全 文 ：Theapoptosisofmulti-drugresistantleukemiacelsinducedbyrealgarnanoparticle
WangYongsheng, YiJuan, ChenJing, WeiHulai＊ , LiHongling1
(SchoolofBasicMedicalScience, LanzhouUniversity, KeyLaboratoryofPreclinicalStudyforNewDrugsofGansuProvince,
Lanzhou730000;1 ThePeoplesHospitalofGansuProvince, Lanzhou730000)
　　Objective:Toexploreapoptosis-inducingefectsoftherealgarnanoparticle(nano-realgar)onmulti-drugresistantleukemiaK562/ADM
cels.Methods:Thenano-realgarwaspreparedviamechanicalmillingusingahigh-energyplanetarybalmill.MTTassaywasusedtodetect
theproliferatingactivityofK562/ADMcels, andthecelularapoptosiswasassedwithAnnexinV/PIdoublestaining.Flowcytometry
(FCM)techniquewasemployedtoassessintracelularBAX, Bcl-2 andP-53 proteinexpressionandtheactivityofCaspase-3.Results:
Nano-realgarsignificantlyinhibitedtheproliferationofK562/ADMcels.K562/ADMcelsweretreatedwith20g/mland50g/mlofnano-re-
algarfor48h, TheapoptoticrateofthecellsdetectedwithAnnexinV/PIstainingwas13.35%and72.70%, respectively.TheP53expres-
sionofproteinintargetcelsobviouslyincreased, from(33.25±0.75)% to(75.55±2.05)% and(87.25±2.15)%.Theexpressionof
BAXproteinincreasedfrom(72.05±0.75)%to(99.05±0.35)% and(99.80±0.01)%, andtheBcl-2proteindisplayedaslightlyin-
crease, theratioofBAXandBcl-2markedlyrise.Aftertreatmentwith20g/mland50g/mlnano-realgarfor24hto48h, Caspase-3activity
ofK562/ADMcelssignificantlyenhanced.Conclusion:Nano-Realgarsignificantlyinducestheapoptosisofmultidrugresistanceleukemia
K562/ADMcells.
Keywords　 realgarnanoparticle(纳米雄黄);multidrugresistance;apoptosis;leukemia
去乙酰紫玉盘素抑制 HepG2细胞增殖和诱导凋亡分化作用 ＊
任凤梅 ,舒秉俊 ,罗时辉 ,王鹰 ,章跃平 ,徐　安
(南昌市第二医院 ,南昌　330003)
　　摘　要　目的:探讨番荔枝内酯单体去乙酰紫玉盘素(Dsacetyluvaricin)体外抑制人肝癌细胞株 HepG2增殖 ,诱导凋亡和分化
的作用。方法:将不同浓度的 Dsacetyluvaricin与 HepG2细胞在体外常规培养 ,应用 MTT比色法 、流式细胞技术 、透射电子显微镜 、荧
光显微镜检测其对细胞增殖的抑制作用 、DNA含量 、细胞周期各时相及细胞超微结构的变化。结果:Dsacetyluvaricin对体外培养的
人肝癌 HepG2细胞的生长增殖具有明显的抑制作用 , 抑制率与剂量和作用时间呈显著正相关关系;能阻滞细胞增殖于 G0-G1期 , 使
S期细胞减少 , 细胞凋亡率增加 ,核质比例下降 , 细胞出现典型的形态学改变。结论:Dsacetyluvaricin对 HepG2细胞存在时间和剂量
依赖性增殖抑制作用 ,可诱导细胞的凋亡 , 提高细胞的分化程度 ,是很有潜力的抗肝癌药物。
　　关键词　番荔枝;dsacetyluvaricin;人肝癌细胞株;细胞凋亡;细胞分化
　　肝癌是临床常见的恶性肿瘤 ,在我国尤其高发。 对于肝癌
的治疗强调综合治疗 , 但仍以手术为最佳治疗手段 , 而对于失
去手术机会的晚期患者则治疗棘手 , 预后很差 , 常规药物和手
段的作用有限。番荔枝内酯(Annonaceousacetogenins, AAs)是
继紫杉醇后又一个有前途的 、天然来源的抗肿瘤化合物 [ 1] , 被
喻为明日抗癌之星。我们从番荔枝种子中得到 3个番荔枝
内酯类单体化合物 , 通过药敏筛选实验发现番荔枝内酯单体
Desacetyluvaricin(去乙酰紫玉盘素)具有很强的体外细胞毒活
性 , 但其抗肿瘤的作用机制尚不明确 , 本研究拟观察 Desacetylu-
varicin抑制人肝癌 HepG2细胞生长增殖 、诱导凋亡及分化的作
用 , 现将实验结果报道如下。
1　材料和方法
1.1　试验药物 　 Desacetyluvaricin, 本课题组从番荔枝种子中
提取分离所得 ,白色蜡状粉末 ,分子式 C37H66O6 , 使用前以少许
无水乙醇溶解 , 加培养液配成所需浓度 , 乙醇终浓度不超过
1%。氟尿嘧啶(5-FU), 250mg/10ml/支 , 天津金耀氨基酸有限
公司 ,批号:0903028。
1.2　癌株　肝癌 HepG2细胞株 ,由军事医学研究院实验室惠
赠。
1.3　试剂 　 RPMI-1640,美国 GIBCO公司。新生牛血清 , 杭州
四季青生物制品公司产品。二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮
唑蓝(MTT),美国 Sigma公司产品。姬姆萨染液 , 南京建成生物
工程研究所产品。
1.4　仪器 　 SPECTRAmax340微孔板式连续光谱测读仪 , 美
国分子仪器公司。荧光倒置生物显微镜 ,德国 Zeiss产品。二氧
化碳培养箱 , 日本 Hirasawa公司。 FACSCalibur流式细胞仪 , 美
36 中药药理与临床 2010;26(5)
＊ 基金项目:江西省卫生厅中医药科研基金课题(课题编号:2009A075)
DOI :10.13412/j.cnki.zyy l.2010.05.024
国 BD公司生产。 Tecnail2Biotwin透射电子显微镜 ,荷兰 PHIL-
IPUS公司产品。
1.5　方法
1.5.1　 MTT比色实验 　取对数生长期HepG2细胞 ,用 0.25%
胰蛋白酶消化后 , 用含 10%新生牛血清的 RPMI-1640培养液将
细胞悬液稀释至 8×104个 /ml,接种于 96孔培养板每孔细胞悬
液 200μl, 待细胞贴壁后吸弃培养液 , 实验组分别加入含有不同
浓度 Desacetyluvaricin(终浓度分别为 6.25μg/ml、 12.5μg/ml、
25μg/ml、50μg/ml)的 RPMI-1640培养液 200μl, 另设氟尿嘧啶
对照组(250μg/ml)和空白对照组(加等量完全培养液)。调零
孔不加细胞 , 只加 200μl完全培养液。每种浓度设 4个平行孔 ,
常规培养 24、48、72小时后 , 于每孔中加入 MTT溶液(5mg/ml)
20μl继续培养 4小时 , 终止培养后 , 小心吸弃孔中液体 , 加入
150μlDMSO/孔 , 微型震荡器震荡约 15分钟 , 使结晶物充分溶
解后 , 于微孔板式连续光谱测读仪 490nm波长处 , 测定各孔吸
光度OD值 , 调零孔只含有 DMSO(加 MTT之前用荧光倒置生物
显微镜观察各组培养孔内细胞形态结构的变化 , 并拍照)。肿
瘤细胞生长抑制率(%)=(1-实验组 OD值 /空白对照组 OD
值)×100%。改进寇氏法计算半数抑制浓度(IC50)。
1.5.2　流式细胞仪分析 　HepG2细胞常规培养至对数生长
期 , 更换新鲜的含 10%血清的培养液 , 根据 MTT实验筛选的结
果采用适宜的药物浓度处理细胞 ,分别于药物作用 12、 24、36小
时后 , 分别收集处理组和对照组细胞 1 ×106 个 /ml, 离心
1500rpm5min, 弃上清 , 用 PBS洗 2次 , 70%冰乙醇固定 , 4℃保
存。上机前用 PBS洗 2次弃固定液 , 加含有 RnaseA的 PI染液
避光反应 30min,上流式细胞仪检测。每次计数细胞 10000个 ,
用多参数细胞分析软件处理测定结果 ,对各样本进行 DNA含量
及细胞周期分析 , 计算凋亡率。
1.5.3　透射电镜观察　收集处于对数生长期的细胞 , 接种于
T-25培养瓶内 , 24h后换上含药的培养液 ,继续培养 36h后 , 弃
去瓶中培养液 , 用细胞刮刀将单层细胞从瓶底刮下 , 用吸管将
细胞移入 10ml尖底离心管中 , 加 4℃预冷的 PBS至 10ml并用
吸管轻轻吹打均匀 , 然后以 1500rpm离心 10min, 吸弃上清液 ,
使离心管倾斜一定角度 ,用吸管沿管壁缓缓加入 4℃预冷的 2%
戊二醛 ,置 4℃冰箱固定 2h。然后用探针拨离细胞团块 , 移入青
霉素小瓶中 ,在 4℃用 PBS漂洗 3次 , 每次 10min。 再用 1%锇
酸在 4℃固定 30min, 接着用 PBS漂洗 3次 ,梯度乙醇脱水 , 环氧
树脂包埋 ,超薄切片机切片 , 醋酸铀和枸橼酸铅双重染色 , 置电
镜下观察并摄影。
1.5.4　对细胞核质比的影响　取对数生长期 HepG2细胞分别
于药物处理 12、 24、 36小时后收集细胞于 10ml离心管中 , 以
1000rpm离心 10min, 吸净上清液。 逐滴加入 2ml预温 37℃的
0.4%KCl混匀 ,用吸管轻轻吹打均匀 , 37℃孵育 20min。向管中
加入 1ml新鲜固定液 , 1000rpm离心 10min, 吸净上清液。沿管
壁缓缓加入新鲜固定液 8 ～ 10ml, 用吸管吹打均匀 , 固定 15min
后 , 1000rpm离心 10min, 吸净上清液。缓缓加入新鲜固定液 8
～ 10ml, 用吸管吹打均匀 ,固定 30min。离心 ,吸净上清液 ,视细
胞量加入 0.5 ～ 1.0ml新鲜固定液 , 吹打均匀。取 4℃的载玻
片 ,在距离玻片 15cm高度 , 向玻片滴 3滴细胞悬液 , 于空气中
干燥。用新鲜的姬姆萨染液染 10min, 流水冲洗 , 晾干。二甲苯
透明 3次 , 中性树胶封片。在镜下选择细胞分散良好 , 不重叠 、
无失散的标本 ,于荧光显微镜下观察 、摄像 ,用 Image-ProPlus图
像分析软件进行图像分析。
2　结果
2.1　去乙酰紫玉盘素抑制 HepG2细胞增殖 　各种浓度(μg/
ml)Desacetyluvaricin作用于 HepG2细胞不同时间的抑制率
(%)见表 1。随着药物浓度的增大 、作用时间的延长 , Desacety-
luvaricin对细胞的抑制作用不断增强 , 48小时 IC50为 23.79μg/
ml。其中 50μg/ml浓度作用 24小时和 48小时的抑制率显著高
于氟尿嘧啶组(P<0.05),显示出了较强的抗肿瘤活性。
　　表 1　 Desacetyluvaricin对人肝癌细胞株 HepG2增殖的影响( x±s)
组别 浓度(μg/ml)
24h
OD值(x±s) 抑制率
48h
OD值(x±s) 抑制率
72h
OD值(x±s) 抑制率
空白组　　　 0.265±0.006 0.350±0.000 0.420±0.000
Desacetyluvaricin 6.25 0.230±0.000＊ 14.81% 0.280±0.016 ＊ 20.00% 0.275±0.010＊■ 34.52%
12.5 0.218±0.015＊ 19.44% 0.225±0.006＊ 35.71% 0.235±0.010＊ 44.05%
25 0.200±0.000＊ 25.93% 0.223±0.005＊ 36.43% 0.223±0.005＊ 47.02%
50 0.140±0.014＊■ 48.15% 0.123±0.015＊■ 65.00% 0.113±0.019＊ 73.21%
氟尿嘧啶　　 250 0.240±0.014 11.11% 0.208±0.005 ＊ 40.71% 0.130±0.012＊ 69.05%
　　与空白对照比较 ＊P<0.05,与氟尿嘧啶组比较 ■ P<0.05
　　在荧光倒置生物显微镜下 ,放大 200倍观察 96孔板孔中细
胞 , 可见加药组细胞逐渐变圆 , 脱壁 ,细胞间接触变松 , 胞浆中颗
粒增多 , 增殖变慢 ,细胞周围碎片增多;空白组细胞呈上皮型贴
壁生长 , 细胞轮廓清楚 , 细胞间接触紧密 , 细胞生长旺盛(见图
1)。表明 Desacetyluvaricin可明显抑制体外人肝癌 HepG2细胞
的生长。
2.2　去乙酰紫玉盘素诱导 HepG2细胞凋亡 　Desacetyluvaricin
(50μg/ml)作用不同时间细胞的周期和凋亡率变化见表 2, 可以
空白组 48h　　　　　　Desacetyluvaricin50μg/ml作用 48h
图 1　细胞形态学改变
37中药药理与临床 2010;26(5)
看出 , 细胞的凋亡率与作用时间呈正相关 , 其中 50μg/
mlDesacetyluvaricin处理 HepG2细胞 36h后 , 大多数细胞积聚在
G0-G1期 , 凋亡率为 24.22%。与空白对照组比较 G0-G1期细
胞增加约 10.47%, S期的细胞减少约 15.22%。在 DNA直方图
上(见图 2),用药组显示在 G0-G1峰前出现一个 DNA含量减少
的亚二倍体峰 ,即典型的凋亡细胞峰 , 可见 Desacetyluvaricin能
阻滞细胞周期 , 抑制细胞的 DNA合成 , 诱导细胞凋亡。
　　表 2　细胞周期及凋亡率分析(%)
分组 时间(h)DipG0-G1 DipG2-M DipS Apoptosis
空白对照 56.67% 9.86% 33.47% 0.46%
Desacetyluvaricin 12 58.37% 14.09% 27.54% 15.05%
　　　　　 24 60.03% 12.30% 27.68% 20.59%
　　　　　 36 67.14% 14.61% 18.25% 24.22%
　　　　　　　　　　　空白组 　　　　　　　　 Desacetyluvaricin作用 12小时　　　　 Desacetyluvaricin作用 24小时 　　Desacetyluvaricin作用 36小时
(Apo:0.46%)　 (Apo:15.05%)　 (Apo:20.59%)　 (Apo:24.22%)
图 2　DNA直方图
　　透射电镜观察(图 3)可见 ,空白对照组细胞胞体光滑 ,胞质
密度高 , 细胞器亚微结构清晰 , 染色质均匀分散 、密度一致 ,核仁
大且完整;而经 50? g/mlDesacetyluvaricin处理的细胞发生皱
缩 、起泡 ,染色质凝聚 ,核膜消失或突起呈小泡样 , 核质浓缩 , 发
生碎裂 ,形成凋亡小体。
　　　　　　　　空白组 R×6000　　　　　作用 36hR×10K　　　　作用 36hR×5000　　　　作用 36hR×5000
图 3　细胞形态学改变
2.3　去乙酰紫玉盘素诱导 HepG2细胞分化　Desacetyluvaricin
对细胞核质比的影响见表 3, 可以看出:随着作用时间的延长 ,
细胞的核质比例逐渐降低。作用 24h和 36h的核质比与空白对
照组比较差异均有统计学意义(P<0.05), 表明 Dsacetyluvaricin
可诱导 HepG2细胞分化。
　　表 3　Desacetyluvaricin对细胞核质比的影响( x±s)
组别 时间(h) 核质比　　　
空白 0.8902±0.2810
Desacetyluvaricin 12 0.8396±0.3635
　　　　　　　　 24 0.5742±0.2027＊
　　　　　　　　 36 0.5312±0.1867＊
　　与空白组比较 ＊P<0.05
3　讨论
　　番荔枝内酯类化合物是目前报道中体内外抗癌活性最强的
化合物之一 , 自 1982年 Jolad等 [ 2]从番荔枝科紫玉盘属植物
Uvariaacuminata根中分离得到第一个番荔枝内酯化合物 Uvari-
cin, 并发现它对小鼠白血病细胞 3PS(invivo)有强杀伤作用以
来 , 其研究进展很快 , 至今已发现这类化合物近 400种 , 它们大
多对肿瘤细胞普遍具有强大的细胞毒作用 ,同时它不是广泛细
胞的毒剂,具有对不同肿瘤细胞株的毒性选择性 [ 3] 。 本研究
通过 MTT比色实验发现 , Desacetyluvaricin作用于人肝癌 HepG2
细胞 ,能显著抑制细胞的生长增殖 , 且抑制率的高低有浓度和时
间的依赖性 ,随着药物浓度的增大 、作用时间的延长 , Desacetylu-
varicin对细胞的抑制作用也不断增强 , 其中 50μg/ml作用细胞
24小时和 48小时的抑制率优于 5-FU(P<0.05), 72小时的抑
制率达 73.21%,显示出了较强的细胞毒活性。
　　本实验通过 FCM检测药物作用肝癌细胞不同时间后细胞
周期 、DNA含量 、凋亡率的变化 ,结果表明 Desacetyluvaricin可诱
导细胞凋亡 , 50μg/mlDesacetyluvaricin处理 HepG2细胞 36h后 ,
大多数细胞积聚在 G0 ～ G1期 , 细胞凋亡率为 24.22%, 与空白
对照组比较 S期细胞明显减少 , 可见 Desacetyluvaricin阻滞细胞
周期 ,抑制细胞的 DNA合成 ,促进细胞凋亡是其抗肝癌作用的
38 中药药理与临床 2010;26(5)
重要机制。
　　虽然肿瘤细胞由于某种原因发生分化阻断或分化异常 , 但
仍然具有和正常细胞相同的分化潜能 ,因而有可能在分化诱导
作用下被诱导分化转为良性细胞。基于此 , 近年来诱导肿瘤细
胞分化的治疗研究为肿瘤治疗开辟了一条崭新的途径。诱导分
化治疗不同于以往的肿瘤治疗途径 , 它的目的不在于杀灭肿瘤
细胞 , 而在于改造肿瘤细胞 , 诱导肿瘤细胞分化为正常或接
近正常细胞。研究表明 [ 4] , 肝癌和非实体瘤一样 ,其癌细胞亦可
在分化诱导剂的作用下向正常细胞转化。本实验研究发现人肝
癌 HepG2细胞经 Desacetyluvaricin处理后 , 细胞的体积缩小 , 核
缩小 , 细胞的核质比例显著降低 , 表明 Desacetyluvaricin具有诱
导肝癌细胞分化的作用。
　　番荔枝内酯的作用靶点为肿瘤细胞的线粒体 , 番荔枝内酯
能引起细胞内活性氧的增加和线粒体膜电位的降低 [ 5] , 活性氧
的大量释放和线粒体膜电位的降低均能引起 caspase-9的释放 ,
从而激活 caspase-3, 活化的 caspase-3使其底物 PARK降解 , 从
而诱导了肿瘤细胞的凋亡。 另有报道番荔枝内酯通过细胞内
cAMP和 cGMP水平的降低而诱导了凋亡 [ 6] 。本实验证实了番
荔枝内酯 Desacetyluvaricin能够以较低浓度在体外抑制人肝癌
HepG2细胞的生长增殖并诱导其发生凋亡和分化。因此 , 番荔
枝内酯 Desacetyluvaricin具有非常好的开发应用前景 , 可能成为
一种新型的抗癌药物。 关于其诱导肝癌细胞凋亡和分化的机
制 , 有待于下一步在分子水平上加以深入研究 , 为番荔枝内酯在
肝癌治疗中的应用提供更充分的证据。
参考文献
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cAMPandcGMPlevelsinhumanhepatoma2.2.15cels.BiochemPharma-
col, 2003;65(3)∶ 319 ～ 327
Efectofdesacetyluvaricinonproliferation, apoptosisanddiferentiation
ofhumanhepatocarcinomacellineHepG2invitro
RenFengmei, ShuBingjun, LuoShihui, WangYing, ZhangYueping, XuAn
(SecondHospitalofNanchang, Nanchang　330003)
　　Objective:Toinvestigatetheefectofdesacetyluvaricinonproliferation, apoptosisanddifferentiationofhumanhepatocarcinomacel
lineHepG2 invitro.Methods:DifferentconcentrationsofdesacetyluvaricinandthediferenttimeofcultivationwereusedtotreatHepG2
cels.ProliferationinhibitoryratewasevaluatedbyMTTassay, DNAcontent, cellcycleandsuper-microstructurewereobservedthroughflow
cytometry, electronicmicroscopeandfluorescencemicroscope.Results:DesacetyluvaricincouldinhibitHepG2 cellproliferationviability
withinacertainrangeoftreatingtimeanddoes.AmajorityofHepG2 celswerearrestedinG0-G1phaseandaprogressivedeclineofcells
wasseeninSphase.Theapoptosisratewasincreasedandnucleo-cytoplasmicratiowasdecreasedofHepG2cells.TheHepG2celsapoptosis
wasconfirmedbyceltypicalcellmorphology.Conclusion:Desacetyluvaricinhaveatimeanddoes-dependentgrowthinhibitioneffectand
caninduceapoptosis, increasethedifferentiationdegreeofHepG2 cells.
Keywords　 AnnonasquamosaL.;desacetyluvaricin;hepatomacarcinomacelline;apoptosis;diferentiation
钩藤碱的降压及舒张血管作用
张丽心 , 孙　涛 , 曹永孝＊
(西安交通大学医学院药理学系 ,西安 　710061)
　　摘　要　目的:研究钩藤碱对大鼠的降压及扩张血管作用及机制。方法:颈动脉插管法测量血压;小血管张力测量系统记录
离体动脉血管环的张力;激光共聚焦技术观察钩藤碱对大鼠肠系膜动脉环中 [ Ca2+] i及其动态变化的影响。结果:钩藤碱 20mg/kg
静脉注射能降低大鼠血压 13% ～ 24%, 钩藤碱 10-4 ～ 10-3mol/L能使 K+、苯肾上腺素 、U46619和 5-HT预收缩的大鼠肠系膜动脉 、冠
39中药药理与临床 2010;26(5)
＊ 通讯作者