全 文 ：一九九一年六月 《天然产物研究与开发 》 V ol . 3N o. 2
多糖对滇紫草培养细胞的影响
周立刚 郑光植 王世林 甘烦远
(中国科一学院昆明植物研究所 昆明 6 0 2 0 4 5 )
摘 要 黑节草多糖 、 火棘果果胶和琼脂加入到培养基中 , 均能促进滇紫草细 胞
合成紫草素 . 黑节草多糖促进紫草素合成的最适浓度为 。 . 0 5一 0 . 1肠 , 大于最 适 浓
度紫草素合成逐渐受到抑制 . 三种黑节草多搪单体中以多糖 亚最为有 效 , 紫 草 素
产量为90 . 。 ? m g l/ . 加入火棘果果胶和凉脂均对紫草素合成呈现 促 进作 用 . 最后
对多糖的作用机理以及多糖与寡糖的关系进行了讨论 .
关键词 多糖 , 滇紫草 , 紫草素 , 培养细胞
利用植物细胞大量培养法工业化生产
有用次级代谢产物 , 关键在于要求培养细
胞生长足够快以及次级代谢产物含量足够
高 。 目前 , 解决这些问题的方 法 虽 然 很
多 , 但在很多情况下 , 往往不能使这两个
方面同时得到解决 。 近年来 , 发现多种多
糖 (包括细菌 、 真菌 、 藻类以及高等植物
的多糖 ) 能明显地影响植物细胞的次级代
谢 , 并已越来越引起人们的重视 l[ ’ “ ’ 名 1 。
本文首次报道黑节草多糖 、 火棘果果胶和
琼脂对滇紫 草 ( o n o s m a p a n i e u za t u m )
培养细胞生长及其紫草素 s( hi k o in n) 合
成的影响 , 为将来的大量生产创造条件 。
材料和方法
实验材料 实验材料同前文 山 。
培养方法 愈伤组织培养同前文 41[
各种多糖制剂在灭菌前加入培养基中 。 在
2 5 ℃黑暗条件下 , 细胞培 养 于添 加 I A A
1 0一 “ M 手口K T l o 一 “ M的 L S 〔“ I 液 体 培 养 基
中 , 2 5 o m l容积的三角瓶内装培养液 50 m l 。
采用振幅为 2 。 O c m 、 转速为 1 1 0r p m 的旋转
收稿 日期 : 19 9 1年 l 月 2 7 日
式摇床进行细胞悬浮培养 , 培养 30 天后收
获 。
培养物产量和紫草素含量的测定 培
养物 ( 包括愈伤组织和悬浮培养细胞 ) 经
冰冻干燥后称重 , 然后换算成每升培养基
中培养物干重即得培养 物产 量 , 单 位 为
g l/
。 培养物打成 细 粉 , 含量 测 定 同 于
M i z u k am i等 [。 1 , 单位为 m g / g 千重培 养
物 。 将紫草素含量乘以培养物产量即得紫
草素产量 , 单位为m g l/ 。 文中所列结果均
来自 4 次重复平均值 , 并附有标准差 。
多糖的制备 黑 节 草 ( D en d r o ib u m
ca dn i du m ) 经甲醇弃去小分子物质 , 其水
提取物用乙醇沉淀得黑节草多糖 。 再经 乙
醇分级沉淀 , 用 D E A E S e p h a d e x A 一 5 0
和 s “ p h a d e X G 一 2 0 0进行纯化得 黑节草多
糖 I 、 I 、 l , 均为一类葡萄甘露聚糖 ,
化学研究参见王世林等 vl[ 。 火棘 果 果胶
从云南产的火棘 ( p y r a e a n t h a p r t u n e a n a )
果实中提得 , 为一酸性多糖 , 化学研究将
另文发表 。 琼脂系 日本进口 分装 , 亦为酸
性多糖 , 由 7 0% 的 琼 醋 糖 ( a g a r o s e ) 租
DOI : 10. 16333 /j . 1001 -6880. 1991. 02. 007
V ol
.
3N o
.
2 3 5
30 %的琼脂胶 ( a g ar op ect in )组成 。
l
,
!
会、幽名Q0420
结 果
况戈叭恶.。翻ù的月
印
翻长扮价4O匆
1
.
!
六t/.耳口.a吕月0创ù心的
喇书偏桥翻
尸!妇恤|日fō/,,工二、,:;。,长称汰淤
图 7一 1
F 19
Q
。 , O 。 2 0 。多 O 。 4
乡幼浓度 r川” . “ 加 r记… 。 . 《% )
黑节草多糖对滇紫草愈伤组织培养的影响
7一 1 E f f e e t s o f D
.
e a n d i d u m
P o l y s a e e h a r i d e s o n e a l l u s
e u l t u r e o f 0
.
P a n i e u l a t u m
I
v
|
二\.忍芝念扒。一六公.札喇桥解4O匆08印20州!l认l’e卜!p||LI
1
.金、$尽衬.韶03.一uo翻ù`协和拼口hl厂卜|..L广l价|.ZT或”
.伯巧论96,!
1
0
1
ǎ一、沙卫涅卜5.脚,1,0板橄浮冰埃
1
。 黑节草多糖的影响
不 同浓度的黑节草多糖对滇紫草
愈伤组织和细 胞悬浮培养的影响 , 结
果如 图 7 一 1和 图 7一 2所示 。 对于愈伤组
织 (见图 7一 1 ) , 多糖浓度为 O。 05 %时 ,
紫草素 产 量 为 8 0 . 0 1m g l/ , 是对 照
( 4 o
.
6 5m g / l ) 的 2倍 , 当浓度逐 渐 增
大时 , 对愈伤组织紫草素合成呈现抑
制作用 , 但对生长具有轻微的促进作
用 , 多糖浓度为 0 。 2%时 , 生长达最大
值为 1 4 . 52 士。 . 7 59 l/ 。 对于悬浮培养
细胞 (见图 7一 2 ) , 浓度为 0 . 1%时 , 紫
草素产量达最 大 值为 10 1 . 4 0m g八 ,
为对照 ( 3 6 . 6 8m g / 1) 的 3 倍 , 且 在
该浓度下 , 细胞生 一长亦达到最大值 ,
为 16 . 7 4 土 0 . 61 9 / l , 明显 高 于 对 照
( 1 2
.
2 5 土 0 。 8理g八 ) , 多糖浓度大于
0
.
1%时 , 生长和紫 草 素合成逐渐受
到抑制 。 以上结果表明 , 黑节 草多糖
作用于滇紫草愈伤组织和悬浮培养细
胞的最适浓度为 0 . 05 一 0 . 1% 之 间 ,
此时细胞生 一长和紫草素 含量均得到提
l局 。
化学研究表明 , 黑节草多糖是由
三种多糖组 成 的 , 即 多糖 I 、 亚和
l 【7 J 。 各单体多糖对一培养细胞的影响
结果如表 7 一 1所示 。 多糖 I 能 明显地
提高紫草素含量 , 而多糖 皿却能明显
地促进细胞生长 , 多糖 I 对紫草素含
量和生 氏影响均不大 。 综合生长和紫
草素含量两个指标 , 以多糖 l 对细胞
合成紫草素最为有效 , 紫草素产量为
9 0
.
0 7m g八 。
图 7一2
F 19
.
7一 2
0
.
2 0
.
4 0
。
6 0
.
8
多馆浓度 p o卜“ “ 匕a r . d一 c o . ` , (% )
黑节草多糖对滇紫草细胞悬浮培养的影响
E f f e e t s o f D
. e a n d i d u m
P o l y s a e e h a r i d e s o n e e l l s u s P e n s i o n
e u l t u r e o f o
_
p a n i e u l a t u m
3 6 Vo l
.
3 No
.
2
表了一 1 黑 节 草多糖 I 、 亚、 l对滇
紧草细胞悬浮培养的影响
Ta b le 7
一 1 E f fe e ts o f po ly s a e e ha ri de
I
,
1
a n d 贾f r om D
。 e a n d i d u m
o n e e l l s u s P e n s i o n e u l t u r e
o f o
。
P a n i e u l a t u m
多糖
( 0
.
0 1% )
培养物
产量
( g / l )
紫草素
含量
( m g / g )
紫草素
产 量
( m g / l )
对照
I
I
l
12
.
3 0士 0 . 2 7 2 . 4 8士 0 . 0 3 3 0 . 5 2
1 2
.
5 1士 0 . 3 4 2 . 6 1土 0 . 0 5 3 2 . 6 4
1 3
.
5 6士 Q . 4 5 6 . 6 4士 0 . 3 6 . 9 0 . 0 7
2 0
.
1 2士 0 . 6 5 . 2 . 8 3士 0 . 0 3 5 6 . 9 1
接种量 为4 . 54 士。 . 169 I/ ; 与时照相比 长 P < 。 . 0 01
与
3
. 琼脂 的影响
琼脂对培养细胞的影响结果如表 7 一 3
所示 。 加入浓度为 0 . 0 05 一 。 . 06 %的琼脂均
明显地促进紫草素的合成 。 琼 脂 浓 度 为
0
.
0 2% 时 , 紫 草 素 产 量 达 最 大 值 , 为
13 1
.
4 4m g l/
。 琼脂浓度大于。 . 02 %时 , 还
能明显地促进细胞的生长 。
表 补 3 琼脂对滇紫草细胞悬浮培
养的影响
T a b l e 7 一 3 E f f e e t s o f a g a r o n e e l l
s u s P e n s i o n e u l t u r e o f o
。
P a n i e u l a t u m
2
. 火棘果果胶的影响
火棘果果胶对细胞悬浮培养的影响 ,
结果如表 7 一 2所示 。 所加入浓度为 O。 0 5一
O
。
2 %的火棘果果胶对细胞的生长 影 响不
明显 , 但均明显地促进了紫草素的合成 。
紫草素的产量是对照的 3 一 8倍 。 果胶浓
度为 0 . 2 %时紫草素产量最 高 , 为 3 08 . 18
m g八 。 果胶浓度为 0 . 4%时紫草 素产量为
2 9 5
.
5 3m g / 1
, 稍有所降低 。
表 不 2 火棘果果胶对滇紫草细胞悬
浮培养的影响
T a b l e 7
一 2 E f f e e t s o f P e e t i n f r o m
P
。
f o r t u n e a n a o n e e l l s u s P e n s i o n
e u l t u r e o f o
。
P a n i e u l a t u m
果胶 培养物 紫草素 紫草素
浓度 产量 含量 产量
(务 ) ( g / l ) ( m g / g ) ( m g / 1)
0 12
.
2 5士 0 , 8 4 2 . 9 9士 0 . 1 9 3 6 . 6 8
0
.
0 0 5 1 1
.
8 7士 0 . 7 0 9 . 0 5士 0 . 1 8 . 10 7 . 4 0
0
.
0 1 1 0
.
5 5士 0 , 7 1 1 0 . 7 8 士 0 . 1 1 . 1 17 . 0 0
0
.
0 5 1 1
.
9 4士 0 . 5 1 1 6 . 8 6士 0 . 2 3 . 2 0 1 . 2 7
0
.
1 0 1 3
.
3 7土 0 . 5 1 2 1 . 3 6士 0 . 5 5 . 2 8 5 . 5 7
0
.
2 0 1 4
.
0 9士 0 . 4 6 2 1 . 8 7士 0 . 2 5 . 3 0 8 . 2 8
0
.
4 0 1 3
.
9 4士 0 . 5 0 2 1 . 2 0士 0 . 3 5 . 2 9 5 . 5 3
接 种量 为 4 . 5 4士 0 . 2名 g / l ; 与时照相比 * P < 0 . 0 0 -
琼脂
浓度
(务 )
培养物
产量
( g / l )
紫草素
含量
( m g / g )
紫草素
产量
( m g / l )
0
0
。
0 0 5
0
.
0 1
0
。
0 2
。
0 4
,
0 6
1 2
.
3 5士 0 . 3 5 3 . 5 0 士 0 . 1 1 4 3 . 3 5
1 2
.
7 1士 0 . 5 1 6 . 0 3 士 0 . 1 8 。 。 ’ 7 6 . 6 6
1 3
.
6 8士 0 . 9 3 6 . 2 5士 0 . 0 2 ’ 二 8 5 . 5 0
1 5
.
2 0士 0 . 8 8 5 . 6 5士 0 . 1 1 . ’ . 1 3 1 . 4 4
17
.
1 5土 0 . 9 5二 6 . 0 9士 0 , 1 1… 1 0 4 . 5 5
1 8
.
5 6士 1 . 6 7 二4 . 3 3士 0 . 2 8 . 8 0 . 3 3
自甘八é
接种量 为 5 . 05 士。 . 139 / l :
与衬照相 比 . P < 0 . 0 5 , - 一 P < 0 . 0 一 , * 赞 * P < 。 . 0 0 1
;l
|
l
.
d月」
讨 论
加入诱 导子以提高滇紫草培养细胞中
紫草素含量 , 是解决培养细胞中紫草素含
量低的有效途径之一 。 黑节草多糖在适宜
浓度下能明显地促进紫草素的合成 , 可能
与多糖的活性寡搪片断有关 , 我们曾报道
了从黑节草多糖中降解的寡糖素能促紫草
素的合成 囚 , 从而证明了多糖的 功 能与
其所 含的某些活性寡糖片断密切相关 。 药
理研究表明 , 黑节草多糖具较强的抗癌和
增强免疫功能的活性 , 加之它对植物培养
细胞生产次级代谢产物也有作用 , 更是引
起人们的重视 。 我们的研究表明 , 黑节草
Vol
.
3 No
.
2 3 7
多糖除作为植物的贮藏性食物外 , 还可能
承担着更为复杂 的生理生化调节功能 , 具
体作用机理还有待于进一步研究 。 总之 ,
黑节草多糖的应用开发是很有价值和前途
启勺。
火棘果果胶和琼脂均为酸性多糖 , 所
加入的各浓度对培养细胞的紫草素合成均
有促进作用 , 猜测它们的某些酸性活性寡
糖片断在紫草素的形成过程中起着重要的
作用 , 它们可能与细 胞的细胞膜上的某些
蛋白质受体结合 , 而把听带的信息传入细
胞内 , 从而导致细胞的生理生化的变化 。
F u k iu 等 L“ 〕研究发现琼脂也 能 促进
紫草 ( L i t h o s P e r m u m e r y t h r o r h i z o n )
细胞中紫草素的合成 , 这与我们的研究 结
果是一致的 。 关于多糖与活性寡糖素之间
的关系以及作用机理 , 正 在 进一步 研 究
中 。 不管怎样 , 象黑节草多糖 、 火棘果果
胶和琼脂这一类以前被认为是生理上的非
活性物质能够极大地影响滇紫草的紫草素
代谢 , 是非常有趣的 。
参考文献
〔 l 〕
〔 2 〕
E i l e r t U , e t a l
.
E l i c i t o r s t im
-
u 1 a t i o n o f m o n o t e r P e n e i n d o l e
a I k a l o i d f o r m a t i o n i n s u s P e n s i o n
e u l t u r e s o 丈 C a t h a r a n t h u s r o s e u s 。
J P l a n t P h y s i o l l 9 8 6 ; 1 2 6 ( 1 )
:
1 1
。
F u n k C
, e t a l
.
I n c r e a s e d s e c o n -
d a r y P r o d u c t f o r m a t i o n i n P l a n t
c e l l s u s P e n s i o n c u l t u r e s a f t e r
t r e a tm e n t w i t h a y e a s t e a r b o h
-
y d r a t e P r e P a r a t i o n ( e l i c i t o r )
。
P 五y t o c h e m i s r r y 1 9 8 7 ; 2 6 ( 2 ) :
4 0 1
〔 3 〕 T y l e r R T , e t a l 。 S e m i一 c o n t i n -
u o u s P r o d u c t i o n o f s a n g u i n a r i n e
a n d d i h y d r o s a n g u i n a r i n e b y
P a P a v e r s o m o i f e r u m L
。 e e l l
s u s P e n s i o n c u l t u r e s t r e a t e d
w i t h f u n g a l h o m o g e n a t e
.
P l a n t
C e l l R e P 1 9 8 8 , 7 ( 6 )
: 4 1 0
〔 4 〕 周立刚等 , 寡糖素对滇紫草愈伤组
织色素合成的影响 , 天然产物研究
与开发 , 1 9 9 0 ; 2 ; ( 2 ) : 2 2
〔 5 〕 L i n s m a i e r E F a n d S k o o g F .
o r g a n i c g r o w t h f a c t o r r e q u i r e
-
m e n t s o f t o b a c e o t i s s u e e u l t u
-
r e s 。 P h y s i o l P l a n t 1 9 6 5 ; 1 8
( l )
: 1 0 0
〔 6 〕 M i艺 u k a m i H , e t a l . E f上e e t o f
n u t r i t i o n a l f a c t o r s o n s h i k o n i n
d e r i v a t i v e f o r m a t i o n i n L i t h o s
-
P e r m u m c a l l u s c u l t u r e s
.
P h y t o
-
e h e m i s t r y 19 7 7 ; 1 6 ( 8 )
: 1 1 8 3
〔 7 〕 王世林等 , 黑节多糖的研究 , 云南
植物研究 , 1 9 8 8 ; 2 0 ; ( 4 ) : 3 8 9
〔 8 〕 F u k u i H , e t a l 。 I n d u e t i o n o f
s h i k o n i n f o r m a t i o n b y a g a r i n
L i t h o s P e r m u m e r y t h r o r h i z o n
e e l l s u s p e n s i o n e u l t u r e s
.
P h y
-
t o e h e m i s t r y 1 9 8 3 ; 2 2 ( 1 1 ) :
2 4 5 1
8 3Vo l
.
3No
.
2
E F FE C TS OF P OLYS A C C HA I R DES N OC U L TU RE D
C E L LS OF ONS OMA PA I NA C U U L TM
z ho u L主g a ng , Z h e n g G u a n g z h i , W a n g S h j l i n , G a n F a n y u a n
( K u , , i n夕 I , 5 t i t “ t e o f B o t a n 夕 , 月 e a d e 加 i a S i n i e a , K u n 功 i n 夕 6 5 0 2 0 4 )
A b s t r a e t
P o l y s a c c h a r i d e s o f D e n d r o b主u m c a n d i d u m , P e c t i n o f P y r a c a n t h a
f o r t u n e a n a , a n d a g a r a l l s t im u l a t e d t h e s h i k o n i n f o r m a t i o n o f O n o s m a
P a n i c u l a t u m c e l l s
.
T h e a P P r o P r i a t e c o n c e n t r a t i o n o f D
. c a n d i d u m P o l y s
-
a e e h a r i d e s w a s o
。
0 5一 0 。 1% f o r t h e e u l t u r e d c e l l s t o s y n , h e s i z e s h i k o n i n 。
T il e s h i k o n 主n f o r m a t i o n w a s i n h i b i t t e d w h e n c o n c e n t r a t i o n o f D 。 c a n d i d u m
p o l y s a c c h a r i d e s w a s i n c r e a s e d g r a d u a l l y
。
T h e p o l y s a c c h a r i d e 1
o f D
。
e a n d i d u m w a , t h e m o s t e f f e c t i v e i n t h e t h r e e P o l y s a c c h a r i d e s t o P r o m o t e
s h i k o n i n f o r m a t i o n
,
w h i
c h s h i k o n i n y i e l d w a s 9 0
。
0 7m g / 1
。
S h i k o n i n f o r m a t i o n
w a s P r o m o t e d w h e n d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n o f a g a r o r P y r a c a n t h a f o r t u n e a n a
n e e 俪 n w e r e a d d e d i n t h e m e d i u m 。 T h e m e c h a n i s m o f a f f e c t a b o u t P o l y s -
a e c h a r i d e s o n s h i k o n i n f o r m a t i o n
, a n d t h e r e i a t i o n s il i P D e t w e e m t il e
P o l y s a c c h a r i d e s a n d 0 119 0 , a c℃ h a r i n s w e r e d i s c u s s e d .
K e y w o r d s P o l y s a c c h a r i d e s
, o n o s m a P a n i c u l a t u m
, S h i k o n i n
, C u l t u r e d
e e l l s