全 文 ：第 33 卷 第 4 期
2 0 1 5 年 4 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 33 No． 4
Apr． 2 0 1 5
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DOI:10． 13193 / j． issn． 1673-7717． 2015． 04． 005
4’－去甲峨参内酯对四种肿瘤细胞凋亡的作用及机理研究
宋磊，耿耘，马超英，王毅，马向华
(西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031)
摘 要:目的:探讨 4’－去甲峨参内酯(0 号衍生物)作用于 Hela、MG －63、HepG2、A549 四种肿瘤细胞后，对
Bcl － 2、Bax基因表达、细胞周期及凋亡产生的影响。方法 以 0 号衍生物作为观察组，0． 1% DMSO 作为空白对照
组，紫杉醇作为阳性对照组，分别作用 48 h后采用 ELISA试剂盒检测对四种肿瘤细胞 Bcl － 2、Bax表达的影响;采
用流式细胞仪 PI单标法检测细胞周期进程及凋亡的影响。结果 ELISA试剂盒检测表明，观察组及阳性对照组与
空白对照组比较 Bcl － 2 /Bax比值均明显降低，具有显著性差异(P ＜ 0． 05);流式细胞仪检测 0 号衍生物作用四种
肿瘤细胞 48h后对细胞周期进程及凋亡的影响，结果表明 G0 /G1 期细胞百分数降低，G2 /M期细胞百分数基本不
变，而 S期细胞百分数上升，说明 0 号衍生物阻滞肿瘤细胞于 S期，且 sub － G1 细胞亚二倍体凋亡峰增加，进一步
说明其诱导凋亡的作用。结论 0 号衍生物通过上调 Bax、下调 Bcl － 2，促进肿瘤细胞凋亡;阻滞肿瘤细胞于 S期，
sub － G1 峰增加，显示其具有诱导细胞凋亡的作用。
关键词:4’－去甲峨参内酯(0 号衍生物);Bcl － 2;Bax;细胞周期;细胞凋亡
中图分类号:Ｒ730． 1 文献标志码:A 文章编号:1673-7717(2015)04-0789-03
4’－ demethyl － 4 － deoxypodophyllotoxin on Four Kinds of Tumor
Cells Apoptosis and the Mechanism Ｒesearch
SONG Lei，GENG Yun，MA Chaoying，WANG Yi，MA Xianghua
(School of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031，Sichuan，China)
Abstract:Objective:Study of 4 ＇ － demethyl － 4 － deoxypodophyllotoxin (No． 0derivatives)on Hela，MG － 63，
HepG2，A549 four kinds of tumor cells for Bcl － 2、Bax role;explore No． 0 derivatives on four tumor cells cycle and apop-
tosis． Methods Taking No． 0 derivatives as the observation group，0． 1% DMSO as the blank control group，paclitaxel as
positive control group． Observed the changes after 48 h，respectively，the expression of Bcl － 2 、Bax was detected by
ELISA kit for the tumor cells;by using flow cytometry，PI single labeled effect method to detect the cell cycle and apopto-
sis． Ｒesults By ELISA kit testing showed that the observation group and positive control group compared with blank con-
trol group，Bcl － 2 /Bax were obviously decreased，with a significant difference (P ＜ 0． 05);No． 0 derivatives action of
four tumor cells after 48h effect on cell cycle and apoptosis was detected by flow cytometry，results show that the percent-
age of G0 /G1 phase cells decreased，G2 /M cell percentage almost constant，while the percentage of S phase cells was in-
creased． No． 0 derivatives arrest cells in S phase，and the sub － G1 cell apoptotic peak increased，further explains its in-
duction of apoptosis． Conclusions No． 0 derivatives by up － regulation of Bax，down － regulation of Bcl － 2 to promote the
apoptosis of tumor cells;and arrest cells in S phase． Sub － G1 peak increased，show its effect of inducing cell apoptosis．
Key words:4＇－ demethyl － 4 － deoxypodophyllotoxin (No． 0 derivatives) ;Bcl － 2;Bax;cell cycle;apoptosis
收稿日期:2014 － 12 － 20
基金项目:国家自然科学基金项目(81073036) ;四川省科技厅应用
基础项目(2013JY0034)
作者简介:宋磊(1988 －) ，男，陕西宝鸡人，硕士研究生，研究方向:
中药及复方的物质作用基础。
通讯作者:耿耘(1959 －) ，女，山东莘县人，教授，硕士研究生导师，
研究方向:中药作用机理。E-mail:jxgy88@ 126． com。
峨参(Anthriscus sylvestris (L)Hffom．)是峨眉山的一种
道地药材，为伞形科峨参属多年生草本植物，前期的研究表
明，峨参内酯等是其主要的抗肿瘤活性成分［1］。峨参内酯
能抑制多种肿瘤细胞增殖，但毒性也较强［2 － 4］。因此，本课
题组设计合成 4’位脱去甲基的 4’－去甲峨参内酯，经体
外活性检测发现对 Hela、MG － 63、HepG2、A549 肿瘤细胞
均具有良好的抑制作用，IC50值分别为 35． 58 μg /mL、57． 89
μg /mL、66． 36 μg /mL、45． 29 μg /mL。本文主要研究 4’－
去甲峨参内酯引起细胞凋亡的作用及机理。
1 材料与方法
1． 1 肿瘤细胞
所有肿瘤细胞均购自于四川大学华西药学院。
1． 2 主要试剂及药品
DMEM培养基(Hyclon 公司)、胰蛋白酶(Hyclon 公
司)、PBS溶液(自制)、胎牛血清(Hyclon 公司)、青霉素 /链
霉素溶液(Hyclon 公司)、MTT(Sigma 公司)、6 孔培养板
(Coster公司)、DMSO(Sigma 公司)、PI 染液(Sigma 公司)、
人 B细胞淋巴瘤因子 2 酶联免疫分析试剂盒(产品编号:
987
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ISC10330EIA － 2029H)、人 Bcl － 2 关联 x 蛋白酶联免疫分
析试剂盒(产品编号:KYM10330EIA － 2024H)。4’－去甲
峨参内酯由课题组合成得到。
1． 3 主要实验仪器
BSW － 880 超净工作台(江苏苏净集团有限公司)、
L420 型离心机(长沙湘仪离心机有限公司)、3110 型 CO2
恒温孵箱(Thermo公司)、FE20K 恒温水浴箱(江苏太仓市
实验设备厂)、倒置相差显微镜(索尼公司)、漩涡混合器
(其林贝尔有限公司)、流式细胞仪(BD公司)、Elx － 800 酶
标仪(Bio － Tek公司)。
1． 4 实验方法
1． 4． 1 4’－去甲峨参内酯对 Bcl － 2、Bax作用观察 取对
数生长期的四种肿瘤细胞，经胰酶消化后制成单细胞悬液，
按 1 × 105个 /孔分别接种到 25 mL培养瓶中，在 CO2恒温孵
箱内培养 24 h 后，吸弃旧培养基。分为观察组、阳性对照
组、空白对照组。观察组 0 号衍生物终浓度为 40 μg /mL;
阳性对照组紫杉醇终浓度为 1 μg /mL;空白对照组加入含
有 0． 1% DMSO 的培养基，培养 48h 后进行检测。Bax、Bcl
－ 2 的检测过程严格按照 ELISA试剂盒使用说明进行。
1． 4． 2 流式细胞仪检测细胞周期 取对数期四种肿瘤细
胞，观察组 0 号衍生物终浓度为 40 μg /mL;阳性对照组紫
杉醇终浓度为 1 μg /mL;空白对照组含有 0． 1%的 DMSO。
CO2恒温孵箱内培养 48h 后，胰酶消化收集细胞。用预冷
的 pH7． 4 的 PBS洗 1 ～ 2 次，再加入 1 mL预冷的 70%乙醇
固定，于 4 ℃过夜。上机检测前加入 3 ～ 4 mL PBS 吹散并
洗涤细胞，1500 r /min离心 5 min，弃去上清液后加 1 mLPI
染液(50 μg /mL)，室温下避光反应 30 min，采用流式细胞
仪分析细胞的周期分布。
1． 4． 3 流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数期细胞接种于
6 孔培养板中培养 24 h，分组与加药及后处理与上述细胞
周期检测方法一致，最后用流式细胞仪检测细胞凋亡。因
为细胞凋亡时有 DNA 的断裂丢失，故细胞 DNA 含量少于
二倍体，流式细胞仪检测时出现在 G1 期之前，称为 Sub －
G1 期，细胞凋亡率为其占细胞总数的比例。
1． 4． 4 统计学处理分析 实验数据整理核对后，采用统计
学 SPSS 19． 0 软件进行处理分析，P ＜ 0． 05 表示结果具有显
著性差异，实验结果以平均数 ±标准差(珋x ± s)表示。
2 结果
2． 1 4’－去甲峨参内酯对四种肿瘤细胞 Bcl － 2、Bax作用
观察
结果如表 1 所示，观察组(0 号衍生物)、阳性对照组
(紫杉醇)与空白对照组相比，0 号衍生物作用四种肿瘤细
胞 48 h后，Bcl － 2 /Bax 比值明显降低，P ＜ 0． 05，表示结果
具有显著性差异。
2． 2 4’－去甲峨参内酯对四种肿瘤细胞的细胞周期进程
影响
浓度为 40 μg /mL 的 0 号衍生物作用于 HepG2、Hela、
MG －63、A549 细胞 48 h 后，观察组 G0 /G1 期细胞百分数
降低，S期的细胞百分数增加，与空白对照组相比结果有显
著性差异(P ＜ 0． 05)，G2 /M 期的细胞百分数基本不变;观
察组与阳性对照组相比，G0 /G1、G2 /M、S 期细胞百分数无
显著性差异(P ＞ 0． 05)。说明 0 号衍生物能造成细胞 S 期
阻滞，其效果与紫杉醇无差异，如插页Ⅱ图 1 ～图 4 所示。
表 1 4’－去甲峨参内酯作用四种肿瘤细胞
48 h后 Bcl － 2 /Bax比值分析
细胞种类 空白对照组 观察组 阳性对照组
HepG2 2． 12 ± 0． 36 1． 88 ± 0． 24* 1． 85 ± 0． 39*
Hela 2． 19 ± 0． 31 1． 73 ± 0． 30* 1． 52 ± 0． 24*
MG －63 2． 04 ± 0． 28 1． 77 ± 0． 26* 1． 45 ± 0． 28*
A549 1． 95 ± 0． 27 1． 59 ± 0． 35* 1． 50 ± 0． 22*
注:观察组、阳性对照组与空白对照组相比，* P ＜ 0． 05。
2． 3 4’－去甲峨参内酯对四种肿瘤细胞凋亡的影响
结果如表 2 所示，药物作用 48 h 后，经流式细胞仪检
测在 G0 /G1 期前有 sub － G1 峰。0 号衍生物、紫杉醇作用
四种肿瘤细胞 48 h 后，细胞的凋亡率与空白对照组相比，
结果具有显著性差异(P ＜ 0． 05)。
表 2 4’－去甲峨参内酯对四种肿瘤细胞凋亡的影响(%)
细胞种类 空白对照组 观察组 阳性对照组
HepG2 0． 94 ± 0． 71 14． 83 ± 1． 25* 16． 19 ± 1． 84*
Hela 0． 76 ± 0． 82 14． 10 ± 1． 63* 14． 97 ± 2． 01*
MG －63 0． 84 ± 0． 12 13． 16 ± 1． 84* 18． 26 ± 2． 35*
A549 0． 84 ± 0． 21 15． 25 ± 1． 94* 17． 12 ± 1． 65*
注:观察组、阳性对照组与空白对照组相比，* P ＜ 0． 05。
3 讨论
近年来在有关细胞凋亡的研究中，Bcl － 2 成为了最受
关注的基因之一［5］。Bcl － 2 位于人的 19 号染色体，它作
为一个凋亡抑制基因在很多肿瘤细胞中均有较高的表达。
该基因通过抑制细胞色素 C 从线粒体到细胞质的释放过
程，阻止肿瘤细胞凋亡，从而提高细胞对放疗化疗的耐受
性，Bcl － 2 成为抗肿瘤治疗的研究热点。Bax 与 Bcl － 2 的
作用相反，它能促进细胞的凋亡，细胞的存亡可以通过这二
者的比值来调节。如果受到凋亡信号的刺激，Bax 就会形
成同源二聚体来诱导凋亡;越来越多的 Bax 同源二聚体会
随着 Bcl － 2 表达量的上升而分开，并且与 Bcl － 2 结合形成
更加稳定的 Bax － Bcl － 2 异源二聚体，抑制 Bax － Bax 同源
二聚体诱导细胞凋亡。这就解释了为什么 Bcl － 2 与 Bax
的比值会成为细胞凋亡调节的关键因素［6］。
0 号衍生物对四种肿瘤细胞作用 48h 后的结果显示，
Bcl － 2 /Bax比值与空白对照组相比明显偏低，具有显著性
差异(P ＜ 0． 05)。这说明 0 号衍生物可以下调 Bcl － 2，同
时上调 Bax，从而诱导相关肿瘤细胞凋亡。
细胞周期是细胞生命活动的基本过程，主要包括细胞
分裂及 DNA的合成。细胞在进化过程中构建了一系列调
控机制，这保证了细胞周期严格有序地交替。相关的研究
显示与细胞周期调控有关的主要有三大类，包括细胞周期
蛋白依赖性激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂及细胞
周期蛋白［7］。以细胞周期蛋白依赖性激酶为调控网络的
核心，这三大类通过相互之间的正性调控作用、负性调控作
用构成了周期调控的分子基础。有研究显示，肿瘤的发生
和发展与细胞周期调控之间有着紧密的联系，细胞增殖、分
化及凋亡均为细胞周期依赖性。通过调控抑制肿瘤细胞周
期蛋白的表达，选择性地抑制细胞周期蛋白依赖性激酶的
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活性，从而使肿瘤细胞周期蛋白异常增殖停止，这是一条肿
瘤治疗的新思路［8］。
本研究结果表明，0 号衍生物作用于四种肿瘤细胞后，
S期细胞的百分数上升，说明 0 号衍生物能阻滞这四种肿
瘤细胞于 S 期，并且经流式细胞仪检测在 G0 /G1 期前有
sub － G1 细胞亚二倍体凋亡峰，进一步说明 0 号衍生物具
有诱导四种肿瘤细胞凋亡的作用。
参考文献
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DOI:10． 13193 / j． issn． 1673-7717． 2015． 04． 006
复心合剂对心衰大鼠信号通路 Ｒaf － MEK － EＲK的影响
薛一涛1，李秋实2，焦华琛1，苏文革1
(1．山东中医药大学附属医院，山东 济南 250000;2．北京王府中西医结合医院，北京 102200)
摘 要:目的:初步探索复心合剂对信号通路 Ｒaf － MEK － EＲK的影响。方法:75 只 Wistar雄性大鼠，随机分
为 5 组，对照组、卡托普利组、复心合剂低剂量组、复心合剂高剂量组均为 15 只。实验过程中阿霉素干预 4 周后
测定大鼠心功能;6 周后应用 Western blot法检测大鼠心肌组织中 Ｒaf、MEK、EＲK 蛋白表达情况。结果:(1)与正
常对照组比较，模型组大鼠 BNP值显著升高(P ＜ 0． 01) ，心衰模型成功建立。(2)与正常对照组相比，模型组大
鼠心肌组织 Ｒaf水平显著升高(P ＜ 0． 01)，复心合剂高剂量组、卡托普利组大鼠心肌组织 Ｒaf水平显著降低(P ＜
0． 01) ，与卡托普利组相比，复心汤高剂量组大鼠心肌组织 Ｒaf 无统计学意义(P ＞ 0． 05)。(3)与正常对照组相
比，模型组大鼠心肌组织 MEK水平显著升高(P ＜ 0． 01)，复心合剂高剂量组、卡托普利组大鼠心肌组织 MEK 水
平显著降低(P ＜ 0． 01)。(4)与正常对照组相比，模型组大鼠心肌 EＲK 蛋白表达明显升高(P ＜ 0． 01) ，卡托普利
组及复心合剂高剂量组 EＲK蛋白表达无显著差异性(P ＞ 0． 05)，与模型组相比，复心合剂高剂量组、卡托普利组
大鼠心肌组织 EＲK水平显著降低(P ＜ 0． 01)。结论:复心合剂对心衰大鼠信号通路 Ｒaf － MEK － EＲK 的蛋白激
活具有一定的抑制作用，延缓心衰进程。
关键词:复心合剂;心力衰竭;信号通路;Ｒaf /MEK /EＲK
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标志码:A 文章编号:1673-7717(2015)04-0791-04
The Effect of Fuxin Mixture on Ｒaf －MEK － EＲK Pathway in
Chronic Congestive Heart Failure (CHF)Ｒats
XUE Yitao1，LI Qiushi2，JIAO Huachen1，SU Wenge1
(1． The affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250000，Shandong，China;
2． Beijing Ｒoyal Integrative Meidicine Hospital，Beijing 102200，China)
Abstract:Objective:To study the effect of Fuxin mixture on Ｒaf － MEK － EＲK pathway in Chronic congestive Heart
Failure (CHF)rats． Methods:75 male wistar rats are randomly divided into 5 groups:control group，model group，cap-
topril group，Fuxin mixture low dose group and Fuxin mixture high dose group． Adriamycin cardiotoxicity was utilized to
induce rat heart failure model ． Cardiac function was detemined after 4 weeks ，and Western blotting was used to detect
收稿日期:2014 － 11 － 14
基金项目:国家自然科学基金项目(81273703)
作者简介:薛一涛(1962 －)，男，主任医师，硕士，研究方向:中医药治疗心血管病的基础及临床研究。
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