 15 min，弃去上
清。（4）沉淀用 75%乙醇洗涤 2次，7500 r/min离心
5 min，室温干燥后溶于DEPC水溶液中保存[8]。
1.3 RNA纯度和完整性检测
紫外分光光度计测定所提RNA样品的A260/A280和
A260/A230值。采用1.2%的琼脂糖凝胶电泳，紫外成像系
统下观察总RNA的谱带，检测总RNA的完整性。
1.4 SMART cDNA的合成及文库构建和序列测定
试 验 步 骤 按 照 Clontech SMART PCR cDNA
Synthesis合成试剂盒（Takara）说明书进行。主要步
骤：第 1链合成：0.5 µg总RNA在 cDNA合成引物和
SMARTⅡ寡聚核苷酸引物存在下，于 72℃温育 2 min
后，冰上骤冷2 min，在总体积为10 µL的反应体系中，
加入 5×第１链反应缓冲液 2 µL，DTT 0.2 µL，dNTP
1.8 µL，PowerScript MMLV反转录酶，42℃温育 1 h合
成第 1链 cDNA；第 2链合成：取 2 µL第 1链反应混合
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物，加入 10 µL 10×Advantage PCR buffer、2 µL Smart
PCR引物、2 µL dNTP、2 µL 50×混合物和 84 µL H2O，
于 100 µL的反应体系中进行 14个循环：95℃ 1 min，
95℃ 15 s，65℃ 30 s，68℃ 6 min，反应在 Biometra
Tgradient PCR仪上进行，反应完毕后取 5 µL于 1.2%
的琼脂凝胶上进行电泳分析。
按照陈士林等[9]的方法建立重楼胚cDNA文库，随
即挑选 96个克隆在 3730测序仪（ABI）上进行测序。
测序得到的数据经去除载体等处理得到EST序列，用
BLASTX程序将EST序列与NCBI的非冗余蛋白质数
据库（nr）进行比对，未匹配序列再用BLASTN与NCBI
的非冗余数据库（nt）比对。
2 结果与分析
2.1 4种提取方法的比较
异硫氰酸胍法（方法2）、Trizol法（方法3）和SDS-
酚法（方法 4）是 3种应用较普遍的植物RNA提取方
法，本研究通过对 3种提取方法进行比较，在方法 4
（SDS-酚法）的基础上，建立了重楼种子RNA提取方
法（方法1）。方法1相对于方法4，主要做了3个改进：
一是提取液最初不加SDS，在样品放入提取液中反应
一段时间后再加SDS，目的是为了防止SDS溶解大量的
多糖，与加入的酚、氯仿等有机试剂形成凝胶状微粒分
散于缓冲液中，最终通过异丙醇和RNA共沉淀下来[10]；
二是为了提高得率，将 SDS的浓度提高了 10倍升至
5%，并且能很好地抑制RNA酶的活性；三是在沉淀
RNA的步骤中，利用高盐结合异丙醇沉淀RNA，盐离
子的正电荷中和了RNA带负电荷的磷酸集团，使核酸
更易沉淀，并大大降低了多糖的残留增加了RNA的得
率；所以方法 1相对方法 4在提取RNA的得率上和纯
度上都有了很大的提高。
方法2和方法3相对于方法4不同的只是裂解液的
成分，在提取步骤上没有很大差异，都是采用酚-氯仿
一步抽提结合异丙醇沉淀。
2.2 总RNA的质量比较
采用常规的方法 4提取胚时，由于SDS的浓度很
低，并且没有用缓冲盐体系维持较低的pH值，没有很
好地抑制RNA酶的活性，电泳结果显示，几乎看不到
28s和18s rRNA的带型（图1）RNA出现严重降解。分
光光度检测显示，该样品的A260/A280大于 2.2，A260/A230
小于2.0（表1）。
方法 1提取的 RNA电泳检测显示，28s、18s、5s
rRNA条带明显，清晰，不拖尾，而且28s条带的亮度约
为 18s的 2倍，无DNA等杂质污染。分光光度仪检测
A值表明（表 1），提取的 RNAA260/A280位于 1.8~2.0之
间，A260/A230值大于 2.0，说明RNA质量良好，没有被污
染。
方法 2和方法 3提取的总RNA 28s、18s带型清晰
无弥散，完整性好，加样孔干净，无蛋白质和其他杂质
污染，但RNA均有轻微的降解，并且方法 3有明显的
DNA污染，得率较方法1低（具体数据见表1）。
凝胶电泳图泳道 1~4分别为方法 1、方法 2、方法
3、方法4、M：DNA marker。
2.3 cDNA文库的建立及序列测定
滇重楼种子提取的总RNA反转录结果显示（图2），
双链cDNA片段呈弥散状态，大小主要集中在0.5~2 kb，
cDNA比较完整的，符合分子生物学和后续实验要求。
M 1 2 3 4
28S
18S
5S
图1 4种方法提取总RNA的检测
No.
1
2
3
4
A260/A280
1.919
1.801
1.940
2.452
A260/A230
2.063
0.670
0.420
1.520
RNA/(μg/g)
325.8
118.8
108.5
210.3
表1 4种方法提取总RNA紫外分光光度计检测结果
M 1 2 3
4000 bp
2000 bp
750 bp
500 bp
泳道1~3：滇重楼胚RNA的RT-PCR；泳道M：DL4000 marker
图2 滇重楼胚mRNA的反转录检测
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郑 娜等：高质量的滇重楼胚总RNA的提取方法研究及LD_PCR检测
随机挑选的96个克隆，经过5′端测序、去除载体
序列后，共得到 84 条高质量的 EST 序列，通过
BLASTX和BLASTN搜索比对，总共74个EST获得了
基因注释，其中仅有 10个EST在BLAST中没有得到
注释。图3为BLAST分析的初步结果。
3 结论与讨论
针对不同植物和植物不同组织器官的特性，研究最
优的核酸提取方法是植物分子生物学研究的最基本最
重要的基础。滇重楼具有较长的种子休眠休眠特性，从
分子水平探究其休眠的原因具有很高的应用价值。
滇重楼种子在经过层积打破形态和生理两重休眠
后，形成了较完整的胚，但这时候的种子中，胚只占约
10%，90%多为营养组织胚乳，并且这时的胚生长仍很
缓慢。本研究根据滇重楼种子的这些特点，通过几种
方法比较和改进，认为本研究确定的改良 SDS-酚法
（方法 1）为提取滇重楼胚的最优方法，按此方法提取
的的总RNA完整性比较好、纯度高。
本研究所用的新方法，提取液最初不加SDS，在样
品放入提取液中反应一段时间后再加SDS，减少多糖
在提取液中的溶解度；异丙醇结合高盐溶液替代纯粹
的异丙醇，可以大大降低多糖残留，可以得到高质量的
RNA。SDS是一种强烈的去垢剂，对细胞的破坏及对
蛋白的变性凝聚有很强的效果[11]。在本次的提取过程
中提高提取液中SDS的浓度，调整SDS的加入顺序，
并用缓冲盐体系维持提取液较低的pH值，增加氯仿的
抽提次数，高盐结合异丙醇沉淀RNA这些改进有利于
抑制RNase酶的活性，提高RNA的纯度和得率。得到
的RNA经过反转录和 cDNA文库构件建及序列测定
证明非常可靠。
控制裂解液和样品的比例是去除蛋白质、多糖杂
质的重要手段。本研究确定的每次提取的样品量为
0.1 g，提取反应在1.5 mL离心管中即可完成。控制反
应的体积主要是避免提取液溶解过多的蛋白等杂质。
用常规方法提取重楼胚RNA，提取缓冲液中溶解了大
量的多糖，当加入酚、氯仿等有机试剂后，多糖形成凝
胶状微粒分散于缓冲液中，最终通过异丙醇和RNA共
沉淀下来，因此用传统的方法对于本材料提不出高质
量的RNA。并且多糖可以抑制许多酶的活性[12]，无法
用于后续的分子实验。该提取方法能有效的降低滇重
楼胚中提取的总RNA多糖和蛋白的残留，可为富含多
糖和蛋白的其他材料总RNA的提取提供借鉴。
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16.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
BLASTX BLASTN NO MATCH
图3 BLAST分析结果
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