全 文 ：麦类作物学报　２０１６，３６（６）：６９９－７０７
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ　Ｃｒｏｐｓ　 ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－１０４１．２０１６．０６．０３
网络出版时间：２０１６－０５－３０
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３５９．Ｓ．２０１６０５３０．１５３５．００６．ｈｔｍｌ
基于ＲＮＡ－ｓｅｑ技术开发中间偃麦草基因组特异分子标记
收稿日期：２０１５－１２－１５　　　修回日期：２０１６－０１－２２
基金项目：山东省良种工程农业生物资源利用项目
第一作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｕｉｙｕ１１２３１１＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者：李兴锋（Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｘｆ＠ｓｄａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）
崔 雨１，鲍印广１，王洪刚１，２，李兴锋１，２
（１．山东农业大学作物生物学国家重点实验室，山东泰安２７１０１８；２．国家小麦改良中心泰安分中心，山东泰安２７１０１８）
摘　要：中间偃麦草（Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ，２ｎ＝６ｘ＝４２，ＪＪＪＳＪＳＳｔＳｔ或Ｅｅ　Ｅｅ　ＥｂＥｂＳｔＳｔ）是小麦遗传改
良的重要近缘植物，高抗锈病、白粉病等病害，耐逆性强。开发中间偃麦草基因组特异分子标记对于加快其优
异基因向普通小麦中的转移和利用具有重要意义。为建立快速准确开发中间偃麦草基因组特异分子标记的
新体系，首先利用ＲＮＡ－ｓｅｑ技术对中间偃麦草及其基因组供体二倍体长穗偃麦草、百萨偃麦草、假鹅观草的
苗期叶片进行转录组测序，然后根据测序结果设计ＥＳＴ－ＳＳＲ引物，对普通小麦、中间偃麦草及其基因组供体
材料进行ＤＮＡ扩增分析，从中筛选鉴定中间偃麦草基因组特异标记。结果表明，在所合成的２００对ＥＳＴ－
ＳＳＲ引物中，有７５对引物（３７．５％）在中间偃麦草、二倍体长穗偃麦草、百萨偃麦草和假鹅观草中具有特异扩
增，引物多态率较高。说明利用ＲＮＡ－ｓｅｑ技术开发ＥＳＴ－ＳＳＲ引物可以高效地用于筛选中间偃麦草基因组特
异分子标记，这一技术体系也可应用于其他作物及其近缘物种的特异分子标记开发。
关键词：中间偃麦草；小麦；ＲＮＡ－ｓｅｑ；特异分子标记
中图分类号：Ｓ５１２．１；Ｓ３３０　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１００９－１０４１（２０１６）０６－０６９９－０９
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ
Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ Ｕｓｉｎｇ　ＲＮＡ－ｓｅｑ　Ｄａｔａ
ＣＵＩ　Ｙｕ１，ＢＡＯ　Ｙｉｎｇｕａｎｇ１，ＷＡＮＧ　Ｈｏｎｇｇａｎｇ１，２，ＬＩ　Ｘｉｎｇｆｅｎｇ１，２
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉ’ａｎ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ　２７１０１８，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｔａｉ’ａｎ　Ｓｕｂ－ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｗｈｅａｔ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔａｉ’ａｎ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ　２７１０１８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ，ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｅｌａｔｉｖｅｓ　ｏｆ　ｃｏｍｍｏｎ　ｗｈｅａｔ，ｈａｓ　ｇｏｏｄ　ｔｏｌｅｒ－
ａｎｃｅ　ｔｏ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ｒｕｓｔ　ａｎｄ　ｐｏｗｄｅｒｙ　ｍｉｌｄｅｗ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｏｆ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｉｓ　ｖａｌｕａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆａｖｏｒａｂｌｅ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ
Ｔｈ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ．Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ａｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｉｎ
Ｔｈ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅ　ＲＮＡ－ｓｅｑ　ｄａｔａ　ｏｆ　Ｔｈ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍａｎｄ　ｉｔｓ　ｇｅｎｏｍｅ　ｄｏｎｏｒｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａ－
ｔｕｍ，Ｔｈ．ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍａｎｄ　Ｐｓｅｕｄｏｒｏｅｇｎｅｒｉａ　ｓｔｒｉｇｏｓａ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ．Ｔｗｏ
ｈｕｎｄｒｅｄ　ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ａｎｄ　ｖｅｒｉｆｉｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ＤＮＡ
ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ａｎｄ　７５（３７．５％）ｐｒｉｍｅｒｓ　ｈａｖｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｔｈ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ，Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ，Ｔｈ．
ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍａｎｄ　Ｐｓ．ｓｔｒｉｇｏｓａ　ｗｉｔｈ　ｇｏｏｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈａｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ＥＳＴ－ＳＳＲ
ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｒｏｍ　ＲＮＡ－ｓｅｑ　ｗｏｕｌｄ　ｂｅ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｉｎ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｏｆ　Ｔｈ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ，
ｗｈｉｃｈ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ　ｏｔｈｅｒ　ｃｒｏｐｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ；Ｗｈｅａｔ；ＲＮＡ－ｓｅｑ；Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ
　　中间偃麦草为多年生野生草本植物，是小麦
重要的近缘植物之一，其先后被划入小麦属
（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、冰草 属 （Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ）、偃 麦 草 属
（Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ）和类麦属（Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ）。尽管后来
颜 济和杨俊良［１］将其归入毛麦属（Ｔｒｉｃｈｏｐｙ－
ｒｕｍ），但是因为习惯的原因，中间偃麦草的名称
一直被延用下来。吉万全等［２］认为，中间偃麦草
染色体组有两个亲缘关系较近的染色体组，可能
分别来源于二倍体长穗偃麦草（ＥｅＥｅ）和百萨偃麦
草（ＥｂＥｂ），另外一个染色体组与其他两个染色体
组亲缘关系较远，其原始亲本供体可能是假鹅观
草（ＳｔＳｔ）。Ｃｈｅｎ等［３］认为中间偃麦草的染色体
组为ＪＪＪＳＪＳＳｔＳｔ，原始供体同样可能为二倍体长
穗偃麦草、百萨偃麦草和假鹅观草。目前，一般将
中间偃麦草染色体组构成表示为ＥｅＥｅＥｂＥｂＳｔＳｔ
或者ＪＪＪＳＪＳＳｔＳｔ［４］。
中间偃麦草对小麦的“三锈”、白粉病等病害
免疫，对小麦黑穗病、叶枯病、根腐病和条纹花叶
病等病害高抗，同时又是大麦黄矮病的良好抗源，
且易与小麦杂交，因此它已成为小麦遗传改良中
具有重要利用价值的种质资源。国内外不同研究
者利用普通小麦与中间偃麦草杂交，目前已创制
出一批八倍体、异附加系、异代换系及易位系等小
偃麦异染色体系，为小麦遗传改良提供了丰富的
种质材料，并成功将中间偃麦草的多种优异基因
转移到普通小麦遗传背景当中［５－７］。
小麦远缘杂交后代材料遗传组成的精确鉴定
是对其优异基因进行开发利用的前提，分子标记
的发展为小麦异源种质系的鉴定提供了新的辅助
选择技术，大大提高了小麦异染色体系特别是小
片段易位系的选择效率，为更好地转移和利用小
麦近缘物种有利基因提供了便利［８］。目前一些新
技术的应用加快了小麦近缘植物分子标记开发的
进程，如陈世强等［９］基于ＳＬＡＦ－ｓｅｑ技术开发出
一批长穗偃麦草染色体特异分子标记，代 程
等［１０］由冰草转录组ＥＳＴ序列开发了１３０个冰草
６Ｐ特异标记。基于高通量测序的ＲＮＡ－Ｓｅｑ可以
快速获得大量表达基因序列，高效应用于分子标
记开发、功能基因发掘、分子机理研究以及转录组
比较等方面［１１－１５］。鉴于目前开发或筛选的中间偃
麦草特异分子标记多态率较低、数量有限且定位
复杂，无法满足中间偃麦草研究的需求，因此大批
量开发中间偃麦草基因组（Ｅｅ、Ｅｂ、Ｓｔ）特异标记对
于丰富中间偃麦草标记数目、明确标记的基因组
来源、鉴定小偃麦遗传组成和分析偃麦草属内系
统关系等有重要意义。本研究利用ＲＮＡ－ｓｅｑ技
术获得中间偃麦草及其基因组供体二倍体长穗偃
麦草、百萨偃麦草和假鹅观草的转录组数据，拟开
发一批特异性强、稳定性高的中间偃麦草基因组
ＥＳＴ－ＳＳＲ标记，旨在为高效地开发中间偃麦草基
因组特异分子标记建立新的技术体系，为小偃麦
新种质的鉴定和中间偃麦草优异基因的进一步利
用奠定基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试材料包括中间偃麦草（Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ　ｉｎ－
ｔｅｒｍｅｄｉｕｍ，２ｎ ＝６ｘ ＝４２，ＥｅＥｅＥｂＥｂＳｔＳｔ 或
ＪＪＪＳＪＳＳｔＳｔ）、二倍体长穗偃麦草（Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ，
２ｎ＝２ｘ＝１４，ＥｅＥｅ）、假鹅观草（Ｐｓｅｕｄｏｒｏｅｇｎｅｒｉａ
ｓｔｒｉｇｏｓａ，２ｎ＝２ｘ＝１４，ＳｔＳｔ）、百萨偃麦草（Ｔｈ．
ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍ，２ｎ＝２ｘ＝１４，ＥｂＥｂ）及普通小麦
（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍＬ．，６ｎ＝２ｘ＝４２，ＡＡＢＢＤＤ）
中国春和烟农１５。其中，中间偃麦草引自原中国
科学院西北植物研究所，由李振声院士提供；假鹅
观草引自中国农业科学院作物科学研究所，由李
立会研究员提供；百萨偃麦草引自南京农业大学，
由亓增军教授提供；其余材料均由国家小麦改良
中心泰安分中心保存。
１．２　ＲＮＡ－ｓｅｑ及引物设计
所用的转录组数据均由中间偃麦草、二倍体
长穗偃麦草、假鹅观草和百萨偃麦草苗期叶片总
ＲＮＡ 经ＩｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑＴＭ２０００平台测序获得。
用Ｔｒｉｎｉｔｙ将测序序列进行拼接，以此作为后续
分析的参考序列，取每条基因中最长的转录本作
为ｕｎｉｇｅｎｅ。采用 ＭＩＳＡ（１．０版，默认参数）对
ｕｎｉｇｅｎｅ进行序列分析，搜索ＳＳＲ位点，所检测
ＳＳＲ位点包括单核苷酸重复、二核苷酸重复、三
核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复和六核
苷酸重复６类，判断标准为单核苷酸重复不少于
１０次，二核苷酸重复不少于６次，三核苷酸、四核
苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复不少于５次。找
出ＳＳＲ位点之后，采用Ｐｒｉｍｅｒ　３（２．３．５版）进行
ＳＳＲ引物批量设计，主要参数设置如下：产物大
小１００～２８０ｂｐ，引物长度１８～２７ｂｐ，ＧＣ含量
４０％～６５％，退火温度５７～６３℃，上下游引物Ｔｍ
值相差小于５℃。
·００７· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３６卷
１．３　引物筛选及ＰＣＲ扩增
根据中间偃麦草、二倍体长穗偃麦草、假鹅观
草和百萨偃麦草的ＥＳＴ－ＳＳＲ数据，每个材料选
取５０对引物，共计２００对，由上海生物工程公司
合成。扩 增 体 系 （１０ μＬ）：模 板 ＤＮＡ （３３
ｎｇ·μＬ
－１）３μＬ、２×Ｐｏｗｅｒ　Ｔａｑ　ＰＣＲ　ＭａｓｔｅｒＭｉｘ
５μＬ、引物（５μｍｏｌ·Ｌ
－１）２μＬ。扩增反应在
Ｔ１００ＴＭ（ＢＩＯ－ＲＡＤ，ＵＳＡ）ＰＣＲ仪上进行。扩增
程序：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５５℃
退火４０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃延伸
５ｍｉｎ。扩增产物经８％聚丙烯酰胺非变性凝胶
电泳分离，银染显影，拍照分析。
２　结果与分析
２．１　转录组测序及ＳＳＲ检测结果
高通量测序（ＩｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑＴＭ２０００）得到的
原始数据及利用 ＭＩＳＡ对ｕｎｉｇｅｎｅ进行ＳＳＲ检
测的结果见表１和图１。
表１　ＲＮＡ－ｓｅｑ的基本情况
Ｔａｂｌｅ　１　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＮＡ－ｓｅｑ
材料
Ｍａｔｅｒｉａｌ
测序量
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ａｍｏｕｎｔ／Ｇｂ
转录本
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
非冗余序列
Ｕｎｉｇｅｎｅ
ＳＳＲ检测数目
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ
ＳＳＲ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ＳＳＲ开发数目
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ
ＳＳＲ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
中间偃麦草　Ｔｈ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ　 ５．３６　 １３４　２３６　 ６２　６３６　 ６　０３３　 ３　９０６
二倍体长穗偃麦草　Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ　 ５．８８　 １１７　３０５　 ５８　０２９　 ５　３６７　 ３　３９２
百萨偃麦草　Ｔｈ．ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍ　 ５．７０　 １０６　２４５　 ５４　２９３　 ７　２３２　 ４　６８０
假鹅观草　Ｐｓ．ｓｔｒｉｇｏｓａ　 ６．９２　 １０４　５０９　 ５８　７２６　 ６　６４８　 ４　３１９
　　Ａ：中间偃麦草；Ｂ：二倍体长穗偃麦草；Ｃ：百萨偃麦草；Ｄ：假鹅观草；Ｍｏｎｏ：单核苷酸重复；Ｄｉ：二核苷酸重复；Ｔｒｉ：三核苷酸重复；
Ｔｅｔｒａ：四核苷酸重复；Ｐｅｎｔａ：五核苷酸重复；Ｈｅｘａ：六核苷酸重复
Ａ：Ｔｈ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ；Ｂ：Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ；Ｃ：Ｔｈ．ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍ；Ｄ：Ｐｓ．ｓｔｒｉｇｏｓａ；Ｍｏｎｏ：Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｒｅｐｅａｔ；Ｄｉ：Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｒｅｐｅａｔ；Ｔｒｉ：Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｒｅｐｅａｔ；Ｔｅｔｒａ：Ｔｅｔｒａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｒｅｐｅａｔ；Ｐｅｎｔａ：Ｐｅｎｔａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｒｅｐｅａｔ；Ｈｅｘａ：Ｈｅｘａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｒｅｐｅａｔ
图１　不同材料ＳＳＲ基元的分布
Ｆｉｇ．１　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＳＲ　ｍｏｔｉｆｓ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ
·１０７·第６期 崔 雨等：基于ＲＮＡ－ｓｅｑ技术开发中间偃麦草基因组特异分子标记
　　经检测，在中间偃麦草中搜索到６　０３３个
ＳＳＲ位点，分布在５　３９０条ｕｎｉｇｅｎｅ中，５６１条
ｕｎｉｇｅｎｅ含有１个以上ＳＳＲ，２５２条ｕｎｉｇｅｎｅ含有
复合ＳＳＲｓ，平均每６．５５ｋｂ有１个ＳＳＲ；在二倍
体长穗偃麦草中搜索到５　３６７个ＳＳＲ位点，分布
在４　８３１条ｕｎｉｇｅｎｅ中，４５６条ｕｎｉｇｅｎｅ含有１个
以上ＳＳＲ，１９４条ｕｎｉｇｅｎｅ含有复合ＳＳＲｓ，平均每
６．８２ｋｂ有１个ＳＳＲ；在百萨偃麦草中搜索到
７　２３２个ＳＳＲ位点，分布在６　２９９条ｕｎｉｇｅｎｅ中，
７９４条ｕｎｉｇｅｎｅ含有１个以上ＳＳＲ，３１７条ｕｎｉ－
ｇｅｎｅ含有复合 ＳＳＲｓ，平均每５．８３ｋｂ有１个
ＳＳＲ；在假鹅观草中搜索到６　６４８个ＳＳＲ位点，分
布在５　８３０条ｕｎｉｇｅｎｅ中，７０８条ｕｎｉｇｅｎｅ含有１
个以上ＳＳＲ，３０１条ｕｎｉｇｅｎｅ含有复合ＳＳＲｓ，平均
每６．０２ｋｂ有１个ＳＳＲ。
中间偃麦草、二倍体长穗偃麦草、百萨偃麦草
和假鹅观草等４个材料的ＳＳＲ发生频率（检出
ＳＳＲ的ｕｎｉｇｅｎｅ与总ｕｎｉｇｅｎｅ数目之比）分别为
８．６％、８．３％、１１．６％和９．９％，ＳＳＲ 出现频率
（ＳＳＲ数目与总ｕｎｉｇｅｎｅ数目之比）分别为９．６％、
９．３％、１３．３％和１１．３％，在本试验中百萨偃麦草
及假鹅观草的ＳＳＲ检测效率高于中间偃麦草和
长穗偃麦草。从ＳＳＲ基元类型上来看，三核苷酸
重复比例最大，占５０．０％左右；从ＳＳＲ基元的重
复次数上来看，重复５～８次的序列占比超过六
成，其中二倍体长穗偃麦草达到７４．０％。
２．２　ＥＳＴ－ＳＳＲ标记分析结果
在中间偃麦草、二倍体长穗偃麦草、假鹅观
草、百萨偃麦草的ＥＳＴ－ＳＳＲ数据中分别选取５０
对引物，共计合成２００对引物，然后利用中国春、
烟农１５、中间偃麦草、二倍体长穗偃麦草、百萨偃
麦草及假鹅观草对新开发的引物进行了多态性验
证。具体结果如下。
２．２．１　中间偃麦草ＥＳＴ－ＳＳＲ的扩增结果
利用５０对基于中间偃麦草ＲＮＡ－ｓｅｑ开发的
ＥＳＴ－ＳＳＲ引物对不同材料进行扩增，共有４５对
引物可以在不同材料中扩增出清晰的条带，其中，
ｔｈｉｎｔａ４７等２１对引物在中国春、烟农１５和中间
偃麦草中扩增出相同条带；ｔｈｉｎｔａ１９在二倍体长
穗偃麦草中扩增出特异条带；ｔｈｉｎｔａ４８等２３对引
物在中国春、烟农１５和中间偃麦草间有多态性扩
增，可以作为中间偃麦草的特异引物加以利用，在
这些特异引物中，ｔｈｉｎｔａ８等７对引物在中间偃麦
草和百萨偃麦草间扩增出相同条带，ｔｈｉｎｔａ５等６
对引物在中间偃麦草、二倍体长穗偃麦草、百萨偃
麦草、假鹅观草间扩增出不同条带。部分引物扩
增结果见图２。
２．２．２　二倍体长穗偃麦草 ＥＳＴ－ＳＳＲ 的扩增
结果
利用５０对基于二倍体长穗偃麦草ＲＮＡ－ｓｅｑ
开发的ＥＳＴ－ＳＳＲ引物对不同材料进行扩增，共
有４９对引物可以在不同材料中扩增出清晰的条
带，其中，ｔｈｅｌｏ１２等２９对引物在中国春、烟农１５
和二倍体长穗偃麦草中扩增出相同条带；ｔｈｅｌｏ５
和ｔｈｅｌｏ３７在百萨偃麦草中扩增出特异条带；
ｔｈｅｌｏ１１等１８对引物在中国春、烟农１５和二倍体
　　Ｍ：ＤＬ２０００；１：烟农１５；２：中国春；３：中间偃麦草；４：二倍体长穗偃麦草；５：百萨偃麦草；６；假鹅观草。图３～５同
Ｍ：ＤＬ２０００；１：Ｙａｎｎｏｎｇ　１５；２：Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ；３：Ｔｈ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ；４：Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ；５：Ｔｈ．ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍ；６：Ｐｓ．ｓｔｒｉｇｏｓａ．Ｔｈｅ
ｓａｍｅ　ｉｎ　ｆｉｇ．３－５
图２　部分中间偃麦草分子标记在普通小麦和中间偃麦草及其基因组供体中的扩增
Ｆｉｇ．２　Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍＬ．，Ｔｈ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍａｎｄ　ｉｔｓ　ｇｅｎｏｍｅ
ｄｏｎｏｒ　ｗｉｔｈ　ｐａｒｔ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｒｏｍＴｈ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ
·２０７· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３６卷
长穗偃麦草间有多态性扩增。部分引物扩增结果
见图３。
２．２．３　百萨偃麦草ＥＳＴ－ＳＳＲ的扩增结果
利用５０对基于百萨偃麦草ＲＮＡ－ｓｅｑ开发的
ＥＳＴ－ＳＳＲ引物对不同材料进行扩增，共有３１对
引物可以在不同材料中扩增出清晰的条带，其中，
ｔｈｂｅｓ４等１８对引物在中国春、烟农１５和百萨偃
麦草中扩增出相同条带；ｔｈｂｅｓ２３和ｔｈｂｅｓ４２引物
在二倍体长穗偃麦草和百萨偃麦草中扩增出相近
条带；ｔｈｂｅｓ３３在假鹅观草中扩增出特异条带；ｔｈ－
ｂｅｓ３７等１０对引物在中国春、烟农１５和百萨偃
麦草间有多态性扩增，在这些特异引物中，ｔｈ－
ｂｅｓ３９等３对引物在中间偃麦草和百萨偃麦草间
扩增出相同条带。部分引物扩增结果见图４。
图３　部分二倍体长穗偃麦草分子标记在普通小麦和中间偃麦草及其基因组供体中的扩增
Ｆｉｇ．３　Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍＬ．，Ｔｈ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍａｎｄ　ｉｔｓ　ｇｅｎｏｍｅ
ｄｏｎｏｒ　ｗｉｔｈ　ｐａｒｔ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｒｏｍＴｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ
２．２．４　假鹅观草ＥＳＴ－ＳＳＲ的扩增结果
利用５０对基于假鹅观草 ＲＮＡ－ｓｅｑ开发的
ＥＳＴ－ＳＳＲ引物对不同材料进行扩增，共有４０对
引物可以在不同材料中扩增出清晰的条带，其中，
ｐｓｓｔｒ２０等２０对引物在中国春、烟农１５和假鹅观
草中扩增出相同条带；其中，ｐｓｓｔｒ３９引物在百萨
偃麦草中扩增出特异条带；ｐｓｓｔｒ３２等１９对引物
在中国春、烟农１５和假鹅观草间有多态性扩增，
在这些特异引物中，ｐｓｓｔｒ１７和ｐｓｓｔｒ２３引物在中
间偃麦草和假鹅观草间扩增出相同条带，ｐｓｓｔｒ３８
和ｐｓｓｔｒ４４引物在百萨偃麦草中扩增出特异条
带。部分引物扩增情况见图５。
图４　部分百萨偃麦草分子标记在普通小麦和中间偃麦草及其基因组供体中的扩增
Ｆｉｇ．４　Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍＬ．，Ｔｈ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍａｎｄ　ｉｔｓ　ｇｅｎｏｍｅ　ｄｏｎｏｒ
ｗｉｔｈ　ｐａｒｔ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｒｏｍＴｈ．ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍ
·３０７·第６期 崔 雨等：基于ＲＮＡ－ｓｅｑ技术开发中间偃麦草基因组特异分子标记
图５　部分假鹅观草分子标记在普通小麦和中间偃麦草及其基因组供体中的扩增
Ｆｉｇ．５　Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍＬ．，Ｔｈ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍａｎｄ　ｉｔｓ　ｇｅｎｏｍｅ　ｄｏｎｏｒ
ｗｉｔｈ　ｐａｒｔ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｒｏｍＰｓ．ｓｔｒｉｇｏｓａ
　　通过引物多态性验证，并利用中间偃麦草、二
倍体长穗偃麦草、百萨偃麦草及假鹅观草对多态
性引物进行基因组归类统计，最终开发出的中间
偃麦草、二倍体长穗偃麦草、百萨偃麦草、假鹅观
草基因组特异分子标记数量依次为２８个、１９个、
２２个和２０个。标记序列见表２。
表２　各材料特异分子标记名称及序列
Ｔａｂｌｅ　２　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒ　ｎａｍｅ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
材料
Ｍａｔｅｒｉａｌｓ
分子标记
Ｍａｒｋｅｒ
引物序列（５′→３′）
Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′→３′）
分子标记
Ｍａｒｋｅｒ
引物序列（５′→３′）
Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′→３′）
中间偃麦草 ｔｈｉｎｔａ５ Ｆ：ＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴＣＧＧＡＧＴＧＧＣＡ　 ｔｈｉｎｔａ４０ Ｆ：ＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＧＧ
Ｔｈ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ Ｒ：ＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴＣＧＧＡＧＴＧＧＣＡ　 Ｒ：ＣＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴ
ｔｈｉｎｔａ８ Ｆ：ＴＣＡＴＣＣＴＣＧＡＡＧＡＣＧＴＧＣＴＧ　 ｔｈｉｎｔａ４１ Ｆ：ＡＡＡＴＧＧＴＧＡＧＧＧＣＧＴＴＧＧＡＴ
Ｒ：ＣＴＴＣＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＣＧＡＡＡＡ　 Ｒ：ＣＡＣＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＣ
ｔｈｉｎｔａ９ Ｆ：ＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＡＣＡＡＴＣＡＧＡＧ　 ｔｈｉｎｔａ４３ Ｆ：ＧＡＡＧＴＧＡＧＡＧＣＣＴＣＣＣＧＡＡＧ
Ｒ：ＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＡＧＡＡＡＡ　 Ｒ：ＴＣＣＣＣＴＡＣＣＴＡＣＣＡＣＣＴＣＡＧ
ｔｈｉｎｔａ１０ Ｆ：ＴＧＴＣＴＴＣＧＣＧＧＴＡＧＡＴＧＴＣＧ　 ｔｈｉｎｔａ４４ Ｆ：ＧＴＣＣＴＣＴＣＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣＣＴ
Ｒ：ＧＣＣＧＡＣＴＣＡＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣ　 Ｒ：ＧＡＡＣＣＴＣＧＣＧＡＴＡＴＧＣＴＣＣＡ
ｔｈｉｎｔａ１２ Ｆ：ＡＧＴＴＴＴＣＧＡＧＣＧＣＧＴＴＣＴＴＧ　 ｔｈｉｎｔａ４５ Ｆ：ＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣＧＧＡＡＣＴＣＴＴＴ
Ｒ：ＣＧＡＣＴＴＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣ　 Ｒ：ＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＴＡＧＴＡＣＡＡＧＣＧ
ｔｈｉｎｔａ１６ Ｆ：ＴＧＧＣＣＴＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡＣＡＣＡ　 ｔｈｉｎｔａ４６ Ｆ：ＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＧＣＴ
Ｒ：ＧＧＣＴＡＴＣＴＴＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧ　 Ｒ：ＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＴ
ｔｈｉｎｔａ１７ Ｆ：ＡＣＡＡＣＴＣＴＣＧＣＴＴＣＡＣＴＣＧＣ　 ｔｈｉｎｔａ４８ Ｆ：ＣＧＣＧＧＡＡＧＡＡＡＴＧＣＣＧＴＡＴＣ
Ｒ：ＣＴＧＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣ　 Ｒ：ＣＴＣＴＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＣＧＴＧＣＡ
ｔｈｉｎｔａ２４ Ｆ：ＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＴＣＴＧＣＡＴＴＴＴ　 ｔｈｉｎｔａ４９ Ｆ：ＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴ
Ｒ：ＣＧＴＧＴＴＧＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡＧＧＴ　 Ｒ：ＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＣＧＣ
ｔｈｉｎｔａ２６ Ｆ：ＣＧＣＴＣＴＴＣＴＣＧＧＡＴＧＡＧＴＣＣ　 ｔｈｉｎｔａ５０ Ｆ：ＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＣＧＣ
Ｒ：ＣＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＧ　 Ｒ：ＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＣＧＣ
ｔｈｉｎｔａ２８ Ｆ：ＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＡＧＡＧＴＴ　 ｔｈｂｅｓ３６ Ｆ：ＣＧＡＣＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＣＡＴＴＡＣ
Ｒ：ＡＣＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧＣＣＧＣＡＡＡＣ　 Ｒ：ＡＴＧＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡ
ｔｈｉｎｔａ３３ Ｆ：ＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＣＡＡＴＣＴＴＣＧ　 ｔｈｂｅｓ３９ Ｆ：ＧＡＧＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣ
Ｒ：ＴＣＧＴＴＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣＴＣＣＣＴ　 Ｒ：ＡＡＣＣＧＧＡＧＣＣＡＴＡＡＣＣＡＣＴＧ
ｔｈｉｎｔａ３５ Ｆ：ＴＴＴＣＧＡＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧ　 ｔｈｂｅｓ４０ Ｆ：ＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＧＣＡＧ
Ｒ：ＧＣＴＧＣＣＴＣＴＣＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣ　 Ｒ：ＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＴＣＴＴ
ｔｈｉｎｔａ３７ Ｆ：ＧＣＧＡＣＡＧＡＡＡＣＴＡＧＣＡＧＣＣＴ　 ｐｓｓｔｒ１７ Ｆ：ＧＣＡＡＴＴＴＣＣＧＴＴＧＧＣＣＡＧＡＧ
Ｒ：ＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡ　 Ｒ：ＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＡ
ｔｈｉｎｔａ３９ Ｆ：ＴＧＧＡＡＡＴＧＡＣＡＴＧＧＧＡＣＣＣＧ　 ｐｓｓｔｒ２３ Ｆ：ＴＣＧＣＡＧＣＧＧＴＡＧＴＴＧＴＴＣＴＴ
Ｒ：ＴＴＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＣＴＧＧＡＴＴＣ　 Ｒ：ＣＧＣＣＡＣＴＣＧＡＣＴＴＡＡＡＣＣＣＴ
·４０７· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３６卷
（续表２　Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ　ｔａｂｌｅ　２）
材料
Ｍａｔｅｒｉａｌｓ
分子标记
Ｍａｒｋｅｒ
引物序列（５′→３′）
Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′→３′）
分子标记
Ｍａｒｋｅｒ
引物序列（５′→３′）
Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′→３′）
二倍体长穗 ｔｈｅｌｏ１ Ｆ：ＣＧＣＡＡＣＴＣＡＣＡＡＧＴＧＡＴＧＣＣ　 ｔｈｅｌｏ２２ Ｆ：ＡＧＡＴＣＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＡＡＧＴ
偃麦草 Ｒ：ＡＡＣＡＣＧＡＴＡＡＡＧＧＣＡＧＧＣＣＡ　 Ｒ：ＣＣＧＡＴＧＣＴＣＴＣＡＣＣＡＣＧＴＡＡ
Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ　 ｔｈｅｌｏ３ Ｆ：ＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＧＡＣＣＴＴＧＣ　 ｔｈｅｌｏ２３ Ｆ：ＡＣＡＡＴＣＧＧＧＴＣＣＡＡＡＣＡＧＣＴ
Ｒ：ＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＣＧＣ　 Ｒ：ＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧ
ｔｈｅｌｏ６ Ｆ：ＣＡＣＧＴＧＡＧＡＴＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧ　 ｔｈｅｌｏ３４ Ｆ：ＧＣＣＣＡＡＣＴＡＧＴＧＣＡＣＴＣＡＧＧ
Ｒ：ＡＧＴＧＧＧＡＣＴＴＧＴＴＧＧＴＧＡＧＣ　 Ｒ：ＧＣＡＣＧＴＴＣＣＣＴＡＧＡＡＡＧＧＣＴ
ｔｈｅｌｏ７ Ｆ：ＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡ　 ｔｈｅｌｏ３９ Ｆ：ＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＧＣＴＣＴＧＡＡＡ
Ｒ：ＡＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＣＡＣＧＧＣＡＣＡ　 Ｒ：ＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡ
ｔｈｅｌｏ８ Ｆ：ＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＴＣＧＣＴ　 ｔｈｅｌｏ４１ Ｆ：ＣＣＴＣＴＣＣＣＧＡＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣ
Ｒ：ＧＣＡＡＡＧＧＡＴＡＧＡＧＧＧＧＧＣＡＴ　 Ｒ：ＧＴＧＡＴＣＡＣＣＴＣＧＴＴＧＴＴＧＣＧ
ｔｈｅｌｏ１０ Ｆ：ＣＣＴＣＣＣＡＴＴＣＴＴＧＡＡＣＧＣＣＴ　 ｔｈｅｌｏ４４ Ｆ：ＣＴＴＣＡＣＴＴＣＧＴＣＧＴＣＣＡＧＣＴ
Ｒ：ＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＧＣＧＣＡＴＧＣ　 Ｒ：ＣＧＡＧＧＡＧＣＧＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＡ
ｔｈｅｌｏ１１ Ｆ：ＣＣＡＴＧＡＴＴＧＴＣＣＧＣＣＴＡＣＧＡ　 ｔｈｅｌｏ４５ Ｆ：ＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣ
Ｒ：ＡＡＣＣＣＣＡＣＡＡＣＧＧＡＧＡＴＣＡＣ　 Ｒ：ＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＣＡＴＧＴＧＡＣＣＣ
ｔｈｅｌｏ１４ Ｆ：ＡＡＴＧＧＣＣＡＡＡＣＧＧＧＡＧＡＧＡＧ　 ｔｈｅｌｏ５０ Ｆ：ＴＴＴＧＡＧＴＣＴＴＧＧＧＴＣＡＧＧＧＣ
Ｒ：ＡＣＡＣＴＡＡＧＣＣＧＧＣＡＡＴＣＡＣＡ　 Ｒ：ＴＣＴＴＧＧＴＴＣＴＧＴＧＴＣＧＴＡＣＣＡ
ｔｈｅｌｏ１７ Ｆ：ＣＡＣＧＴＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＴＣＡ　 ｔｈｉｎｔａ１９ Ｆ：ＴＧＡＧＡＴＧＣＴＣＣＡＴＧＴＧＧＴＣＴ
Ｒ：ＡＧＴＴＧＴＣＴＧＧＣＡＧＧＡＴＧＧＴＣ　 Ｒ：ＧＣＧＴＧＧＴＣＡＡＣＴＴＧＣＡＧＡＡＧ
ｔｈｅｌｏ１８ Ｆ：ＡＴＣＣＴＣＧＣＣＴＣＴＧＴＣＴＧＣＴＡ
Ｒ：ＣＧＧＧＡＡＣＴＴＧＧＡＧＧＣＡＴＴＣＴ
百萨偃麦草 ｔｈｂｅｓ１７ Ｆ：ＡＧＧＣＣＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＴＡ　 ｔｈｉｎｔａ９ Ｆ：ＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＡＣＡＡＴＣＡＧＡＧ
Ｔｈ．ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍ Ｒ：ＴＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＣ　 Ｒ：ＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＡＧＡＡＡＡ
ｔｈｂｅｓ１９ Ｆ：ＧＧＧＣＡＡＴＣＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＧ　 ｔｈｉｎｔａ１６ Ｆ：ＴＧＧＣＣＴＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡＣＡＣＡ
Ｒ：ＣＧＣＡＡＡＧＧＴＴＴＴＴＣＡＣＴＣＧＧＴ　 Ｒ：ＧＧＣＴＡＴＣＴＴＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧ
ｔｈｂｅｓ２７ Ｆ：ＧＣＡＣＡＣＧＣＡＡＣＧＡＡＣＴＴＡＣＡ　 ｔｈｉｎｔａ４５ Ｆ：ＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣＧＧＡＡＣＴＣＴＴＴ
Ｒ：ＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＴＧＧＣＡＴＣＴＣＣＧ　 Ｒ：ＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＴＡＧＴＡＣＡＡＧＣＧ
ｔｈｂｅｓ３６ Ｆ：ＣＧＡＣＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＣＡＴＴＡＣ　 ｔｈｉｎｔａ４６ Ｆ：ＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＧＣＴ
Ｒ：ＡＴＧＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡ　 Ｒ：ＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＴ
ｔｈｂｅｓ３７ Ｆ：ＡＣＧＡＡＡＣＡＣＡＣＧＧＧＧＧＴＡＴＣ　 ｔｈｉｎｔａ４８ Ｆ：ＣＧＣＧＧＡＡＧＡＡＡＴＧＣＣＧＴＡＴＣ
Ｒ：ＴＧＣＴＡＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＡＡＴＣＧ　 Ｒ：ＣＴＣＴＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＣＧＴＧＣＡ
ｔｈｂｅｓ３８ Ｆ：ＣＧＴＡＴＣＣＣＡＣＧＣＧＣＴＴＴＧＴＡ　 ｔｈｉｎｔａ４９ Ｆ：ＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴ
Ｒ：ＧＣＴＣＡＴＧＣＧＡＣＡＣＡＡＡＴＣＣＡ　 Ｒ：ＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＣＧＣ
ｔｈｂｅｓ３９ Ｆ：ＧＡＧＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣ　 ｐｓｓｔｒ３８ Ｆ：ＧＡＣＧＧＣＡＡＧＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣ
Ｒ：ＡＡＣＣＧＧＡＧＣＣＡＴＡＡＣＣＡＣＴＧ　 Ｒ：ＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＧＴＣＡＴＣＴＣＣＣ
ｔｈｂｅｓ４０ Ｆ：ＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＧＣＡＧ　 ｐｓｓｔｒ３９ Ｆ：ＧＧＧＡＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＧＴＧＴＡＧ
Ｒ：ＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＴＣＴＴ　 Ｒ：ＧＧＣＴＣＴＴＧＴＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴ
ｔｈｂｅｓ４１ Ｆ：ＡＧＣＴＧＡＡＣＣＡＡＣＧＡＧＡＣＣＴＧ　 ｔｈｅｌｏ５ Ｆ：ＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＧＧＣＡＡＡＣＴＡＡ
Ｒ：ＴＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＣＣＡＣＡＴＴＡＴ　 Ｒ：ＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧ
ｔｈｂｅｓ４５ Ｆ：ＴＴＡＴＧＧＴＴＧＧＧＧＧＴＧＡＴＧＣＣ　 ｔｈｅｌｏ３７ Ｆ：ＧＣＴＧＧＴＣＣＡＴＴＧＧＴＴＴＧＣＴＧ
Ｒ：ＧＣＣＣＴＴＴＴＧＴＧＡＧＡＧＣＴＧＴＴ　 Ｒ：ＣＴＴＣＧＧＣＣＡＴＣＣＣＴＣＣＧＧ
ｔｈｉｎｔａ８ Ｆ：ＴＣＡＴＣＣＴＣＧＡＡＧＡＣＧＴＧＣＴＧ　 ｐｓｓｔｒ４４ Ｆ：ＣＧＧＣＴＴＣＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣＴ
Ｒ：ＣＴＴＣＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＣＧＡＡＡＡ　 Ｒ：ＴＣＡＴＧＣＣＡＧＴＴＧＴＧＡＧＧＧＡＣ
假鹅观草 ｐｓｓｔｒ２ Ｆ：ＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＡＡＴＣＧＣＡＧＣ　 ｐｓｓｔｒ２３ Ｆ：ＴＣＧＣＡＧＣＧＧＴＡＧＴＴＧＴＴＣＴＴ
Ｐｓ．ｓｔｒｉｇｏｓａ Ｒ：ＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＣＣＴＣＧＴＣＣＣＧ　 Ｒ：ＣＧＣＣＡＣＴＣＧＡＣＴＴＡＡＡＣＣＣＴ
ｐｓｓｔｒ４ Ｆ：ＧＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＧＴＴＧＧＴＧ　 ｐｓｓｔｒ２５ Ｆ：ＡＧＧＣＧＧＡＣＡＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡ
Ｒ：ＧＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＡＣＡＣＡ　 Ｒ：ＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＣ
ｐｓｓｔｒ６ Ｆ：ＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＣＧＴＴＣＣＧＴＴＣ　 ｐｓｓｔｒ２６ Ｆ：ＴＧＴＧＣＡＣＣＴＧＴＡＣＴＧＴＧＴＣＧ
Ｒ：ＡＧＧＣＣＴＴＣＴＴＧＴＣＧＡＡＧＴＣＧ　 Ｒ：ＴＡＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＣＣＧＣＧＡＡＧ
ｐｓｓｔｒ９ Ｆ：ＧＧＡＧＡＴＣＧＴＧＧＴＡＣＴＣＧＣＴＧ　 ｐｓｓｔｒ２９ Ｆ：ＡＡＣＧＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＣＡＴＡＣＡ
Ｒ：ＡＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＡＴＧ　 Ｒ：ＴＧＴＣＴＡＴＣＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＡ
ｐｓｓｔｒ１１ Ｆ：ＣＴＣＣＧＧＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＴ　 ｐｓｓｔｒ３２ Ｆ：ＡＧＧＡＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴ
Ｒ：ＴＧＡＡＣＣＴＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＧＧＴ　 Ｒ：ＣＣＴＣＡＣＡＡＧＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＴ
ｐｓｓｔｒ１３ Ｆ：ＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡ　 ｐｓｓｔｒ３８ Ｆ：ＧＡＣＧＧＣＡＡＧＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣ
Ｒ：ＣＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＣＣＴＡＣＡＡＣ　 Ｒ：ＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＧＴＣＡＴＣＴＣＣＣ
ｐｓｓｔｒ１６ Ｆ：ＣＴＣＣＴＣＣＴＡＡＣＡＡＣＡＧＧＧＣＧ　 ｐｓｓｔｒ４３ Ｆ：ＧＴＣＣＡＴＡＣＧＴＡＧＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡ
Ｒ：ＣＧＣＣＡＴＴＴＴＡＴＣＴＧＣＣＴＧＣＣ　 Ｒ：ＡＧＣＴＡＣＣＡＣＡＣＧＴＡＴＡＣＧＣＧ
ｐｓｓｔｒ１７ Ｆ：ＧＣＡＡＴＴＴＣＣＧＴＴＧＧＣＣＡＧＡＧ　 ｐｓｓｔｒ４４ Ｆ：ＣＧＧＣＴＴＣＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣＴ
Ｒ：ＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＡ　 Ｒ：ＴＣＡＴＧＣＣＡＧＴＴＧＴＧＡＧＧＧＡＣ
ｐｓｓｔｒ１９ Ｆ：ＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＧＣＴＣＴＣＴＴＣＡＣＡ　 ｐｓｓｔｒ４７ Ｆ：ＣＧＧＣＴＴＣＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣＴ
Ｒ：ＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＴＴＧＴＴＧＴＣＧ　 Ｒ：ＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＧＴＴＣＡ
ｐｓｓｔｒ２２ Ｆ：ＧＣＣＡＣＴＣＴＧＡＡＴＣＣＣＧＴＣＴＣ　 ｔｈｂｅｓ３３ Ｆ：ＴＡＣＣＡＣＣＧＣＣＣＡＧＣＡＡＡＴＡＧ
Ｒ：ＴＡＧＣＡＣＴＧＡＡＴＣＧＣＣＧＧＡＴＧ　 Ｒ：ＧＡＡＧＡＣＧＡＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＴＣ
·５０７·第６期 崔 雨等：基于ＲＮＡ－ｓｅｑ技术开发中间偃麦草基因组特异分子标记
３　讨 论
３．１　基于ＲＮＡ－ｓｅｑ开发中间偃麦草基因组特异
标记的特点
对同一物种ＥＳＴ序列进行ＳＳＲ搜索时，所
得结果可能不同，如小麦的 ＳＳＲ 出现频率为
３．２％［１６］与４．１％［１７］，这是由于不同软件在搜索
ＳＳＲ时所采取的算法及标准不同，搜索到的结果
存在差异；不同物种的ＳＳＲ出现频率也有很大差
异，如党参（１６．１％）［１８］较小麦高出几倍。本研究
中，中间偃麦草、二倍体长穗偃麦草、百萨偃麦草
和假鹅观草的 ＳＳＲ 出现频率（９．６％、９．３％、
１３．３％和１１．３％）相比其他禾本科植物，非常适
合大批量开发标记。
利用通过高通量测序获得的中间偃麦草及其
基因组供体材料转录组数据设计出的２００对引物
中，共７５对引物在中国春、烟农１５和中间偃麦
草、二倍体长穗偃麦草、百萨偃麦草、假鹅观草间
具有多态性扩增。仅计算由某材料转录组数据开
发的引物在该材料中的多态率，所开发引物在中
间偃麦草、二倍体长穗偃麦草、百萨偃麦草及假鹅
观草中的多态率分别达到 ４６．０％、３６．０％、
２０．０％和３８．０％，多态率远高于根据谷类作物的
共线性，利用小麦 Ｇ－ＳＳＲ 引物１　２５５对、ＥＳＴ－
ＳＳＲ引物３　０１２对、ＳＴＳ引物２９３对、ＲＡＰＤ引物
１　２００个 产 生 的 多 态 性 引 物 在 中 间 偃 麦 草
（７．６％）、二倍体长穗偃麦草（７．５％）、百萨偃麦草
（７．５％）及假鹅观草（５．９％）中的多态率（课题组
前期试验）。因此，基于ＲＮＡ－ｓｅｑ开发ＥＳＴ－ＳＳＲ
具有多态率高、特异性强的特点。有３５对引物在
中国春和中间偃麦草等材料中没有稳定的扩增产
物，这可能由于采用部分单核苷酸重复序列设计
引物、转录组ＥＳＴ拼接出现误差等原因导致。
设计引物采用的序列直接关系引物扩增多态
率，中间偃麦草等材料和小麦存在较近的亲缘关
系，序列有一定的相似性，这会降低特异标记的开
发效率，本研究中，４４．０％的引物在中国春、烟农
１５和中间偃麦草等材料间具有相同的扩增片段
也印证了这一点。下一步可通过中间偃麦草与小
麦ＥＳＴ序列比对，得到中间偃麦草的特异序列，
由此设计出的引物应该特异性更高、针对性更强，
同时这些特异序列对于偃麦草的分子遗传和进化
研究很有裨益。
３．２　中间偃麦草基因组特异标记的应用
利用７个中国春－百萨偃麦草染色体异附加
系可以将本研究开发的２２个百萨偃麦草特异标
记，分别定位于１Ｅｂ 到７Ｅｂ 染色体上，同样，可以
将本研究中开发的其他材料的特异分子标记定位
到相关的染色体上，这项工作尚在进行之中。下
一步希望通过开发大量的引物并验证更多新特异
分子标记，使其覆盖到Ｅｅ 基组、Ｅｂ 基组及Ｓｔ基
组每一条染色体上，建立Ｅｅ、Ｅｂ及Ｓｔ基组特异分
子标记体系。开发的中间偃麦草特异标记可以应
用于鉴定小麦－中间偃麦草小片段易位系或渐渗
系以及染色体物理作图中。
本研究中有１２２对引物（６１．０％）在中国春、
烟农１５上有稳定的扩增位点，因而也可以作为小
麦的分子标记，这进一步丰富了小麦的标记基础。
另外，在特异引物中，有１０对引物在中间偃麦草
和百萨偃麦草间扩增出相同特异条带，有２对引
物在中间偃麦草和假鹅观草间扩增出相同特异条
带；还有一些非特异引物在中间偃麦草与其基因
组供体间或在二倍体长穗偃麦草、百萨偃麦草、假
鹅观草间扩增出相同条带。说明中间偃麦草、二
倍体长穗偃麦草、百萨偃麦草、假鹅观草间有较高
的同源性，这对于研究偃麦草属内的物种亲缘关
系也有着一定帮助。
通过转录组测序和分子标记的验证，建立了
高效开发中间偃麦草特异标记的新方法，开发的
标记可应用于小偃麦后代材料遗传组成的鉴定，
加速中间偃麦草优异基因的转移与利用。
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ｐｌａｓｍ［Ｄ］．Ｔａｉ’ａｎ：Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１４．
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Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍｉｎ　ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ
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·７０７·第６期 崔 雨等：基于ＲＮＡ－ｓｅｑ技术开发中间偃麦草基因组特异分子标记