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4′-去甲峨参内酯的化学合成及对HeLa宫颈癌细胞和MG-63骨肉瘤细胞体外增殖的抑制作用



全 文 :·现代医学研究· DOI:10.13463/ j.cnki.cczyy.2014.02.057
4′-去甲峨参内酯的化学合成及对HeLa宫颈癌细胞和
MG-63骨肉瘤细胞体外增殖的抑制作用
李永超 ,耿 耘* ,马保玉 ,宋 磊 ,郑 康 ,赵志龙 ,雷博婷 ,马超英
(西南交通大学生命科学与工程学院 ,成都 610031)
  摘要:目的 通过化学合成法制备 4′-去甲峨参内酯并探讨不同浓度 4′-去甲峨参内酯对宫颈癌细胞 HeLa
和骨肉瘤细胞MG-63增殖的抑制作用 。方法 采用 MTT 法检测不同浓度的 4′-去甲峨参内酯对宫颈癌细胞
HeLa和骨肉瘤细胞MG-63增殖的抑制作用。结果 4′-去甲峨参内酯对宫颈癌细胞 HeLa和骨肉瘤细胞 MG-63
的 IC50值分别为 35.58μg/mL和 57.89μg/mL。结论 4′-去甲峨参内酯对宫颈癌细胞HeLa和骨肉瘤细胞 MG-
63增殖具有明显的抑制作用 ,其机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。
  关键词:4′-去甲峨参内酯;化学合成;肿瘤细胞;增值抑制
  中图分类号:R273      文献标志码:A 文章编号:2095-6258(2014)02-0336-03
 [ 基金项目] 国家自然科学基金资助项目(81073036);中央高校基本科研业务费专项研究资助项目(SWJTU09ZT29)。
 [ 作者简介] 李永超(1988-), 男 ,硕士研究生。研究方向:中药复方及物质基础。
*[ 通信作者] 耿 耘 , 女 ,教授 , 硕士研究生导师 ,电话:13678044340 ,电子信箱:jxgy88@126.com。
Chemical Synthesis of 4′-demethyl-4-deoxypodophyllotoxin and its anti-tumor activity in
vitro proliferation of Hela cells and MG-63 osteosarcoma cells
LI Yongchao ,GENG Yun* ,MA Baoyu ,SONG Lei ,ZHENG Kang ,ZHAO Zhilong ,LEI Boting ,MA Chaoying
(School of life science and engineering ,Southwest Jiaotong University ,Chengdu 610031 ,China)
Abstract:Objective To prepare 4′-demethyl-4-deoxypodophyllotoxin by chemical synthesis and explore the anti-tumor ef-
fect of its different concentration on proliferation of Hela cells andMG-63 osteosarcoma cells.Methods The anti-tumor ac-
tivity of 4′-demethyl-4-deoxypodophyllotoxin in the HeLa cells and osteosarcoma cells MG-63 was tested by MTT assay.Re-
sults IC50 for the HeLa cells and osteosarcoma cells MG-63 are 35.58 μg/mL and 57.89 μg/mL.Conclusions 4′-
demethyl-4-deoxypodophyllotoxin has evident inhibition to HeLa cells and osteosarcoma cells MG-63.The mechanism may be
related to inducing apoptosis of tumor cells.
Key words:4′-demethyl-4-deoxypodophyllotoxin;chemical synthesis;cancer cells;inhibition
  宫颈癌和骨肉瘤是最常见的恶性肿瘤 ,目前主
要采用多种抗肿瘤药物联合应用治疗的方法 ,然而抗
肿瘤药物的毒性作用和耐药性限制了其应用范围[ 1] 。
因此 ,寻找能够最大限度杀伤肿瘤细胞 ,而对正常细
胞伤害最低的药物 , 成为研究的热点 。峨参(An-
thriscus sylvestris(L.)Hoffm.)是伞形科峨参属植物 ,为
峨参属植物的代表植物 ,以根 、叶入药 ,具有益气健
脾 ,活血止痛的作用[ 2] 。有文献[ 3-4]报道 ,峨参根 、叶 、
花中分得的峨参内酯(去氧鬼臼毒素)具有抑制癌细
胞增殖 ,抗有丝分裂和抗病毒的作用 ,前期研究[ 5-7]发
现峨参提取物以及峨参内酯虽然具有良好的体外抑
制肿瘤细胞增殖作用 ,但其毒性也较强 , LD50达到
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151.52 mg/kg 。本文主要研究其体外抑制宫颈癌细
胞HeLa和骨肉瘤细胞MG-63增殖的活性。
1 材料与方法
1.1 细胞 宫颈癌细胞株 HeLa 和人骨肉瘤细胞株
MG-63购自于四川大学华西国家重点实验室。
1.2 药品与试剂 鬼臼毒素 ,冰醋酸 ,钯碳 ,氮气 ,氢
气 ,乙酸乙酯 ,石油醚 ,溴化氢 , RPMI-1640和胰蛋白
酶均采用Gibco进口分装 ,MTT 购自宝信生物有限公
司。4′-去甲峨参内酯由本实验室化学合成组提供。
1.3 主要仪器 高压反应釜 ,抽滤装置 ,磁力搅拌
器 ,紫外检测灯 ,旋转蒸发仪(德国 heidolph 公司),高
效液相色谱仪(美国 Agilent公司),制冰机 CO2 恒温
孵箱(3110 型 , 美国 Thermo 公司)、培养瓶及培养板
(美国 Coster公司)、离心机(L420型 ,长沙湘仪离心机
有限公司)、倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)、超
净工作台(BSW-880 ,江苏苏净集团有限公司)酶标仪
(Elx-800型 ,美国 Bio-Tek公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 4′-去甲峨参内酯的合成 1)中间体峨参内酯
的制备:取鬼臼毒素 100 g ,溶解在 500 mL 冰醋酸中 ,
加入钯碳 5 ~ 10 g ,将上述原料一起倒入 1L 高压釜
中 ,氮气置换 5 次后 , 氢气置换 3 次 , 加热至内温
95 ℃,氢气压力提高至 1.1 atm ,反应 5 h后 ,降温 ,卸
压后 ,过滤掉催化剂 ,浓缩干溶剂后 ,得到峨参内酯粗
品 ,粗品用乙酸乙酯∶石油醚 =1∶3 的混合溶剂
200 mL重结晶得到高效液相纯度大于 98%的白色粉
末峨参内酯75 g 。在峨参内酯的制备过程中 ,催化剂
用量在5%~ 10%,可以得到收率 75%左右的峨参内
酯 ,大于 10%的催化剂对峨参内酯生产量无影响。
氢气压力大于 1.1 atm即可 ,压力继续提高对反应时
间和反应生成的峨参内酯无影响。反应时间 5 h 后
反应就终止 ,延长反应时间对峨参内酯收率和纯度均
无影响 。2)4′-去甲峨参内酯的制备可以采用溴化氢
反应或者碘化钠和甲磺酸来制备 ,碘化钠和甲磺酸制
备4′-去甲峨参内酯收率较低 ,优先选用溴化氢反应 ,
反应溶剂可以是二氯甲烷 ,氯仿 ,冰醋酸等 ,优先选用
冰醋酸做反应溶剂 。具体操作为 ,10g 峨参内酯加入
50 mL 含量为 30%的溴化氢冰醋酸溶液 ,室温搅拌
0.5 h后 ,加入 200 mL 水搅拌10min ,过滤出固体得到
粗品8.5 g 。粗品加入 25 mL甲醇重结晶后得到 7.2 g
高效液相纯度大于 98%的 4′-去甲峨参内酯。
1.4.2 细胞株培养 宫颈癌细胞株 HeLa和人骨肉
瘤细胞株 MG-63 接种于含 10%胎牛血清的 RPMI-
1640培养基的培养瓶中 ,37 ℃、5%CO2、饱和湿度条
件下常规培养 ,每 2 d 换液传代培养 ,取对数生长期
细胞用于实验。
1.4.3 MTT 法检测 4′-去甲峨参内酯对宫颈癌细胞
HeLa和骨肉瘤细胞 MG-63增殖抑制作用[ 8]  取对数
生长期细胞接种于 96孔培养板内 ,每孔 1×104 个细
胞 ,终体积 200μL ,待细胞密度达到 70%~ 80%时 ,弃
掉旧培养基 ,分别加入含有不同浓度 4′-峨参内酯的
培养液 ,共设7个药物浓度梯度 ,分别为 0.1%DMSO 、
5 、10 、20 、40 、80和 160 μg/mL ,每组 3个复孔 ,每孔终
体积 200 μL ,继续培养 36 h 后 , 每孔加入 50 μL 的
5 mg/mLMTT 工作液 , 37 ℃恒温培养箱放置 4 h ,弃
上清 , 每孔加入 150 μL DMSO , 220 r/min 摇床震荡
10 min使蓝色结晶充分溶解。置于全自动酶标仪检
测 490 nm波长处的各孔吸光度(OD值),0.1%DMSO
作为阴性对照 ,比较不同浓度峨参内酯对 2个细胞株
增殖的抑制作用 。抑制率(%)=(1-OD490加药孔/
OD490对照孔)×100%。
1.4.4 统计学分析 采用 SPSS 17.0软件进行数据
分析 ,各组数据以均数±标准差( x ±s)表示 ,实验组
及对照组比较用单因素方差分析。
2 结果
4′-去甲峨参内酯对宫颈癌细胞 HeLa 和骨肉瘤
细胞 MG-63增殖抑制作用 。结果显示 , 4′-去甲峨参
内酯对两种肿瘤细胞均具有显著的抑制作用 ,并且抑
制效果随着药物浓度的升高而增强 ,细胞存活率不断
下降 ,且各不同药物浓度组对细胞生长抑制率与对照
组(0.1% DMSO)相比明显升高 ,差异均有统计学意
义(P<0.05)。经计算得出 ,4′-去甲峨参内酯对宫颈
癌细胞 HeLa和骨肉瘤细胞 MG-63的 IC50值分别为
35.58μg/mL和 57.89μg/mL。
3 讨论
寻找针对性更强 ,安全性更佳的抗癌药物成为近
年来的研究热点 。化学药物特异选择性差 、不良反应
大 ,因此从中草药中获得高效低毒的抗肿瘤药物已成
为天然药物研究与开发的重要方向 。前期研究发现 ,
峨参内酯虽然具有良好的体外抗肿瘤活性 ,但其毒性
也较强 。本实验通过化学合成手法以鬼臼毒素为原
料 ,首先在醋酸中 ,以钯碳为催化剂 ,鬼臼毒素与氢气
作用生成峨参内酯 ,再在溴化氢作用下制备得到 4′-
去甲峨参内酯 ,并且该制备工艺简便合理 ,收率高。
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硬膜外复合全麻与腰硬联合麻醉
对妇科腹腔镜手术患者血流动力学的影响
唐润林1 ,郑紫磊2
(1.张家口市商业职工医院 ,河北 张家口 075000;2.张家口市第一人民医院 麻醉科 ,河北 张家口 075000)
  摘要:目的 对比硬膜外复合全麻与腰硬联合麻醉对妇科腹腔镜手术患者血流动力学及血气的影响。方
法 选取妇科腹腔镜手术患者 60例 ,依据麻醉方式不同分为观察组与对照组 ,各 30例 ,观察组采用硬膜外复
合全麻 ,对照组采用腰硬联合麻醉 ,观察 2组不同时段血流动力学改变及血气变化。结果 观察组气腹时血压
(BP)、心率(HR)、心电图(ECG)与气腹前无统计学意义(P >0.05);对照组麻醉后 SBP 、DBP 显著降低 ,10 min后
HR、SBP 、DBP与观察组比较有统计学意义(P<0.05);对照组气腹 20 min 时 PaCO2 、HCO-3 较麻醉前显著升高
(P <0.05),且显著高于观察组(P<0.05)。结论 硬膜外复合全麻应用于妇科腹腔镜手术 ,能较好控制患者
呼吸循环功能 、维持血气状态 ,减轻机体应激反应 ,较腰硬联合麻醉更具优越性 。
  关键词:硬膜外复合全麻;腰硬联合麻醉;妇科;腹腔镜手术;血流动力学
  中图分类号:R271.9      文献标志码:A 文章编号:2095-6258(2014)02-0338-03
[ 基金项目] 河北省张家口市科技计划项目(110115D)。
[ 作者简介] 唐润林(1975-), 女 ,大学本科 , 主治医师。研究方向:妇产科。
  目标产物依然表现出了对 HeLa 和 MG-63 两种
肿瘤细胞均有显著的体外抑制作用 ,经计算得出 ,4′-
去甲峨参内酯对宫颈癌细胞HeLa 和骨肉瘤细胞 MG-
63的 IC50值分别为 35.58μg/mL 和57.8 9μg/mL ,且
抑制率与浓度呈明显的量效关系 ,随着药物浓度的增
加 ,细胞存活率不断下降。用倒置显微镜观察到 ,经
4′-去甲峨参内酯处理两种细胞后 ,细胞生长明显受到
抑制 ,细胞皱缩 ,碎片化 ,与周围的细胞脱离 ,最后浮悬
于培养液中。同时 ,急性毒性试验表明 ,4′-去甲峨参内
酯的毒性显著低于峨参内酯 。高效 、低毒使得 4′-去甲
峨参内酯可能成为抗肿瘤药物领域的重大突破。
综上所述 ,4′-去甲峨参内酯对 HeLa 和 MG-63两
种肿瘤细胞均有显著的体外抑制作用 。其抑制两种
肿瘤细胞增殖的机制可能是诱导肿瘤细胞凋亡。具
体的作用机制将是下一步研究的重点。
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(收稿日期:2013-12-21)
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