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超声耦合丙醇—硫酸铵双水相体系提取中华苦荬菜多酚工艺研究



全 文 :超声耦合丙醇—硫酸铵双水相体系提取
中华苦荬菜多酚工艺研究
石同同1,陈莹莹2,王颉1*,孙剑锋1,张玉芬1
(1.河北农业大学 食品科技学院,河北 保定 071000;2.河北农业大学 园艺学院,河北 保定 071000)
摘要:对50℃烘干的中华苦荬菜多酚进行了超声耦合丙醇-硫酸铵双水相系统提取工艺的研究,采用响
应面法优化A丙醇浓度、B超声时间和C料液比三个因素,分析并建立数学模型。结果表明:A丙醇浓
度、B超声时间、C料液比均对多酚得率达到极显著水平(P<0.01)。中华苦荬菜多酚提取的最佳方案
为丙醇浓度60%,超声时间30min,料液比1∶20,在此工艺条件下,中华苦荬菜多酚得率的预测值为
1.71%。所得回归方程为Y=1.71+0.12A+0.10B+0.052C+0.030AB+0.037AC+0.0130BC-
0.14A2-0.13B2-0.12C2。
关键词:中华苦荬菜;多酚;超声;双水相
中图分类号:TS264.2   文献标志码:A    doi:10.3969/j.issn.1000-9973.2014.04.011
文章编号:1000-9973(2014)04-0044-05
Study on Propanol-(NH4)2SO4Aqueous Two-phase System and
Ultrasonic Wave Co-extraction of Polyphenols from Ixeris chinensis
SHI Tong-tong1,CHEN Ying-ying2,WANG Jie1*,SUN Jian-feng1,ZHANG Yu-fen1
(1.Colege of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China;
2.Colege of Horticulture,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China)
Abstract:Study propanol-(NH4)2SO4aqueous two-phase system and ultrasonic wave co-extraction of
polyphenols from Ixeris chinensis compound on 50 ℃for drying,response surface methodology is
used to establish models for A:propanol concentration,B:processing time and C:material-liquid ra-
tio.The results show that A:propanol concentration,B:processing time and C:material-liquid ratio
have significant effects on extraction rate(P<0.01).The best condition is A:60%,B:30min and C:
1∶20,under such condition,the polyphenols is 1.71%.The regression equation is Y=1.71+0.12A
+0.10B+0.052C+0.030AB+0.037AC+0.0130BC-0.14A2-0.13B2-0.12C2.
Key words:Ixeris chinensis;polyphenols;ultrasonic extraction;two-phase system
    中 华 苦 荬 菜 [Ixeris chinensis (Thunb.ex
Thunb.)Nakai]为野生绿色蔬菜,是菊科苦苣属的一
年或两年生草本植物[1],中华苦荬菜含有丰富的营养
成分和生理活性物质,具有较高的营养价值和保健作
用,也是一种药食共用的植物[2]。中华苦荬菜药用历
史悠久,《神农本草经》、《本草纲目》等均有记载,具有
清热解毒、消肿排脓、凉血化痪、消食和胃、清肺止咳、
益肝利尿之功效[3],临床用于治疗急性痢疾、肠炎、痔
疮肿痛等症,药用价值高,中国民间自古作为药材应
用。中华苦荬菜在我国分布广泛,野生资源丰富,食用、
收稿日期:2013-10-10        *通讯作者
基金项目:国家自然科学基金 (31071580)
作者简介:石同同(1988-),男,河北石家庄人,硕士,主要从事农副产品加工利用及转化的研究。
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China Condiment
药用历史悠久,其化学成分及药理作用复杂[4,5]。
多酚类物质是一族在结构中含有酚的化合物,属于
植物的次生代谢产物[6,7],有研究报道,植物多酚具
有清除体内自由基、抗凝血、抗炎、防癌以及预防心
血管疾病等多种作用。中华苦荬菜中所含成分十
分复杂,常用提取多酚的方法有煎煮法、回流法、浸
渍法,这几种方法具有提取时间长、提取率低且多
酚等活性成分损失量大等缺点。超声提取法是近
几年新兴的一种提取方法,具有选择性高、提取时
间短、提取率高、消耗溶剂少等优点[8],超声提取法
是利用超声波的“空穴作用”来破坏植物细胞的结
构,从而使植物多酚溶出。双水相分配体系[9]因其
分离条件温和、生物亲和性好、反应过程可以以任
何比例工厂放大、易于与其他技术集成[10]等优点
广泛应用于天然产物提取的领域。醇-盐双相水体
系克服了传统双水相体系易乳化、成相所需的聚合
物成本高、后续处理复杂等不足,溶剂易回收。本
文以超声耦合丙醇-硫酸铵双水相体系[11]提取中华
苦荬菜中的多酚,利用响应面法对提取工艺进行优
化。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
中华苦荬菜 采自河北农业大学校园内,经河北
农业大学生命科技学院冯大岭教授鉴定。50℃条件
下烘干至恒重,粉碎后过40目筛,真空密封备用;没食
子酸;福林酚;正丙醇、碳酸钠 均为市售分析纯。
kq-500de型细胞超声破碎仪 昆山市超声仪器
有限公司;WFZ-UV-2800紫外-可见分光光度计 尤
尼科仪器有限公司;DL-101-2型电热鼓风干燥箱 天
津市中环实验电炉有限公司;TB-215D分析天平 德
国赛多利斯股份有限公司,感量为十万分之一。
1.2 中华苦荬菜处理方法
新鲜中华苦荬菜洗净,50℃条件下烘干至恒重,
粉碎后过40目筛,准确称取中华苦荬菜干粉0.500g,
放入一定质量的硫酸铵,放入10mL一定浓度的丙醇
溶液,超声一段时间,提取后5000r离心10min,离心
后静止分层,上清液用60%丙醇定容到100mL容量
瓶中,得到中华苦荬菜提取液,精密称取试验中抽滤后
的中华苦荬菜提取液1mL,分别加入0.5mL福林试
剂、2mL 10%碳酸钠溶液,定容至10mL,室温下反应
2h。在760nm处测定反应液的吸光度。
1.3 没食子酸标准曲线确定
采用Folin-ciocalteu法测定总多酚含量[12,13]。称
取25mg没食子酸,加入到25mL去离子水中,得到
1mg/mL的没食子酸溶液。吸取5mL 1mg/mL的
没食 子 酸 溶 液,定 容 至 50 mL 容 量 瓶 中,即 得
0.1mg/mL的没食子酸溶液,然后配制成0,20,40,
60,80,100μg/mL的没食子酸标液,分别标号0~6。
取不同标样没食子酸溶液1mL,分别加入0.5mL福
林试剂、2mL 10%碳酸钠溶液,定容至10mL,室温下
反应2h,以0号管为空白用紫外可见分光光度计测定
各溶液在760nm处的吸光度值,以吸光度(y)为纵坐
标,没食子酸浓度(x)为横坐标绘制标准曲线。
1.4 试验设计
1.4.1 丙醇-硫酸铵双水相体系的配制
分别配制浓度为30%,40%,50%,60%,70%的
丙醇溶液,分别取不同浓度的丙醇溶液各10mL,在不
同浓度的丙醇溶液中加入硫酸铵,利用硫酸铵的盐析
作用形成双水相体系。当形成稳定的双水相体系时,
称取所加入的硫酸铵的质量。结果表明:随着丙醇浓
度的增大,当形成稳定双水相体系时所需的硫酸铵用
量越小,见表1。
表1 10mL不同浓度丙醇形成双水相体系所需硫酸铵质量
丙醇浓度(V/V) 30% 40% 50% 60% 70%
硫酸铵质量(g) 1.91  1.60  1.33  1.05  0.81
  通过分析以上数据我们发现,在浓度范围为30%
~70%的丙醇溶液中,所加入的硫酸铵质量与水的体
积成正比,即每毫升水中大约加入0.27g硫酸铵即可
形成稳定的双水相体系。
1.4.2 单因素试验设计
新鲜中华苦荬菜洗净,50℃条件下烘干至恒重,
粉碎后过40目筛,准确称取中华苦荬菜干粉0.500g,
放入一定质量的硫酸铵,分别加入不同浓度的丙醇,按
照不同的提取时间、不同的料液比进行超声提取后
5000r离心10min,上清液用60%丙醇定容到10mL
容量瓶得到中华苦荬菜提取液,按照1.2测定提取液
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吸光度。以标准曲线法计算中华苦荬菜多酚得率,分
别确定最适的丙醇浓度、超声时间和料液比。
1.4.3 响应面试验及优选
根据丙醇浓度、超声时间和料液比三个单因素试
验所确定的水平范围,使用Design-Expert 7.1.3为辅
助手段设计响应面试验,选取Box-behnken模型,以
多酚得率为响应值,做三因素三水平共17个试验点
(5个中心点)的响应面分析试验。确定中华苦荬菜的
最佳的提取条件。
1.5 多酚得率的计算
根据标准曲线法将所测定的中华苦荬菜提取液的
吸光度带入回归方程计算多酚得率。首先将所测得的
吸光度带入回归曲线计算此时所测定反应液的多酚浓
度x(μg/mL),总得率z=x×100/(0.5×1000×
1000)。100为稀释倍数,0.5×1000×1000为称取中
华苦荬菜质量(μg)。
2 结果与分析
2.1 没食子酸标准曲线的绘制
根据没食子酸不同浓度标准液得到的吸光度,以
吸光度(y)为纵坐标,没食子酸浓度(x)为横坐标绘制
标准曲 线。结 果 表 明:在 没 食 子 酸 浓 度 在 0~
100μg/mL范围内线性关系良好。回归方程为y=
0.0112x+0.0265,R2=0.9957,见图1。
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0



0 50 100 150
没食子酸浓度(μg/mL)
吸光度
线性(吸光度)
y = 0.0112x + 0.0265
R2 = 0.9957
图1 没食子酸标准曲线
2.2 单因素试验
2.2.1 丙醇浓度对多酚得率的影响
精确称取中华苦荬菜粉末0.500g,在料液比
1∶20,超声提取时间30min条件下,分别加入浓
度为30%,40%,50%,60%,70%的丙醇溶液,按
照1.2方法进行测定,并计算多酚得率,试验结果
见图2。




( %

丙醇浓度(%)
2
1.5
1
0.5
0
30 40 50 60 70 80
多酚得率(%)
图2 丙醇浓度对多酚得率的影响
  由图2可知,随着丙醇浓度的增大,多酚得率逐渐
升高,当丙醇浓度为60%时,多酚的得率达到最大,总
得率为1.76%;随着丙醇浓度的继续增大,多酚得率
差异性不显著,主要原因可能是随着丙醇浓度的不断
增大,双水相体积中的丙醇相相对体积在逐渐增大,而
多酚类物质大多数易溶于有机相,随着丙醇相相对体
积的增大,导致多酚最大限度地溶出,如果再继续增大
丙醇相体积,多酚得率变化不明显。因此,选择最适宜
的丙醇提取浓度为50%,60%,70%。
2.2.2 超声时间对多酚得率的影响
精确称取中华苦荬菜粉末0.500g,在料液比
1∶20,丙醇浓度为60%的条件下,分别提取10,20,
30,40,50min,按照1.2方法进行测定,并计算多酚得
率,试验结果见图3。




( %

超声时间(min)
0 20 40 60
多酚得率(%)
2
1.5
1
0.5
0
图3 超声时间对多酚得率的影响
  由图3可知,随着超声提取时间的增加,多酚得率
逐渐升高,当超声提取30min时,多酚得率达到最大,
总得率为1.71%。当提取时间超过30min时,多酚
得率差异性不显著,这可能是超声提取时间过长,导致
中华苦荬菜细胞组织的破坏,使一些不溶性的杂质溢
出,从而阻止了多酚成分的溶出。因此,选择最适的超
声时间为20,30,40min。
2.2.3 料液比对多酚得率的影响
精确称取中华苦荬菜粉末0.500g,在丙醇浓度为
60%的条件下超声提取30min,分别考察料液比
1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30对中华苦荬菜多酚
得率的影响,试验结果见图4。
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( %

料液比
多酚得率(%)
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
1∶10 1∶15 1∶20 1∶25 1∶30
图4 料液比对多酚得率的影响
  由图4可知,随着料液比的逐渐增大,中华苦荬菜
多酚得率逐渐增大,当料液比为1∶20时,多酚得率达
到最大,为1.74%。当继续增大料液比,多酚的得率
差异性不显著。分析原因可能是在超声波的作用下,
中华苦荬菜中所含多酚类物质已经最大限度溶出,当
料液比进一步增大时,导致其他杂质进入浸提液,从而
阻止了多酚成分的溶出。因此,选择最适的料液比为
1∶15,1∶20,1∶25。
2.3 响应面法优化中华苦荬菜多酚提取工艺
根据Box-behnken中心组合试验设计原理,综
合单因素所得试验结果,选取丙醇浓度、超声时间
和料液比三个因素,采用三因素三水平的响应面分
析方法,因素水平设计见表2,响应面分析方案及结
果见表3。
表2 响应面试验因素水平表
  因素
水平
-1  0  1
A丙醇浓度(%) 50  60  70
B超声时间(min) 20  30  40
C料液比 1∶15  1∶20  1∶25
表3 响应面分析方案及结果
试验号 A  B  C 多酚得率(%)
1 -1 -1  0  1.26
2  1 -1  0  1.42
3 -1  1  0  1.41
4  1  1  0  1.69
5 -1  0 -1  1.32
6  1  0 -1  1.52
7 -1  0  1  1.30
8  1  0  1  1.65
9  0 -1 -1  1.29
10  0  1 -1  1.47
11  0 -1  1  1.42
续 表
试验号 A  B  C 多酚得率(%)
12  0  1  1  1.65
13  0  0  0  1.68
14  0  0  0  1.70
15  0  0  0  1.72
16  0  0  0  1.74
17  0  0  0  1.71
  应用 Design-Expert软件进行多元回归拟合分
析,得到中华苦荬菜多酚得率与各因素变量的模型
Y=1.71+0.12A+0.10B+0.052C+0.030AB+
0.037AC+0.0130BC-0.14A2-0.13B2-0.12C2。
运用软件对17个响应值进行回归分析得到方差
分析表,见表4,整体模型P<0.01,该二次方程模型达
到了极显著水平,并且失拟项不显著说明该方程对试
验拟合较好。
表4 方差分析表
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
模型 0.48  9  0.053  43.47 <0.0001**
A  0.12  1  0.12  100.60 <0.0001**
B  0.086  1  0.086  70.71 <0.0001**
C  0.022  1  0.022  18.11  0.0038**
AB  3.600×10-3  1  3.600×10-3  2.96  0.1292
AC  5.625×10-3  1  5.625×10-3  4.62  0.0687
BC  6.250×10-4  1  6.250×10-4  0.51  0.4970
A2  0.080  1  0.080  65.37 <0.0001**
B2  0.068  1  0.068  56.20  0.0001**
C2  0.066  1  0.066  54.02  0.0002**
残差 8.525×10-3  7  1.218×10-3
失拟 6.525×10-3  3  2.175×10-3  4.35  0.0947不显著
纯误差 2.000×10-3  4  5.000×10-4
总计 0.49  16
  由表4可知,A丙醇浓度、B超声时间、C料液比
均对多酚得率达到极显著水平(P<0.01),二次项A2,
B2,C2 对中华苦荬菜多酚得率曲面效应极显著,交叉
项对多酚得率的影响也较显著。
2.4 响应面曲面分析
根据回归方程做出响应面图,见图5~图7,考察
所拟合的响应面的形状,分析丙醇浓度、超声时间以及
料液比对中华苦荬菜多酚得率的影响。
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1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.00
0.50
0.00
-0.50
-1.00 -1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
A:丙醇浓度B:超声时间




图5 f(A,B)响应面立体图
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.00
0.50
0.00
-0.50
-1.00 -1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
A:丙醇浓度C:料液比




图6 f(A,C)响应面立体图
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.00
0.50
0.00
-0.50
-1.00 -1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
B:超声时间C:料液比




图7 f(B,C)响应面立体图
  由图5~图7可知,丙醇浓度、超声时间是影响多
酚得率的最主要因素,料液比对其得率的影响次之,三
者对其影响都达到极显著水平(P<0.01)。在模型浓
度的范围内选择出发点,按照模型使用快速上升法进
行优化,可得中华苦荬菜多酚提取的最佳方案为丙醇
浓度60%,超声时间30min,料液比1∶20,在此工艺
条件下,中华苦荬菜多酚得率的预测值为1.71%,与
理论值基本相符。
3 结论
采用超声波辅助提取技术对中华苦荬菜多酚进行
提取,通过单因素试验和Box-Behnken试验设计及响
应面分析对超声波提取工艺进行优化,得出较优工艺
条件为丙醇浓度60%,超声时间 60 min,料液比
1∶20,此时多酚得率可达1.72%。超声耦合双水相
体系较单纯的超声提取或者蒸馏提取方法方便快捷,
提取率高,易于工厂放大而且其提取条件温和,充分保
持了多酚的活性成分等不可比拟的优点,因此其具有
较好的发展前景。
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