全 文 ：农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2008,16 (3):465~473
*基金项目:教育部新世纪优秀人才支持计划(No.NCET-06-0819)、教育部全国优秀博士论文基金(No.200458)、国家自然科学基金(No.
30671272,30370882)和国家高技术研究发展计划(863)项目(No.2006AA10Z179和2006AA10Z1F8)资助。
**通讯作者。Authorforcorespondence.博士,副研究员,硕士生导师,主要从事作物遗传育种研究。E-mail:.
收稿日期:2007-11-08 接受日期:2008-01-04
·研究论文·
小麦中国春背景下长穗偃麦草Ee染色体组
特异AFLP及STS标记的建立*
张 丽,颜泽洪**,郑有良,刘登才,代寿芬,张连全,魏育明
(四川农业大学小麦研究所,都江堰 611830)
摘要:为建立长穗偃麦草(Lophopyrumelongatum)Ee染色体组特异的分子标记,以普通小麦(Triticumaestivum)中国春、中
国春-长穗偃麦草二体代换系和附加系为材料,用5对扩增片段长度多态性(AFLP)引物进行分析,共筛选出 28个分布于
1~7Ee7个染色体特异的 AFLP标记,经 PAGE凝胶电泳后回收、克隆和测序,并根据测序结果设计 PCR特异引物,成功地将
AFLP标记 E-ATC/M-CGTA341bp,E-ATT/M-CTAG265bp,E-AAT/M-CCAG139bp和 E-ATT/M-CTAG205bp转化为实验
结果稳定、操作更简单的序列标记位点(STS)标记。利用获得的STS标记对5个长穗偃麦草居群和8个小麦品种进行了鉴定。
结果表明,这些STS标记在长穗偃麦草居群中检测到,但在其它小麦背景中检测不到。表明这些标记可以用于小麦-长穗偃麦
草异源附加系和代换系中长穗偃麦草遗传物质的检测。
关键词:长穗偃麦草;附加系;代换系;扩增片段长度多态性(AFLP);序列标记位点(STS)
中图分类号:S188 文献标识码:A 文章编号:1006-1304(2008)03-0465-09
DevelopmentofEe-chromosomeSpecificAFLPandSTSMolecularMarker
forLophopyrumelongatuminChineseSpringWheatBackground
ZHANGLi,YANZe-hong**,ZHENGYou-liang,LIUDeng-cai,DAIShou-fen,
ZHANGLian-quan,WEIYu-ming
(TriticeaeResearchInstitute,SichuanAgriculturalUniversity,Dujiangyan611830,China)
Abstract:FiveAFLP (amplifiedfragmentlengthpolymorphism)primercombinationswereusedtoscreencommonwheat
(Triticumaestivum)ChineseSpring(CS),CS-Lophopyrumelongatumdisomicsubstitutionandadditionallinesfordevelopmentofthe
EechromosomespecificmolecularmarkersfordiploidspeciesofL.elongatum.And28AFLPmarkers,whichwerespecificfor1Eeto
7EechromosomeofthediploidspeciesofL.elongatum,respectively,wereobtained.AftercloningandsequencingoftheseAFLP
fragments,4AFLPmarkers,E-ATC/M-CGTA341bp,E-ATT/M-CTAG265bp,E-AAT/M-CCAG139bpandE-ATT/M-CTAG205
bp,weresuccessfulyconvertedintoreliablesequencetaggedsite (STS)markers,andfurthersubjectedtoamplificationother5
accessionsoftheL.elongatumand8commonwheatsforvalidatingtheirspecificityandpolymorphism.Theresultsshowedthatthese
markerscouldamplifythesamefragmentsfromL.elongatumaccessionsbutcouldntamplifythemfromother8commonwheats,
suggestingthatthesemarkerscanbeusedfordetectingtheEechromosomegeneticmaterialsinwheat-L.elongatumsubstitutionand
additionallines.
Keywords:Lophopyrumelongatum;additionallines;substitutionlines;amplifiedfragmentlengthpolymorphism(AFLP);
sequencetaggedsite(STS)
长穗偃麦草(Lophopyrumelongatum)是小麦重
要的野生近缘植物之一。对小麦多种病、虫害高抗或
免疫,具有高蛋白质含量、抗寒性强、耐旱、耐盐、适
应性广、生长势强、多花多实等诸多优良性状,且易
于与小麦杂交,因此是对普通小麦遗传改良最有利
用价值的偃麦草物种之一。利用其与小麦杂交,已经
农 业 生 物 技 术 学 报 2008年
培育出许多优良品种(李振声等,1985)。早在上世纪
80年代初,就相继育成了一整套完整的小麦 -长穗
偃麦草二体附加系和代换系 (Dvorák,1980;Dvorák
andChen,1984;TuleenandHart,1988)。利用这套小
麦 -长穗偃麦草二体附加系和代换系,马渐新等
(1999)通过条锈病抗性鉴定、抗性遗传和生化分析,
发现了长穗偃麦草携带的位于 3E染色体上的抗小
麦条锈病新基因,并在小麦背景中呈显性遗传。唐朝
晖等(2003)发现了长穗偃麦草1E染色体长臂上的
高分子量麦谷蛋白基因位点 Glu-E1编码的高分子
量麦谷蛋白亚基在小麦中国春背景下表达,其迁移
率与中国春1By8亚基迁移率相同,命名为1E8。李
玉京等 (1998,1999)对其耐低磷营养胁迫特性进行
鉴定和遗传分析,发现了长穗偃麦草4E和6E染色
体携带有耐低磷营养胁迫基因,其效应远远超过背
景亲本中国春;同时发现了5E染色体携带有强烈
抑制低磷胁迫的基因,通过等电聚焦技术将酸性磷
酸酶和碱性磷酸酶的编码基因分别定位于3E和4E
染色体上。彭远英等(2005)以相同的研究材料对小
麦中国春背景下长穗偃麦草光合作用相关基因进行
了研究,发现了2E和4E染色体分别有控制穗粒数
和千粒重性状的基因。
扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlength
polymorphism,AFLP)是一种基于 PCR和 RFLP基
础上发明的DNA指纹技术。它兼有RFLP技术的可
靠性和PCR技术的高效性,且具有快速、灵敏、稳
定、所需DNA量少、多态性检出率高、重复性好、可
以在不知道基因组序列特点的情况下进行研究等特
点,所以被认为是一种十分理想的、有效的分子标
记,已被广泛用于遗传图谱构建、遗传多样性研究、
基因定位及品质鉴定等方面(郑先云等,2003)。
利用偃麦草与小麦杂交也相继育成了许多小麦
-长穗偃麦草二体附加系和代换系以利用长穗偃麦
草的优良性状和基因 (李振声等,1985;Dvorák,
1980;DvorákandChen,1984;TuleenandHart,1988
)。尽管已有建立偃麦草E染色体组特异分子标记的
相关研究(刘树兵等,1998;尤明山等,2002),但用于
检测和跟踪长穗偃麦草染色体的标记数量仍然十分
有限。本研究利用AFLP技术筛选获得Ee染色体组
特异的AFLP标记,并建立长穗偃麦草Ee染色体组
特异的序列标记位点 (sequencetaggedsite,STS),以
期为小麦背景中长穗偃麦草外源遗传物质的快速检
测提供新途径。
1 材料和方法
1.1 材料
本研究所用实验材料及其来源列于表1。其中,
包括20份中国春-长穗偃麦草二体代换系(Tritium
aestivumcv.ChineseSpring-Lophopyrumelongatum
disomicsubstitutionlines)、7份中国春 -长穗偃麦草
二体附加系 (disomicadditionallines)、5份长穗偃麦
草和9份不含长穗偃麦草血缘的普通小麦 品种。
1.2 基因组DNA的提取
种子发芽后参照 DoyleandDoyle (1990)的
材料
Materials
中国春-长穗偃麦草二体代换系
T.aestivumcv.Chinese
Spring-L.elongatum
disomicsubstitutionlines
中国春-长穗偃麦草二体附加系
T.aestivumcv.ChineseSpring-L.elongatum
disomicadditionallines
长穗偃麦草L.elongatum
普通小麦 T.aestivum
名称
Name
DS1Ee/1A,DS1Ee/1B,DS1Ee/1D,DS2Ee/2A,
DS2Ee/2B,S2Ee/2D,DS3Ee/3A,DS3Ee/3B,
DS3Ee/3D,DS4Ee/4A,DS4Ee/4B,DS4Ee/4D,
DS5Ee/5B,DS5Ee/5D,DS6Ee/6A,DS6Ee/6B,
DS6Ee/6D,DS7Ee/7A,DS7Ee/7B,DS7Ee/7D
DA1Ee,DA2Ee,DA3Ee,DA4Ee,DA5Ee,
DA6Ee,DA7Ee
PI595139,PI535580,PI57416
PI206624,PI142012
中国春,川农16,川麦42,绵农4号,绵阳26、
川麦107,川麦28,川育12,川育16
ChineseSpring,Chuannong16,Chuanmai42,
Miannong4,Mianyang26,Chuanmai107,
Chuanmai28,Chuanyu12,Chuanyu16
来源
Source
Dr.DvorákJandLuoMC
USA
Dr.DvorákJandLuoMC
USA
USDA-AGRS
四川农业大学小麦研究所
TriticeaeResearchInstitute,
SichuanAgriculturalUniversity
表1供试材料
Table1Theexperimentalmaterialsusedinthisstudy
466
第3期 张 丽等:小麦中国春背景下长穗偃麦草Ee染色体组特异AFLP及STS标记的建立
CTAB法提取DNA。紫外分光光度计测定DNA的
浓度和纯度,0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,
最后统一调整其浓度至100ng/μL,用于AFLP分
析。
1.3 AFLP分析
AFLP分析参照 Vosetal.(1995)的方法,用限
制性内切酶 EcoRⅠ和 MseⅠ酶切总基因组 DNA
100ng后加上接头进行预扩增,反应条件为:94℃
变性20s,56℃ 退火 30s,72℃ 延伸 2min,20个
循环,最后60℃ 延伸30min。将预扩增产物稀释
20倍后作为选择性扩增模板,随机选用8个带3个
选择性碱基的EcoRⅠ端引物 (分别是AAA、ATA、
AAT、ATT、AAG、ATG、AAC和 ATC)和 4个带 4
个选择性碱基的 MseⅠ端引物 (分别是 CATG、
CTAG、CGTA和 CCAG)组成的 32个引物组合的
部分进行选择性扩增,反应条件为:首先以94℃变
性30s、65℃退火 30s(以后每次循环降低0.7℃)、
72℃延伸2min进行13次循环后,又以94℃变性
30s、65℃退火 30s、72℃延伸 2min,23个循环,
最后60℃延伸30min。
1.4 扩增产物的检测
扩增产物经95℃变性后,加变性加样缓冲液,
以6%的尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,电泳条件
为 80W恒功率电泳 2h30min,然后进行银染显
色,参照方卫国等(2000)的方法进行。
1.5 特异AFLP标记的克隆、测序
以灭菌的解剖刀从干燥的聚丙烯酰胺凝胶上准
确切下特异AFLP片段的目的胶条,转入装有 200
μL双蒸水的离心管中,置于沸水浴中 5min,5000
r/min离心2min,取5μL上清作为模板再次以相应
引物组合,相同条件进行扩增。扩增产物经琼脂糖凝
胶电泳验证分子量后,克隆于 pMD18-T载体上 (龙
海等,2004),进行DNA测序。
1.6 STS-PCR分析
依据测序结果,设计 STS引物,对所有材料进
行PCR扩增以分别进行特异性和多态性研究。PCR
反应体系总体积为20μL,其中包括10×PCRbufer
2μL、10mmol/LdNTP2μL、25mmol/LMgCl21.2
μL、TaqDNA聚合酶1.0U、DNA模板100~200ng、
20μmol/L引物各1μL,加ddH2O至终体积。反应
条件为:以 94℃变性 30s、然后以各自退火温度复
性 30s(STS318,STS116和 STS182,Tm=60℃;STS241,
Tm=62℃)、72℃延伸 1min,35个循环,最后以
72℃延伸5min。扩增产物在3%的琼脂糖凝胶上进
行检测。
2 结果和分析
2.1 中国春背景下 Ee染色体特异 AFLP标记的筛
选与分析
以小麦中国春为背景的1套完整的小麦-长穗
偃麦草二体附加系和代换系,使鉴定其中的Ee染色
体特异的 AFLP片段成为可能。 特异的 AFLP标
记仅指那些具有染色体特异的可重复的扩增片段,
如图1所示,某AFLP谱带同时出现于相应的代换
系及附加系中,而在中国春中没有出现,则此片段为
相应Ee染色体的特异AFLP标记。利用普通小麦中
国春和中国春-长穗偃麦草二体代换系和附加系为
材料,用 5对选择性引物组合进行筛选,共获得 28
条分布于长穗偃麦草1~7Ee染色体的特异AFLP片
段(表2)。其中,1Ee、2Ee、3Ee和5Ee较多,分别为7、
8、5和4个。而4Ee、6Ee和7Ee较少,分别为1、1和
2个。
2.2 特异AFLP片段的克隆测序
从中国春-长穗偃麦草二体代换系和附加系中
回收了这些染色体特异的AFLP片段,克隆后分别
送北京赛百盛公司测序,测序结果见表2。经过在
图1.引物组合E-ATG/M-CCAG选择
性扩增的Ee特异AFLP带
Fig.1.EechromosomespecificAFLP
markersrevealedbyprimercombination
E-ATG/M-CCAG
M,DNAmarker;1,ChineseSpring;2,
DA1Ee;3,DS1Ee/1A;4,DS1Ee/1B;5,
DS1Ee/1D;6,DA2Ee;7,DS2Ee/2A;8,DS2Ee/2B;9,DS2Ee/2D;10,DA3Ee;11,DS3Ee/3A;12,DS3Ee/3B;13,DS3Ee/3D;14,DA4Ee;15,DS4
Ee/4A;16,DS4Ee/4B;17,DS4Ee/4D;18,DA5Ee;19,DS5Ee/5B;20,DS5Ee/5D;21,DA6Ee;22,DS6Ee/6A;23,DS6Ee/6B;24,DS6Ee/6D;25,DA7
Ee;26,DS7Ee/7A;27,DS7Ee/7B;28,DS7Ee/7D.Whitearowheads,blackarowheadsandtrianglesindicate1Ee,2Eeand5Eespecificbands,
467
农 业 生 物 技 术 学 报 2008年
染色体
Chromosomes
1Ee
2Ee
3Ee
4Ee
5Ee
6Ee
7Ee
片段大小/bp1)
Fragmentsize
341
220
212
117
295
463
265
428
338
205
367
174
206
139
185
150
196
406
324
327
220
267
210
258
143
284
129
335
引物组合
Primercombinations
M-CGTA/E-ATC
M-CCAG/E-ATG
M-CCAG/E-AAT
M-CTAG/E-ATT
M-CCAG/E-ATG
M-CCAG/E-AAT
M-CTAG/E-ATT
M-CCAG/E-ATG
M-CCAG/E-AAT
M-CTAG/E-ATT
M-CCAG/E-AAC
M-CGTA/E-ATC
M-CCAG/E-ATG
M-CCAG/E-AAT
M-CTAG/E-ATT
M-CGTA/E-ATC
M-CCAG/E-ATG
M-CCAG/E-AAC
M-CCAG/E-ATG
M-CCAG/E-AAT
M-CCAG/E-AAC
M-CCAG/E-ATG
M-CCAG/E-ATG
M-CCAG/E-ATG
M-CCAG/E-AAT
M-CTAG/E-ATT
M-CCAG/E-AAT
M-CCAG/E-AAC
Blast比对结果
Blastresults
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
与DQ537335部分序列的一致性为88%
88%identitiestopartialsequenceofDQ537335
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
叶绿体matK基因部分序列
PartialsequenceofchloroplastmatKgene
与DQ537335部分序列的一致性为85%
85%identitytopartialsequenceofDQ537335
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
小麦Wknox1b基因的部分序列
PartialsequenceforwheatWknox1bgene
无相似序列Nosimilarsequence
无相似序列Nosimilarsequence
NCBI数据库(www.ncbi.nih.nlm.gov/blast)进行比
对,绝大多数没有找到相似序列,只有4个序列找到
了相似序列,其中,M-CCAG/E-AAT463bp和
M-CCAG/E-AAC367bp这 2个序列分别为基因间
的 重 复 序 列 , M-CTAG/E-ATT 284 bp 和
M-CTAG/E-ATT205bp这2个序列分别为基因的
部分序列。
2.3 中国春背景下长穗偃麦草 Ee染色体特异的
AFLP标记转化为Ee染色体特异的STS标记
为了研究长穗偃麦草 Ee染色体特异 AFLP标
记转化为STS标记的可能性,分别选取了位于1Ee
和 2Ee染色体上的部分特异 AFLP标记进行了转
换。其中,位于 1Ee染色体上的 E-ATC/M-CGTA
341bp和 E-ATT/M-CTAG265bp以及 2Ee染色体
上 E-AAT/M-CCAG139bp和 E-ATT/M-CTAG205
bp4个 Ee染色体特异的 AFLP标记片段成功的被
转换为相应染色体的以序列为基础的特异 STS标
记(图2)。
由于AFLP标记主要是酶切位点的突变所产生
的,因此,在转换为STS标记的过程中,其引物序列
表2Ee染色体组特异AFLP标记的位置、大小、引物组合及NCBI比对结果
Table2Thechromosomedistribution,sizeandprimercombinationsoftheEegenomespecific
AFLPmarkersandtheirhomologycomparisonsinNCBIdatabase
1)片段大小为测序后包括人工接头长度的核苷酸数目。
1)Fragmentsizeincludedadaptorsequences.
468
第3期 张 丽等:小麦中国春背景下长穗偃麦草Ee染色体组特异AFLP及STS标记的建立
图2.1Ee(A.STS318,B.STS241)和2Ee(C.STS116,D.STS182)染色体特异的STS引物对中国春、
中国春-长穗偃麦草二体附加系和代换系PCR扩增结果
Fig.2.The1Ee(A.STS318,B.STS241)and2Ee(C.STS116,D.STS182)chromosomespecificSTSmarkersvalidatedbyPCRamplificationfor
ChineseSpring(CS)、T.aestivumcv.CS-L.elongatumdisomicadditionalandsubstitutionlines
M,DNAmarker;1,ChineseSpring;2,DA1Ee;3,DS1Ee/1A;4,DS1Ee/1B;5,DS1Ee/1D;6,DA2Ee;7,DS2Ee/2A;8,DS2Ee/2B;9,DS2Ee/2D;10,
DA3Ee;11,DS3Ee/3A;12,DS3Ee/3B;13,DS3Ee/3D;14,DA4Ee;15,DS4Ee/4A;16,DS4Ee/4B;17,DS4Ee/4D;18,DA5Ee;19,DS5Ee/5B;20,DS5
Ee/5D;21,DA6Ee;22,DS6Ee/6A;23,DS6Ee/6B;24,DS6Ee/6D;25,DA7Ee;26,DS7Ee/7A;27,DS7Ee/7B;28,DS7Ee/7D.
包括了组成 EcoRⅠ和 MseⅠ酶切位点的大部分碱
基,由于组成酶切位点的碱基已占 3~6个,因此,转
化后的STS标记引物序列至少在26个左右,这样
才能保证其特异性,从而也可区分与其具有相同酶
切位点的其它染色体特异标记。1Ee染色体上的
E-ATC/M-CGTA341bp和 E-ATT/M-CTAG265bp
以 及 2Ee染 色 体 上 E-AAT/M-CCAG139bp和
E-ATT/M-CTAG205bp的 4个 AFLP标记被转换
为STS标记后,经去除AFLP人工接头序列后 4个
片段的大小分别为318、241、116和182bp,分别命
名为 STS318、STS241、STS116和 STS182 (表 3)。其中,
STS318 和 STS241 仅 在 DS1Ee/1A、DS1Ee/1B、
DS1Ee/1D和 DA1Ee中存在,为中国春背景下长穗
偃麦草1Ee染色体特异的STS标记。STS116和STS182
仅在DS2Ee/2A、DS2Ee/2B、DS2Ee/2D和DA2Ee中存
在,为中国春背景下长穗偃麦草2Ee染色体特异的
STS标记,而在中国春和其它附加系及代换系中均
无扩增条带。
标记名称
Markername
1EeSTS318
1EeSTS241
2EeSTS116
2EeSTS182
扩增片段大小/bp1)
Fragmentsize
318
241
116
182
STS标记的核苷酸序列
NucleotidessequenceofSTSmarkers
F:5-GAATTCATCATAAAAACAGATCAAAGG-3 R:5-TAACGTAAACTTCCCGTCTGCTAC-3
F:5-TAACTAGCACACCAAATCGTTTTTGCAAAC-3R:5-AATTCATTGGGGTGGGTAAAGGAAGTGG-3
F:5-TTAACCAGGGATACAAAAACACCATAATG-3R:5-AATTCAATTACCTTGTGGATGCAAACAC-3
F:5-AATTCATTTCTAATAGATACTCGAATGAA-3R:5-TTAACTGAGGAGAGGCTACAACATCC-3
表31Ee和2Ee染色体特异的STS标记
Table3The1Eeand2EechromosomespecificSTSmarkers
1)经去处AFLP人工接头序列后片段的大小
1)FragmentsizeexcludedtheAFLPadaptorssequence.
469
农 业 生 物 技 术 学 报 2008年
图3.1Ee(A.STS318,B.STS241)和2Ee(C.STS116,D.STS182)染色体特异STS
引物对长穗偃麦草居群和小麦品种的PCR扩增结果
Fig.3.1Ee(A.STS318,B.STS241)和2Ee(C.STS116,D.STS182)chromosomespecificSTSmarkersanalysisforL.elongatumaccessions
andcommonwheatcultivars,respectively
M,DNAmarker;1~5L.elongatumaccessions:1,PI595139;2,PI535580;3,PI57416;4,PI206624;5,PI142012;6-13,commonwheatcultivars;6,
Chuannong16;7,Chuanmai42;8,Miannong4;9,Mianyang26;10,Chuanmai107;11,Chuanmai28;12,Chuanyu12;13,Chuanyu16.
2.4 中国春背景下长穗偃麦草 Ee染色体特异的
STS标记在其它长穗偃麦草中的多态性
为了研究中国春背景下获得的长穗偃麦草 Ee
染色体特异 STS标记是否对其它的长穗偃麦草居
群适用,将转换成功的4个STS标记的引物用于扩
增其它5个长穗偃麦草居群。结果显示 (图3,1~5
泳道),STS318能在所有 5个长穗偃麦草居群中扩增
出 1条相应大小的目的片段,STS241和 STS182则分
别可以在其中的不相同的3个长穗偃麦草居群扩增
出目的片段,STS116仅能在其中 1个长穗偃麦草居
群中扩出目的片段。显示了这些STS标记所扩增的
目的片段在其它长穗偃麦草居群中也是存在的,但
居群间会有一定的差异,并不是每个标记都在所有
的居群中存在。对这4个标记来说,除长穗偃麦草居
群 PI595139仅有 1个标记扩增获得目的片段外,
PI206624有其中的2个标记扩增获得目的片段,其
余3个居群均分别有3个标记获得扩增片段,没有
出现4个标记在其中均没有获得扩增片段的长穗偃
麦草居群。由于这4个标记所扩增的片段在5个长
穗偃麦草居群中出现时仅为单一的条带,或者可能
没有,而不表现出大小变化的带纹。因此,在其它长
穗偃麦草居群中,这4个标记也可能是染色体特异
的,但这需要利用以其它长穗偃麦草居群创制的小
麦-长穗偃麦草异代换系和附加系来进一步证实。
2.5 中国春背景下长穗偃麦草Ee染色体特异STS
标记在其它普通小麦背景中是否仍然特异
根据目的不同,创制普通小麦长穗偃麦草异代
换系和附加系所用的小麦背景也并不相同,这些小
麦与中国春在基因组遗传组成上可能存在差异。以
中国春为背景创制的长穗偃麦草 Ee染色体代换系
和附加系中所获得的特异 STS标记片段是否是其
它小麦中本身所具有的染色体片段,是关系到本研
究所产生的 STS标记是否适用于以其它小麦为背
景创制的普通小麦长穗偃麦草异代换系、附加系中
长穗偃麦草遗传物质的检测。基于此目的,用这4对
引物对川农 16、川麦 42、绵农 4号、绵阳 26、川麦
107、川麦28、川育12、川育16等8个不含长穗偃麦
草血缘的小麦品种进行了STS-PCR扩增,结果均没
470
第3期 张 丽等:小麦中国春背景下长穗偃麦草Ee染色体组特异AFLP及STS标记的建立
有扩增出目的片段(图3,6~13泳道),表明这些标记
片段也不是其它小麦中本身所有的 DNA片段,确
为长穗偃麦草基因组中的染色体片段。显示了它们
可以应用于以其它小麦背景和其它长穗偃麦草居群
创制的异代换系、附加系中长穗偃麦草遗传物质的
检测。
3 讨论
3.1 长穗偃麦草 Ee染色体特异的 AFLP和 STS
分子标记及其应用
从普通小麦的野生近缘属、种植物中发掘、转移
和利用优良基因和性状来改良普通小麦的产量和品
质,提高其对病、虫害的抗性和对逆境的耐受能力已
被证明是非常有效的,也取得了显著的成效 (李振
声等,1985)。迄今为止,已经成功地进行了普通小麦
与10多个近缘属、80多个种的远缘杂交,并从这些
小麦野生近缘种、属中转移了许多控制优良性状的
基因,创造了大批的异源附加系、代换系及易位系
(李振声等,1985)。但由于缺乏有效的跟踪检测外源
遗传物质的技术,限制了对这些具有遗传研究和育
种利用潜力的特异新材料的进一步研究和利用。因
此,探索和发展有效的检测技术,对小麦新材料创制
与鉴定,小麦野生近缘植物特异基因资源的发掘与
利用,推动远缘杂交和染色体工程育种,均具有非常
重要的理论与实践意义。
偃麦草属是改良普通小麦最有利用潜力的野生
近缘属之一。二倍体长穗偃麦草又是其中的一个非
常重要的种,它携带的基因组是偃麦草属最基本的
Ee染色体组,因其中具有多种优异性状和基因,已成
为小麦品种遗传改良的重要的基因来源之一 (李振
声等,1985)。因此,深入开展二倍体长穗偃麦草的研
究对推动和加速偃麦草属基因的开发和利用非常重
要。目前,已利用生化及分子标记建立了长穗偃麦草
Ee染色体组特异的分子标记。如刘树兵等(1998)利
用RAPD分子标记技术,找到了长穗偃麦草1Ee和
3Ee染色体上两个特异的RAPD分子标记。尤明山
等 (2002)以普通小麦和中间偃麦草为材料进行
RAPD分析,筛选到一个中间偃麦草染色体组特异
标记,并将该标记进一步转化为偃麦草染色体
SCAR标记,该标记能检测小麦背景下的长穗偃麦
草Ee染色体。本研究利用AFLP分子标记技术,构
建了二倍体长穗偃麦草 Ee染色体组 7个不同染色
体上的特异AFLP标记,并将其中的部分标记成功
转换为序列特异性的STS分子标记,同时证明了这
些标记在其它长穗偃麦草居群中也是可能存在的。
这就显示这些标记也可以适用于以其它的长穗偃麦
草居群创制的小麦-长穗偃麦草异源附加系和代换
系中长穗偃麦草遗传物质的检测与跟踪。
由于本研究所产生的基于AFLP片段测序结果
建立的 STS标记均是在以小麦中国春为背景下创
制的异源附加系和代换系中获得的,那么这些标记
片段是否为其它小麦中本身所有的片段?这对于以
其它小麦为背景创制的长穗偃麦草异源附加系和代
换系中长穗偃麦草遗传物种的检测是一个非常重要
的问题。本实验的研究结果表明,它们在其它8个不
含长穗偃麦草血缘的小麦品种中并不存在,这就显
示了它们确系长穗偃麦草 Ee染色体特异片段而非
小麦中的DNA片段,显示了这些标记可用于以其
它小麦为背景创制的长穗偃麦草异源附加系和代换
系中长穗偃麦草遗传物质的检测,以及用于跟踪导
入到小麦背景中的偃麦草有益性状及优良基因和研
究长穗偃麦草的物种多样性等(张学勇等,1998)。
3.2 AFLP标记的丰富性和转化为其它方便使用
的分子标记的可能性
AFLP标记结合了 RFLP的稳定性和 RAPD的
高效性,已在遗传图谱构建、基因作图和遗传多样性
研究中是一种非常有用的标记 (Daneshetal.,1994;
寿森炎等,2006)。由于AFLP标记的选择性引物组
合非常广泛,因而产生的标记数目也非常多。本研究
仅用了5个引物组合,就从中找到了28个长穗偃麦
草Ee染色体特异的标记片段,几乎每个引物组合都
找到了多个长穗偃麦草Ee染色体特异的标记片段。
如果选用的选择性引物组合的数量再增加,获得的
长穗偃麦草 Ee染色体特异的标记片段数量还会大
量增加。因此,相对于RAPD和SSR标记等其它分
子标记,用AFLP产生的特异标记的数目要多。但由
于AFLP分析程序比较繁琐和耗时较长,所以常将
其转化成操作简单、更容易利用的且比较可靠的以
PCR为基础的标记,如SCAR和STS标记 (Reamon
andJung,2000;Boukaretal.,2004;Negietal.,
2000)。但AFLP标记转换为其它标记并不总是很容
易实现的。研究表明,凡是小于200bp的 AFLP片
段都很难转化为 SCAR标记(Deetal.,1997;Negiet
al.,2000)。但Brugmansetal.(2003)的研究表明,只
要AFLP序列内部有足够的长度用于特异引物的设
计,就可以将该标记转化成单位点PCR分析。那么
引物的设计将成为AFLP标记转化为其它标记的关
键。因AFLP标记是酶切位点突变所产生的,因此,
转换后的标记应该包括酶切位点和选择性碱基(Xu
andBan,2004),这是保证标记特异性的关键,由于这
471
农 业 生 物 技 术 学 报 2008年
参 考 文 献
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选择性引物组合产生的其它标记,引物的长度通常
都控制在 25~30bp之间,如果引物序列过短,将导
致其特异性不高,引物过长,扩增又比较困难。与
RAPD标记转化不同的是,AFLP标记转换为其它标
记,如STS等标记时所设计引物的位置的变化非常
小,这导致了转换上的困难。
472
第3期 张 丽等:小麦中国春背景下长穗偃麦草Ee染色体组特异AFLP及STS标记的建立
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