全 文 ：藏药吉子恩保（甘西鼠尾草）ＤＮＡ提取方法比较
李文渊，王津慧，童　丽，杨　靖，热增才旦，索南邓登，杨　芳
（青海大学 医学院，青海 西宁８１０００１）
摘　要：目的：建立藏药吉子恩保（甘西鼠尾草）ＤＮＡ的提取方法，为进一步开展分子生药学研究奠定基
础。方法：比较ＳＤＳ法和改良ＣＴＡＢ法，运用紫外分光光度计和电泳分析方法测定所得ＤＮＡ样品的纯
度和浓度。结果与结论：两种方法中改良ＣＴＡＢ法所得的ＤＮＡ质量较高。
关键词：吉子恩保；甘西鼠尾草；ＤＮＡ提取
中图分类号：Ｒ２８５．５　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１６７３－２１９７（２０１５）０７－００１１－０２
ＤＯＩ：１０．１１９５４／ｙｔｃｔｙｙ．２０１５０７００５
收稿日期：２０１４－１１－１４
基金项目：青海省科技厅项目（２０１１－Ｎ－Ｆ１９）；青海大学中青年科研基金（２０１２－ＱＹＴ－１）
作者简介：李文渊（１９８３－），女，硕士，青海大学讲师，研究方向为中藏药资源研究。
Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｏｔａｌ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　Ｔｉｂｅｔａｎ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｊｉｚｉ－Ｅｎｂａｏ（Ｓａｌｖｉａ　Ｐｒｚｅｗａｌｓｋｉ　Ｍａｘｉｍ．）
Ｌｉ　Ｗｅｎｙｕａｎ，Ｗａｎｇ　Ｊｉｎｈｕｉ，Ｔｏｎｇ　Ｌｉ，Ｙａｎｇ　Ｊｉｎｇ，Ｒｅｚｅｎｇ－Ｃａｉｄａｎ，Ｓｕｏｎａｎ－Ｄｅｎｇｄｅｎｇ，Ｙａｎｇ　Ｆａｎｇ
（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｑｉｎｇｈａｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｉｎｇ　８１０００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｙｉｅｌｄｉｎｇ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｔｉｂｅｔａｎ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｊｉｚｉ－Ｅｎｂａｏ（Ｓａｌｖｉａ　ｐｒｚｅｗａｌｓｋｉ　Ｍａｘｉｍ．），ｗｈｉｃｈ
ｌｉｅ　ａ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｗｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＳＤＳ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｍ－
ｐｒｏｖｅｄ　ＣＴＡＢ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ，ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ａｎｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＵＶ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔ－
ｒｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓｉｎｇ　ａｎｄ　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ａｎｄ　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ＤＮＡ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＣＴＡＢ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｗａｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｉｎ　ｔｗｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｊｉｚｉ－Ｅｎｂａｏ；Ｓａｌｖｉａ　ｐｒｚｅｗａｌｓｋｉｉ　Ｍａｘｉｍ；ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
　　甘西鼠尾草（Ｓａｌｖｉａ　ｐｒｚｅｗａｌｓｋｉｉ　Ｍａｘｉｍ．）（药材名：甘
肃丹参）为唇形科鼠尾草属植物，藏药名吉子恩保（音译），
与大宗常用中药丹参为同科植物，其有效成分与中药丹参
相似，功能主治亦与丹参相同，在西南、西北地区甘西鼠尾
草普遍作为临床治疗心血管疾病中药丹参的替代品种［１］。
早在２０世纪８０年代，科研工作者就展开了鼠尾草属植物的
筛选工作，在“七五”国家重点科技攻关项目“丹参类专题研
究”中得出结论：综合比较测定结果，以甘西鼠尾的有效成
分含量高，药理作用最强，质量最好，植物资源丰富，且已有
商品在全国流通，值得推广应用［２］。
此外，甘西鼠尾草作为丹参药材的重要资源之一，有文
献报道其品质甚至超过正品丹参，但目前对于其开发利用
力度远远不够，研究多集中于有效成分含量测定［３］、简单药
理作用［４］、资源调查之类［５］，用分子生物学方法对其遗传多
样性、资源评价、分子标记等方面的研究论文甚少。高质量
的ＤＮＡ是开展上述工作的前提，本文拟研究获得高质量甘
西鼠尾草ＤＮＡ的实验方法，为开展后续分子生药学［６］研究
奠定基础。
１　材料与试剂
１．１　材料
甘西鼠尾草材料分别采自青海省黄南藏族自治州、甘
肃武威市、甘肃省甘南州、青海省互助县，见表１。样品经青
海大学医学院药学系王津慧教授鉴定为甘西鼠尾草。硅胶
快速干燥后置于－２０℃冰箱保存。
１．２　主要试剂
十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）（国药集团）、三羟甲基
氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）、β－巯基乙醇（ＡＭＲＥＳＣＯ）、ＥＤ－
ＴＡ（国药集团）、ＳＤＳ（国药集团）、溴化乙锭（ＥＢ）（Ｓｉｇｍａ）、
琼脂糖（ＧＥＮＥＴＥＣＨ），其它试剂为国产分析纯。
１．３　主要仪器
冷冻离心机（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、紫外可见分光光度计（上海精
科）、凝胶成像系统（Ｔａｎｏｎ）、电泳仪（北京市六一仪器厂）、
—１１—
水浴锅（东方电工）。
表１　供试材料信息
编号 来源 经度／纬度 海拔（ｍ）
１
２
３
４
５
６
青海省互助扎龙口
青海省互助扎龙沟
甘肃武威市天祝县天堂镇
青海黄南州保安镇拉康村
青海黄南州隆务镇
甘肃省甘南州夏河县甘加乡
１０１．５７／３６．５２
１０１．５７／３６．５３
１０１．６８／３６．８６
１０２．１２／３５．７２
１０２．０９／３５．６３
１０３．０１／３７．８７
２３４０
２３４０
２２００
２３６０
２４０８
２８３２
２　方法
２．１　ＳＤＳ法
称取甘西鼠尾草干燥材料０．３ｇ，置于液氮研磨成粉，加
入 ＳＤＳ 抽 提 缓 冲 液 （１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ＰＨ　８．０）、
５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ（ＰＨ８．０）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌβ－
巯基乙醇９００μＬ和１０％ＳＤＳ　１００μＬ，反复摇匀，于６５℃水浴
１ｈ。１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液。加入等体积的酚／
氯仿／异戊醇（２５／２４／１）摇匀，１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上
层溶液，加入２／３倍体积的冷异丙醇，摇匀，放入－２０℃冰箱
中，３０ｍｉｎ。离心１２　０００ｒ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ，倒掉溶液，加入７０％乙
醇洗涤２次最后将沉淀溶于５０μＬ　ｄｄＨ２Ｏ中。
２．２　改良ＣＴＡＢ法
称取甘西鼠尾草干燥材料０．３ｇ，经液氮冷冻后研磨成
粉末状，立即转入６５℃预热后的９００μＬＣＴＡＢ提取缓冲液
（２％ＣＴＡＢ，疏基乙醇）中，充分振摇使材料与提取液混合均
匀，于６５℃保温９０ｍｉｎ，其间轻轻倒转离心管数次，冷却至
室温，加入等体积氯仿／异戊醇（２４∶１）抽提，摇匀５～
１０ｍｉｎ，静置分相，４℃离心（１０　０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ），将上清液
转入另一离心管中，重复以上步骤至两相分界明显，取上清
液加入新的１．５ｍＬ离心管中，加入５００μＬ纯异丙醇（－２０℃
冷冻）。沉降ＤＮＡ，轻轻颠倒２～３次，可见白色絮状沉淀，－
２０℃冰箱中静置１５ｍｉｎ，离心（１２　０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ）。加入
５００μＬ７５％乙醇洗涤１次，纯乙醇洗涤１次，１２　０００ｒ／ｍｉｎ离
心５ｍｉｎ，倒掉洗液，通风橱吹干约１ｈ，待总ＤＮＡ干燥后，加
入５０μＬ　ｄｄＨ２Ｏ。
２．３　ＤＮＡ质量检测
将ＤＮＡ提取液稀释１００倍后，用紫外分光光度计观测
在紫外光２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处的吸收值 Ａ２６０、Ａ２８０，并以
Ａ２６０／Ａ２８０的比值鉴定纯度。ＤＮＡ浓度（ｎｇ／μＬ）＝Ａ２６０
×５０μｇ×稀释倍数，结果见表２。采用１．５％琼脂糖电泳，
ＥＢ染色，凝胶成像系统观察并拍照，见图１。
表２　不同提取方法ＤＮＡ质量比较
样品
ＳＤＳ
Ａ２６０ Ａ２８０ Ａ２６０／Ａ２８０ 浓度（ｎｇ／μＬ）
改良ＣＴＡＢ法
Ａ２６０ Ａ２８０ Ａ２６０／Ａ２８０ 浓度（ｎｇ／μＬ）
１　 ０．１９２　 ０．１１８　 １．６２４　 ９６０　 ０．１２８　 ０．０７１　 １．８０２　 ６４０
２　 ０．１９４　 ０．１２３　 １．５７７　 ９７０　 ０．１１８　 ０．０６５　 １．８０８　 ５９０
３　 ０．１９４　 ０．１２０　 １．６１７　 ９７０　 ０．１５１　 ０．０８１　 １．８７５　 ７５５
４　 ０．１８６　 ０．１０２　 １．８１７　 ９３９　 ０．１７２　 ０．０８９　 １．９３４　 ８６０
５　 ０．１７３　 ０．０９８　 １．７６５　 ８６５　 ０．１０４　 ０．０５４　 １．９１６　 ５２０
６　 ０．１９４　 ０．１０７　 １．８１３　 ９７０　 ０．１２０　 ０．０６５　 １．８４４　 ６００
图１　不同提取方法ＤＮＡ凝胶电泳
３　讨论
植物基因组ＤＮＡ质量的好坏决定后续ＰＣＲ实验的成
败，因此，植物基因组ＤＮＡ的提取是分子生药学实验的一
个重要环节。本实验以藏药吉子恩保的原植物甘西鼠尾草
经硅胶快速干燥的新鲜叶片作为供试品材料，提取ＤＮＡ作
为后续ＰＣＲ反应的模板，根据文献报道，本实验尝试用步
骤较为简便的改良ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法分别进行ＤＮＡ的提
取。由表２可知，用ＳＤＳ法提取的ＤＮＡ得率普遍较高，但
是Ａ２６０／Ａ２８０比值多低于１．８，说明提取的ＤＮＡ样品中存
在蛋白质或多酚污染；用改良ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ得率较
低，但Ａ２６０／Ａ２８０比值在１．８左右，说明 ＤＮＡ的纯度较
高。如图１所示，用ＳＤＳ法提取的ＤＮＡ点样孔能看到明显
的亮光，说明样品中含有未去除的蛋白质。
在提取过程中，用改良ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ颜色呈乳
白至透明状，但用ＳＤＳ法提取的ＤＮＡ颜色普遍较深，呈棕
色至深棕色，可能是甘西鼠尾草中酚类及糖类杂质未被除
尽。综合考虑，虽然ＣＴＡＢ法比ＳＤＳ法提取的ＤＮＡ得率
低，但是高纯度的ＤＮＡ才是本实验的目的，因此在这两种
方法中，改良ＣＴＡＢ法是较为理想的提取方法，其它提取方
法的发掘，还有待进一步研究。
参考文献：
［１］　翁裕馨，李成义．中藏药材甘西鼠尾草的研究进展［Ｊ］．中国
民族民间医药，２０１０，１９（３）：１９．
［２］　ＪＩＡＮ　ＹＨ．Ｓｐｅｃｉａｌ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｐｌａｎｔｓ　ｏｆ　Ｒａｄｉｘ　Ｓａｌｖｉａｅ　Ｍｉｌｔｉｏｒ－
ｒｈｉｚａｅ　Ｖａｒｉｅｔｙ　Ｓｏｒｔ　ａｎｄ　Ｑｕｌｉｔｙ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｃｏｍｍｏｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ［Ｍ］．Ｆｕｚｈｏｕ：Ｆｕｊｉａｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈ－
ｎｏｌｏｇｙ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｈｏｕｓｅ，１９９４．
［３］　杨立新，李杏翠，刘超灯，等．甘西鼠尾草中化学成分研究
［Ｊ］．药学学报，２０１１，４６（７）：８１８．
［４］　王利彦，王津慧，吕慧玲，等．甘西鼠尾草的抗缺氧研究［Ｊ］．
四川中医，２００９，２７（４）：４３．
［５］　李旻辉，宋晓玲，肖培根，等．中国鼠尾草属植物传统药物学
的调查［Ｊ］．时珍国医国药，２０１１，２２（２）：４７６．
［６］　黄璐琦．分子生药学［Ｍ］．北京：北京医科大学出版社，２００６．
（责任编辑：魏　晓）
—２１—