全 文 ：＊通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｎｄａｂｌｔ＠１６３．ｃｏｍ
收稿日期：２０１１－１０－１４；修回日期：２０１２－０２－１７
基金项目：新疆农业大学草业科学重点学科（ＸＪＣＹＱ－２０１１－
０１）；新 疆 高 新 技 术 课 题 （２０１１１１１２２）；新 疆 高 校 科 研 计 划
（ＸＪＥＤＵ２００５Ｓ０６、ＸＪＥＤＵ２００６Ｓ１８）资助
作者简介：李培英（１９７５－ ），女，内蒙古察右前旗人，副教授，博
士，２０１０年毕业于新疆农业大学，主要从事草坪学教学与科研工作，
发表论文３０余篇．
文章编号：１６７３－５０２１（２０１２）０３－００１２－０９
偃麦草种质资源遗传多样性的ＲＡＰＤ分析
李培英１，孙宗玖１，朱　昊１，２，阿不来提１，＊
（１．新疆农业大学草业与环境科学学院／新疆草地资源与生态自治区重点实验室，新疆　乌鲁木齐　８３００５２；
２．新疆畜牧科学院草业研究所，新疆　乌鲁木齐　８３００００）
　　摘要：通过对ＤＮＡ提取方法及ＲＡＰＤ反应体系进行探讨，建立了适应偃麦草基因组ＤＮＡ提取的方法及优化的
ＲＡＰＤ反应体系。在此基础上，依据Ｊａｃｃａｒｄ相似系数，采用 ＵＰＧＭＡ方法进行聚类，判定３２份偃麦草种质材料间
的亲缘关系及遗传多样性。结果表明：（１）改良常规ＣＴＡＢ法，即对样品先进行洗涤并提高ＣＴＡＢ含量到３％可提
高偃麦草ＤＮＡ的提取质量。（２）对１００条随机引物进行筛选，共筛选出１８条多态性高、重复性好的随机引物，以此
对３２份材料进行ＰＣＲ扩增，共扩增出２６４条带，多态性条带为９３．７％。（３）以遗传相似系数为依据，对３２份偃麦草
材料进行聚类分析，在相似系数为０．３７３处可将供试偃麦草种质资源划分为５大类群。
关键词：偃麦草；新疆；ＲＡＰＤ；遗传多样性
中图分类号：Ｓ５４３　　　文献标识码：Ａ
　　偃麦草（Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ）是多年生草本，国外
主要分布在蒙古、前苏联的中亚和西伯利亚、日本、
朝鲜等国家和地区，在我国主要分布于新疆、青海、
甘肃等省区，东北、内蒙古、西藏等地也有分布［１］。
据资料［２］，新疆有偃麦草属植物７种１变种，包括中
间偃麦草（Ｅ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、偃麦草（Ｅ．ｒｅｐｅｎｓ）、毛
偃麦草（Ｅ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　ｓｕｂｓｐ．ｔｒｉｃｈｏｐｈｏｒａ）、长穗
偃麦草（Ｅ．ｅｌｏｎｇａｔａ）、多花偃麦草（Ｅ．ｒｅｐｅｎｓ　ｓｕｂｓｐ．
ｅｌｏｎｇａｔｉｆｏｒｍｉｓ）、费尔干偃麦草（Ｅ．ｆｅｒｇａｎｅｎｓｉｓ）、
曲芒偃麦草（Ｅ．ａｅｇｉｌｏｐｏｉｄｅｓ）、芒偃麦草（Ｅ．ｒｅ－
ｐｅｎｓ　ｓｕｂｓｐ．ｌｏｎｇｅａｒｉｓｔａｔａ）。但也有研究认为，我国
生长的仅有（蔓生）偃麦草１种，其余均为引种栽培
的杂交材料或优良牧草，虽有在我国野外采集到毛
偃麦草和中间偃麦草的报道，认为可能是引种扩散
所致［３］。２００６年，课题组对新疆野生偃麦草资源进
行调查研究，采集了４２份野生材料，经田间种植、分
类鉴定，认为其均属于偃麦草，但其形态［４］、坪用性
能［５］存在较大变异，对其遗传多样性进行分析可为
育种策略的选择奠定基础。
国外２０００年后就有利用 ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ技术
研 究 当 地 偃 麦 草 种 质 资 源 遗 传 多 样 性 的 报
道［６～８］，而国内仅有采用ＳＳＲ标记对国外引进的
偃麦草属资源（包括中间偃麦草、偃麦草、长穗偃
麦草等）等进行遗传多样性分析的报道［９］，对国
内偃麦草种质资源遗传多样性还没有系统的研
究报道。为了进一步了解偃麦草在 ＤＮＡ分子水
平的遗传差异，本研究拟对新疆农业大学收集的
３２份偃麦草材料进行 ＲＡＰＤ分析，确定优化的
ＰＣＲ扩增反应体系，以期为今后的育种工作奠定
基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试材料包括从新疆不同地域采集的２７份野
生偃麦草及从北京农林科学院引进的５份偃麦草材
料，共计３２份。２００６年利用营养体在新疆农业大
学建立原始材料圃，次年于供试材料分蘖－拔节期
取其叶片进行ＲＡＰＤ分析，材料的具体情况见表１。
１．２　ＤＮＡ提取及质量鉴定
参考《精编分子生物学实验指南》（第四版）的
ＣＴＡＢ法［１０］并进行适当改动，具体为：选取幼嫩的
偃麦草叶片，液氮研磨成粉末后转入１．５ｍｌ离心
管中，加入１ｍｌ洗涤液，混匀后６５℃水浴１０ｍｉｎ，
４℃下１２００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液，重复洗涤１
次。然后加入６５℃预热的３×ＣＴＡＢ进行ＤＮＡ抽
提。
—２１—
第３４卷　第３期　　　　　　　　　　中　国　草　地　学　报　　　　　　　　　　２０１２年５月
　　Ｖｏｌ．３４　Ｎｏ．３　　　　　　　　　　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ　　　　　　　　　　 Ｍａｙ　２０１２　　
表１　供试偃麦草材料编号及其来源
Ｔａｂｌｅ　１　Ｃｏｄｅ　ａｎｄ　ｏｒｉｇｉｎｓ　ｏｆ　Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ
编号
Ｎｕｍｂｅｒ
采集地点或引种地
Ｃｏｌｅｃｔｉｎｇ　ｏｒ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｓｉｔｅ
经度
Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
纬度
Ｌａｔｉｔｕｄｅ
海拔（ｍ）
Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ
生境
Ｉｎｈａｂｉｔ
Ｅ０３ 阿勒泰北屯镇 ８７°４８′ ４７°２２′ ５５２ 杨树林边
Ｅ０４ 阿勒泰布尔津县 ８６°５３′ ４７°４２′ ４５６ 水渠边
Ｅ０６ 阿勒泰福海县 ８７°２７′ ４７°１３′ ４８９ 沙枣防风林内
Ｅ０７ 阿勒泰哈巴河县 ８６°２６′ ４８°０４′ ５４４ 农田边
Ｅ０８ 阿勒泰红敦乡 ８８°１４′ ４７°４３′ ７４１ 路边
Ｅ０９ 阿勒泰喇玛昭乡 ８８°２３′ ４７°４５′ ８８８ 水渠边
Ｅ１０ 阿勒泰喇玛昭乡 ８８°１１′ ４７°１７′ ５５６ 额河旁边
Ｅ１１ 阿勒泰市桦林公园 ８８°０７′ ４７°５２′ ９３６ －
Ｅ１２ 乌鲁木齐后峡乡 ８７°１２′ ４３°１９′ １９５０ 封育草地
Ｅ１３ 乌鲁木齐永丰乡 ８７°２９′ ４３°４３′ １１２０ 农田边
Ｅ１４＊ 北京市农林科学院 － － － －
Ｅ１５＊ 北京市农林科学院 － － － －
Ｅ１６＊＊ 乌鲁木齐南山 － － － 旱地选育
Ｅ１７＊ 北京市农林科学院 － － － －
Ｅ１８＊＊ 昌吉呼图壁县 － － － 旱地选育
Ｅ１９ 乌鲁木齐三坪农场 － － － －
Ｅ２０ 哈密伊吾乡 － － － －
Ｅ２１＊ 北京市农林科学院 － － － －
Ｅ２５ 阿勒泰福海县 ８７°３０′ ４７°０７′ ４９４ 农田边
Ｅ２７ 焉耆县四十里城 － － － 农田边
Ｅ２８ 阿勒泰北屯镇 ８７°４８′ ４７°２２′ ５５２ 额河杨树林封育区
Ｅ２９ 阿勒泰哈巴河县 ８６°２０′ ４８°０６′ ５１５ 哈巴河边
Ｅ３０ 阿勒泰布尔津县 ８６°５２′ ４７°４３′ ４８０ 农田边
Ｅ３１ 焉耆县四十里城 － － － 路边
Ｅ３２＊ 北京市农林科学院 － － － －
Ｅ３３＊＊ 昌吉呼图壁县 － － － －
Ｅ３４＊＊ 乌鲁木齐市南山 － － － －
Ｅ３７ 库尔勒阿瓦提乡 － － － 果园内
Ｅ３８ 和田民丰县 － － － －
Ｅ３９ 焉耆县霍拉山沟 － － － －
Ｅ４２ 伊犁昭苏 ８１°００′ ４３°０７′ １８７０ 河岸边
Ｅ４４ 乌鲁木齐市雅山 － － － －
　　注：＊为引种，＊＊为多年驯化。
Ｎｏｔｅ：＊ ｍｅａｎ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，＊ ＊ ｍｅａｎ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ．
　　取３μｌ的ＤＮＡ样品加入等体积溴酚蓝－蔗糖
上样缓冲液（４０％蔗糖、０．２５％溴酚蓝），混合后点入
含１μｇ／ｍＬ　ＥＢ的１．０％琼脂糖凝胶中，ＴＢＥ为电泳
缓冲液，８０Ｖ电压下电泳，于凝胶成像仪上观察、拍
照，检测提取的基因组ＤＮＡ的完整性。
取ＤＮＡ样品用ＴＥ缓冲液稀释２００倍，在紫外
可见分光光度计上读取 ＤＮＡ 样品在 ２６０ｎｍ、
２８０ｎｍ的吸光值（ＯＤ）。ＤＮＡ 样品浓度（μｇ／ｍＬ）
＝５０×ＯＤ２６０×稀释倍数，根据ＯＤ２６０／ＯＤ２８０的比值
计算ＤＮＡ样品的纯度，比值大于１．８为合格样品。
—３１—
李培英　孙宗玖　朱　昊　阿不来提　　　偃麦草种质资源遗传多样性的ＲＡＰＤ分析
１．３　ＲＡＰＤ反应体系的优化
采用五因素五水平二次通用旋转组合设计（表
２），研究ＤＮＡ模板、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、Ｔａｑ酶用量及随
机引物浓度５个主要因素对ＲＡＰＤ反应的影响，确
定优化反应条件。实验反应体系总体积为２５μｌ。
当ＰＣＲ反应体系中各成分添加完后，放入Ｂｉｏｍｅｔｒａ
Ｔ－ｇｒａｄｉｅｎｔ热循环仪，采用如下程序进行ＰＣＲ扩
增：９４℃预变性３ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，３７℃退火
１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，共４５个循环；最后７２℃延伸
１０ｍｉｎ；４℃保存。取４μｌ扩增产物添加等量的上样
缓冲液，采用１×ＴＢＥ为电极缓冲液，１０％非变性连
续聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，１２０Ｖ稳压电泳２ｈ，银
染显色。在Ｘ胶片观察灯上读带、拍照，根据试验
处理中清晰可辨条带数多少、扩增的重复性和稳定
性来判定试验处理的优劣，条带多、重复性好、稳定
性高的得分高，确定最佳ＰＣＲ反应条件。
表２　五因素五水平的旋转设计组合
Ｔａｂｌｅ　２　Ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｉｖｅ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｆｉｖｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ｒｏｔａｔｉｏｎ　ｄｅｓｉｇｎ
编号
Ｃｏｄｅ
氯化镁
ＭｇＣｌ２（ｍｍｏｌ／Ｌ）
脱氧核苷三磷酸
ｄＮＴＰ（ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｔａｑ酶
Ｔａｑ　ｅｎｚｙｍｅ（Ｕ）
ＤＮＡ模板
ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ（ｎｇ）
引物
Ｐｒｉｍｅｒ（μｍｏｌ／Ｌ）
１　 ３．０　 ０．４　 １．２　 ３５　 ０．８
２　 ３．０　 ０．４　 １．２　 １５　 ０．４
３　 ３．０　 ０．４　 ０．８　 ３５　 ０．４
４　 ３．０　 ０．４　 ０．８　 １５　 ０．８
５　 ３．０　 ０．２　 １．２　 ３５　 ０．４
６　 ３．０　 ０．２　 １．２　 １５　 ０．８
７　 ３．０　 ０．２　 ０．８　 ３５　 ０．８
８　 ３．０　 ０．２　 ０．８　 １５　 ０．４
９　 ２．０　 ０．４　 １．２　 ３５　 ０．４
１０　 ２．０　 ０．４　 １．２　 １５　 ０．８
１１　 ２．０　 ０．４　 ０．８　 ３５　 ０．８
１２　 ２．０　 ０．４　 ０．８　 １５　 ０．４
１３　 ２．０　 ０．２　 １．２　 ３５　 ０．８
１４　 ２．０　 ０．２　 １．２　 １５　 ０．４
１５　 ２．０　 ０．２　 ０．８　 ３５　 ０．４
１６　 ２．０　 ０．２　 ０．８　 １５　 ０．８
１７　 １．５　 ０．３　 １．０　 ２５　 ０．６
１８　 ３．５　 ０．３　 １．０　 ２５　 ０．６
１９　 ２．５　 ０．１　 １．０　 ２５　 ０．６
２０　 ２．５　 ０．５　 １．０　 ２５　 ０．６
２１　 ２．５　 ０．３　 ０．６　 ２５　 ０．６
２２　 ２．５　 ０．３　 １．４　 ２５　 ０．６
２３　 ２．５　 ０．３　 １．０　 ５　 ０．６
２４　 ２．５　 ０．３　 １．０　 ４５　 ０．６
２５　 ２．５　 ０．３　 １．０　 ２５　 ０．２
２６　 ２．５　 ０．３　 １．０　 ２５　 １．０
２７　 ２．５　 ０．３　 １．０　 ２５　 ０．６
２８　 ２．５　 ０．３　 １．０　 ２５　 ０．６
２９　 ２．５　 ０．３　 １．０　 ２５　 ０．６
３０　 ２．５　 ０．３　 １．０　 ２５　 ０．６
３１　 ２．５　 ０．３　 １．０　 ２５　 ０．６
３２　 ２．５　 ０．３　 １．０　 ２５　 ０．６
　　注：表中数值为各因素的最终浓度或者２５μｌ反应体系中的量。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ　ｄａｔａ　ｏｆ　ｔａｂｌｅ　ｍｅａｎｓ　ｔｈｅ　ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｖｅｒｙ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｅｖｅｒｙ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　２５μｌ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ．
１．４　数据分析
对供试样品的谱带迁移率按从小到大顺序编
号。出现某一条带记录为１，不出现记录为０，统计
位点总数和多态位点比例，采用 ＮＴＳＹＳ－ｐｃ　Ｖｅｒ－
—４１—
中国草地学报　２０１２年　第３４卷　第３期
ｓｉｏｎ　２．１０ｔ统计分析软件，计算材料间的Ｊａｃｃａｒｄ系
数。根据Ｊａｃｃａｒｄ相似系数，采用不加权成对算术
平均法（ＵＰＡＭＡ）进行聚类分析。
２　结果与分析
２．１　ＤＮＡ的提取
通过预实验发现，常规ＣＴＡＢ法无法获得较高
质量的偃麦草基因组ＤＮＡ。本研究对提取方法进行
改良，结果发现先对样品进行洗涤，并将ＣＴＡＢ含量
由２％提高到３％，可以提高其基因组ＤＮＡ的提取质
量。采用１０份偃麦草供试材料对改良的ＣＴＡＢ法进
行验证（图１），可以看出采用改良后的ＣＴＡＢ法进行
偃麦草ＤＮＡ提取效果较好，条带比较清晰，并且无弥
散现象，说明提取的 ＤＮＡ比较完整，无降解且无
ＲＮＡ污染。点样口无亮斑，说明基本没有蛋白质残
留，质量比较好，可以用于下一步ＰＣＲ实验。
图１　改良ＣＴＡＢ法提取偃麦草部分材料ＤＮＡ的电泳图谱
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｍａｐ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐａｒｔｓ　ｏｆ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｏｆ　Ｅ．ｒｅｐｅｎｓ　ｂｙ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ
２．２　偃麦草ＲＡＰＤ体系优化与建立
２．２．１　偃麦草ＲＡＰＤ体系优化
任意选取Ｓ５０１～Ｓ５１０这一组中３条引物Ｓ５０１、
Ｓ５０２和Ｓ５１０，以Ｅ２０（提取的ＤＮＡ质量较好）作为供试
材料进行３组二次通用旋转组合试验，并通过扩增所
获得的清晰可辨的条带数的多少，扩增的重复性和稳
定性来判定ＰＣＲ反应体系的优劣。重复试验发现，在
３２个处理组合中（图２），２４号、２６～３２号处理清晰可辨
的条带数较多，为１１～１２条，且扩增结果较稳定，其他
处理条带数较少，甚至有的仅有１条。
图２　偃麦草ＲＡＰＤ体系优化电泳图谱
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｍａｐ　ｏｆ　Ｅ．ｒｅｐｅｎｓ　ｏｎ　ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　ＲＡＰＤ　ｓｙｓｔｅｍ
—５１—
李培英　孙宗玖　朱　昊　阿不来提　　　偃麦草种质资源遗传多样性的ＲＡＰＤ分析
　　以扩增得到的清晰可辨的条带数为其得分值，
在ＤＰＳ软件中输入不同组合试验得分值进行回归
分析。经过α＝０．１０显著水平剔除不显著项后，可
获如下方程：
Ｙ＝１１．７５＋０．８３Ｘ３＋０．２５Ｘ４＋１．００Ｘ５－２．００Ｘ２１－
２．７５Ｘ２２－２．００Ｘ２３－０．７５０００Ｘ２４－１．５００００Ｘ２５－０．２５Ｘ１Ｘ２－
０．２５Ｘ１Ｘ３ ＋０．２５Ｘ１Ｘ５ ＋０．５０Ｘ２Ｘ４ －０．３８Ｘ２Ｘ５ ＋
０．２５Ｘ４Ｘ５，且在各水平编码值均为０的情况下获得Ｙ
的最大值，为１１．７５。因此，确定偃麦草提取优化的
反应体系为：１０×Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μｌ、ＭｇＣｌ２ 终浓度
２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ终浓度０．３ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔａｑ酶用
量１Ｕ、ＤＮＡ模板２５ｎｇ、随机引物终浓度０．６μｍｏｌ／Ｌ，
添加ｄｄＨ２Ｏ　１３．１μｌ，总体积２５μｌ。
从上述回归方程可知，在实验的５个因素中
Ｔａｑ酶用量、ＤＮＡ模板量以及引物浓度对实验结果
有很大影响。特别是 Ｔａｑ酶用量和引物浓度回归
系数的值分别为０．８３与１．００，显著大于ＤＮＡ模板
量的回归系数０．２５。因此，今后实验中更应该考虑
上述两因素的优化。
２．２．２　随机引物筛选
通过对１００条随机引物进行筛选，共筛选出１８
条多态性高、重复性好的随机引物（表３），以此对供
试３２份材料进行ＰＣＲ扩增。由电泳扩增图谱可
知，１８条引物扩增的条带数因引物和材料的不同而
不同。统计结果表明，每条引物扩增的条带数在８
～１８条之间，其中引物Ｓ７、Ｓ５０８扩增的条带数最
多，均为１８条（图３、图４）。平均每条引物扩增的条
带数为１４．７条，多态性条带比例因引物不同而有所
差异，为８５．７％～１００．０％。所有材料共扩增出２６４
条带，其中具有多态性的条带为２５７条，多态性条带
比例为９３．７％，说明供试材料之间多态性较高，遗
传多样性较丰富。
表３　１８条ＲＡＰＤ引物序列及其扩增结果
Ｔａｂｌｅ　３　Ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　１８ＲＡＰＤ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ
编号
Ｃｏｄｅ
引物
Ｐｒｉｍｅｒｓ（５′→３′）
扩增条带数
Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ　ｂａｎｄ　ｎｕｍｂｅｒｓ
多态性条带数
Ｂａｎｄ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
多态性百分数（％）
Ｐｅｒｃｅｎｔ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（％）
Ｓ７ ＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧ　 １８　 １８　 １００
Ｓ１０ ＣＴＧＣＴＧＧＧＡＣ　 １６　 １６　 １００
Ｓ３０１ ＴＣＧＧＧＣＡＣＧＡ　 １３　 １３　 １００
Ｓ３０４ ＣＣＧＣＴＡＣＣＧＡ　 １７　 １７　 １００
Ｓ３０５ ＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣ　 １４　 １４　 １００
Ｓ５０８ ＣＣＣＧＴＴＧＣＣＴ　 １８　 １８　 １００
Ｓ１００６ ＧＴＡＡＧＣＣＣＣＴ　 １６　 １５　 ９３．８
Ｓ１２０８ ＧＴＧＡＡＴＧＣＧＧ　 １０　 １０　 １００
Ｓ１３０３ ＣＣＡＴＧＣＧＧＡＧ　 １５　 １５　 １００
Ｓ１３０８ ＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧ　 １６　 １６　 １００
Ｓ１４０１ ＣＣＧＴＣＧＧＴＡＧ　 １４　 １４　 １００
Ｓ１４０４ ＧＧＣＡＣＧＣＧＴＴ　 １４　 １２　 ８５．７
Ｓ１４０５ ＣＣＣＧＡＡＧＣＧＡ　 ８　 ８　 １００
Ｓ１４０６ ＧＴＧＧＣＴＴＧＧＡ　 １３　 １２　 ９２．３
Ｓ１５０８ ＡＡＧＡＧＣＣＣＴＣ　 １５　 １４　 ９３．３
Ｓ２００６ ＧＧＡＣＧＡＣＣＧＴ　 １９　 １９　 １００
Ｓ２００７ ＧＧＧＴＣＧＣＡＴＣ　 １２　 １２　 １００
Ｓ２００８ ＣＣＡＣＡＧＣＣＧＡ　 １６　 １４　 ８７．５
—６１—
中国草地学报　２０１２年　第３４卷　第３期
２．３　偃麦草ＲＡＰＤ结果聚类分析
利用ＲＡＰＤ电泳图谱结果，计算Ｊａｃｃａｒｄ遗传
相似系数，并以此为基础采用 ＵＰＧＭＡ法对３２份
偃麦草进行系统聚类。由图５可以看出，在相似系
数０．３７３处，可将供试偃麦草种质资源划分为５大
类群。第Ⅰ类群：此大类共包括８份种质资源，包括
从北京农林科学院引进的５份材料以及新疆农业大
学多年驯化培育的３份偃麦草新品系。其中Ｅ１８
与Ｅ３３同引自新疆呼图壁地区，虽经不同环境驯
化，但遗传上却依旧表现为较高的相似性，其遗传相
似系数约为０．５１２。其余６份材料间遗传相似系数
约在０．３８～０．４８之间，其中Ｅ１５与其他材料遗传
距离最远，遗传差异较大。第Ⅱ类群：此大类共包括
２１份种质资源，并可进一步划分为４个亚类。第一
亚类包括８份材料，均为北疆野生，其中 Ｅ０７和
Ｅ１６、Ｅ１２与Ｅ２５首先各自聚成一类，表现出遗传上
的相似性，Ｅ２９与其他７份材料遗传距离最远。第
二亚类共包括９份材料，进一步可划分为３小类，第
—７１—
李培英　孙宗玖　朱　昊　阿不来提　　　偃麦草种质资源遗传多样性的ＲＡＰＤ分析
一小类包括Ｅ１０、Ｅ２７与Ｅ４２，其中Ｅ１０与Ｅ２７之间
遗传相似系数为供试材料中最大，为０．６５２；第二小
类包括材料 Ｅ０３、Ｅ０６与 Ｅ２８；第三小类包括材料
Ｅ０９、Ｅ２０与Ｅ３９。第三亚类包括Ｅ３７、Ｅ３８和Ｅ３１
这３份材料，均为南疆野生，其中Ｅ３１与其他两份
材料间差异较大，其间相似系数约为０．５左右。第
四亚类仅１份材料Ｅ０８，采集于北疆阿勒泰红敦乡，
其与其他２０份材料间遗传差异最大，其间相似系数
约为０．３８９。第Ⅲ类群：此大类仅１份材料，为Ｅ１１，
采集于北疆阿勒泰市桦林公园。第Ⅳ类群：此大类
仅１份材料，为Ｅ０４，采集于北疆布尔津县东郊区。
第Ⅴ类群：此大类也仅１份材料，为Ｅ４４，采集于乌
鲁木齐雅玛里克山水渠边。
图５　３２份偃麦草材料ＲＡＰＤ分子标记遗传相似性聚类
Ｆｉｇ．５　Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ＲＡＰＤ　ｍａｒｋｅｒ　ｏｆ　３２　Ｅ．ｒｅｐｅｎｓ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ
３　讨论
３．１　偃麦草ＤＮＡ提取方法
基因组ＤＮＡ提取质量的高低直接关系到后续
分子生物学试验能否顺利进行。本研究对偃麦草基
因组 ＤＮＡ 提取方法进行了探讨，发现常规的
ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法提取效果均不理想，因此需对提
取方法进行改良。植物叶片细胞中一般都含有大量
的多糖、酚类、色素等次生代谢物质，这些物质在实
验中会与ＤＮＡ产生共沉淀，形成粘稠的难于溶解
胶状物或产生褐变［１１］。为了改善提取效果，一般要
在沉淀ＤＮＡ时加入高浓度的盐来去除多糖［１２］，添
加抗氧化剂如ＰＶＰ［１３］和β－巯基乙醇来避免多酚
物质氧化成醌类，多次沉淀［１４］、多次洗涤，或者在提
取前预先对样品洗涤减少其含有的次生物质来提高
ＤＮＡ的提取质量。本研究采用先洗涤的方法对样
品进行提前处理，结果发现提取的质量确实有所提
高。ＣＴＡＢ不仅可以裂解细胞膜，释放ＤＮＡ，还能
有效去除多酚，对ＤＮＡ提取而言属于关键性物质。
本研究对ＣＴＡＢ的添加量进行探讨发现，将常规方
法中２％ＣＴＡＢ含量增加到３％时，ＤＮＡ的提取质
量有所提高，因此建议采用高浓度ＣＴＡＢ来提取偃
麦草叶片ＤＮＡ。
３．２　偃麦草的遗传多样性
ＲＡＰＤ是一种基于ＰＣＲ的分子标记技术，能从
分子水平上揭示同一种植物材料间的遗传差异，并
已在无芒雀麦［１５］、狼尾草［１６］、三叶草［１７］等草种资源
的遗传分析中得到大量应用。本研究从１００条随机
—８１—
中国草地学报　２０１２年　第３４卷　第３期
引物中筛选出带型清晰、多态性高、重复性好的引物
１８个，其结果稳定性较好。本试验结果表明，供试
偃麦草材料间的遗传差异较大，其遗传相似系数介
于０～０．６５２之间，这与李培英［１８］等对其表型遗传
多样性的研究结果相吻合。聚类分析结果表明，引
自北京农林科学院的５份材料被聚到一个大类中，
表现出遗传差异与地域间存在一定的相关性。但也
有来自同一地区的野生偃麦草材料并没有聚为一
类，显示遗传差异与地域间并没有明显的关联。例
如，采自阿勒泰地区的Ｅ０４、Ｅ１１与其他来源于阿勒
泰的材料（Ｅ０３、Ｅ０６、Ｅ０７、Ｅ０８、Ｅ０９、Ｅ１０、Ｅ２５、Ｅ２８、
Ｅ２９、Ｅ３０）遗传差异较大，被分为３大类；材料Ｅ１６、
Ｅ３４均采自乌鲁木齐南山地区，但其遗传相似系数
仅为０．３６５。这说明供试偃麦草材料间的遗传多样
性与地域间并无明显的相关性。究其原因可能是偃
麦草具有异交、风媒、多年生、多倍体的特点，其遗传
变异主要存在于种群内，即使地理位置比较相近的
居群，其遗传上也存在着较大的遗传变异，这也与李
惠英［１９］对中国高羊茅遗传多样性的研究结果相似。
上述结果可为偃麦草育种工作提供一定的参考，即
对野生资源进行采集时，在同一地点应根据环境条
件变化多布设样方，在一个取样点也应加大材料的
采集量，以便尽可能搜集到遗传有差异的资源。
４　小结
４．１　通过对偃麦草ＲＡＰＤ反应体系进行优化，建
立其优化的反应体系为：１０×Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μｌ、ＭｇＣｌ２
终浓度２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ 终浓度０．３ｍｍｏｌ／Ｌ、
Ｔａｑ酶用量１Ｕ、ＤＮＡ模板２５ｎｇ、随机引物终浓度
０．６μｍｍｏｌ／Ｌ，添加ｄｄＨ２Ｏ　１３．１μｌ，总体积２５μｌ。
４．２　利用１００条随机引物中筛选出的多态性较高
的１８条引物，对３２份偃麦草材料进行遗传多样性
分析，进而判断其亲缘关系的远近。结果表明，１８
条引物共扩增出２６４条带，多态性条带比例为
９３．７％，说明供试材料多态性较高，遗传多样性较丰
富。
４．３　以遗传相似系数为依据，对３２份偃麦草材料
ＲＡＰＤ扩增谱带信息进行聚类分析表明，在相似系
数０．３７３处可将供试偃麦草种质资源划分为５大类
群，Ｅ４４、Ｅ０４、Ｅ１１和Ｅ０８与其他偃麦草材料的基因
水平遗传差异较大。
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Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｒｏｕｇｈ　ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ＲＡＰＤ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｅｘｐｅｒｉ－
ｍｅｎｔ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｏｎ　ｔｈｉｓ　ｂａｓｉｓ，ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　３２　Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ
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ｗｉｔｈ　１８ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　１００ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅｒｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｒａｔｅ　ｗａｓ
９３．７％．（３）Ｂｙ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｔ　ｔｈｅ　ｐｏｉｎｔ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　０．３７３，ａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｃｏｕｌｄ
ｂｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｆｉｖｅ　ｇｒｏｕｐｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ；Ｘｉｎｊｉａｎｇ；ＲＡＰＤ；Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
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中国草地学报　２０１２年　第３４卷　第３期