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鹿蹄橐吾水溶性多糖的分离纯化和
体外清除自由基活性研究
刘春兰 ,李　阳 ,杜　宁 ,黄　潇 ,王文蜀
(中央民族大学生命与环境科学学院 ,北京 100081)
　　摘要　目的:为合理利用鹿蹄橐吾提供一定依据 ,对鹿蹄橐吾进行多糖提取分离纯化。方法:鹿蹄橐吾经热水
浸提 ,乙醇沉淀得粗多糖 LW。此粗多糖经分离纯化得纯化多糖 LW21。 LW21经检测为纯多糖。用荧光法对鹿蹄橐
吾多糖 LW, LW21进行清除自由基活性的研究。结果:LW、LW21对羟自由基及超氧阴离子自由基具有明显的清除效
果 ,且 LW21对上述两种自由基的清除效果优于粗多糖 LW。结论:从清除自由基活性实验可以证明鹿蹄橐吾水溶
性多糖可作为抗衰老保健或药物在临床上使用 ,具有进一步开发生产的价值。鹿蹄橐吾多糖 LW21是一新结构多
糖 ,为首次从鹿蹄橐吾中分离得到。
关键词　鹿蹄橐吾;多糖;纯化;自由基
中图分类号:R284.1/R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)09-1414-03
StudyonthePurificationandScavengingFreeRadicalActivityofWater
SolublePolysaccharidefromLigulariahodgsoni
LIUChun-lan, LIYang, DUNing, HUANGXiao, WANGWen-shu
(ColegeofLifeandEnvironmentalScience, MINZUUniversityofChina, Beijing100081, China)
Abstract　 Objective:Thestudywastoprovidedthereferenceforfutherdevelopmentand utilizationofLigularia
hodgsoni.Methods:ThecrudepolysaccharideLWwasextractedfromLugulariahodgsoniwithhotwater, andprectatedbyethanol.The
crudepolysaccharidehasbeenfractiontedandpurified, soLW21wasgot.ItshomogeneitywasconfrimedbychromatographyonSepharose
CL-4B, paperchromatographyandcellulousactateelectrophoresis.Thescavengingefetsofthepolysacehardeson· OHandO-2· were
determinedbyfluorescencemethod.Results:AntioxidativeexperimentshowsthatLWandLW
21
wereeffectiveinscavengingsuperoxide
radicalandhydroxylradical.ThescavengingcapacityforsuperoxideradicalandhydroxylradicalofLW21 hadhigherthanthatof
LW.Conclusion:ThepolysaceharidefromLigulariahodgsonihadstrongerantioxidantactioxdantactivities, andtheirantioxidantactivi-
tieshadcertaindose-relationship.
Keywords　Ligulariahodgsoni;Polysaccharide;Purify;Freeradical
收稿日期:2010-03-29基金项目:“ 111创新引智计划 ”工程项目(B08044);中央民族大学 “ 985”工程重点科研项目;中央民族大学 2009-2010年度自主科研计划项目(自由探索类)作者简介:刘春兰(1962-),女 ,教授 ,研究方向:多糖化学;Tel:010-68156198, E-mail:liuchunlan888@yahoo.com.cn。
·1414· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 9期 2010年 9月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2010.09.022
　　鹿蹄橐吾为菊科橐吾属植物鹿蹄橐吾 Ligularia
hodgsoni的干燥全草 ,别名滇紫菀 ,分布于我国四川
东部 、湖北 、湖南等省。其根及根茎收入云南省药品
标准 ,药理研究表明其醇溶物具有祛痰镇咳 、杀菌消
炎和抗肿瘤的活性〔1, 2〕。有学者研究表明鹿蹄橐吾
的化学成分主要有倍半萜类 、生物碱 、多羟基类小分
子等 〔3〕。目前国内外对鹿蹄橐吾多糖的研究还未
见报道。鉴于橐吾具有较高的药用价值和多糖具有
的多种生理功效 ,本文对产于四川阿坝藏族地区的鹿
蹄橐吾进行水溶性多糖提取纯化 ,并进行体外清除自
由基的活性研究 。以期为进一步完善鹿蹄橐吾多糖
的质量评价体系和探讨其药理活性提供参考依据。
1　材料与仪器
鹿蹄橐吾采自四川阿坝 ,由中国科学院植物研
究所陈艺林鉴定为菊科橐吾属植物鹿蹄橐吾 Ligu-
lariahodgsoni的干燥全草 。 FC-95A馏分自助收集
器(上海青浦沪西仪器厂), 8002型电热恒温水浴锅
(天津市中环实验电炉有限公司),精密电子天平
(感量 1/104), LD4-8型离心机(北京医用离心机)。
UV-Jasco53型紫外分光光度计 (日本岛津公司),
DEAE-SephdexA25, SephroseCL-4B(美国 Pharmacia
公司进口)等。
2　方法
2.1　鹿蹄橐吾粗多糖的提取 〔4〕　称取干燥的鹿蹄
橐吾适量 ,加入 95%乙醇回流脱脂 , 85℃水浴提取 ,
乙醇沉淀 ,真空干燥后得粗品鹿蹄橐吾多糖 。
2.2　鹿蹄橐吾纯化多糖的制备　将粗多糖配成
2%溶液 ,链酶蛋白酶与 Sevage法联合脱蛋白 ,重复
三次 〔5, 6〕。此时溶液中加入 pH=2.5的 95%乙醇至
醇浓度达 30%,离心沉淀常规干燥 ,上清液中继续
加入如上乙醇至醇浓度达 50%, 离心沉淀常规干
燥。上清液中继续加入如上乙醇至醇浓度达 70%
以上 ,离心沉淀常规干燥 。
2.3　纯化多糖制备及其纯度鉴定　乙醇至醇浓度
达 70%以上所得干燥后沉淀采用 DEAE-SephadexA-
25分离纯化 ,用 0.5 mol/L的 NaCl溶液洗脱 ,流速
0.75 mL/min,分部收集。
2.3.1　纸层析纯度鉴定〔7〕:用新华 1号中速滤纸
(15 cm×40cm)进行层析 ,溶剂系统为乙酸乙酯-醋
酸-水(4∶1∶1),苯胺 -邻苯二甲酸试剂显色 。
2.3.2　醋酸纤维薄膜电泳纯度鉴定 〔7〕:采用 pH=
12.5的 0.025 mol/L硼酸盐为电极缓冲液 ,电压
250 V,电泳时间 30min用 0.5%甲苯胺蓝乙醇溶液
染色 。
2.3.3　SephroseCL-4B(1.5 cm×90 cm)柱层析纯
度鉴定 〔8〕:取 5 mg多糖配成 10 mg/L,取 0.5 mL上
样 , 0.1mol/LNaCl溶液洗脱 ,流速 0.45 mL/min,每
管 2 mL收集 ,苯酚 -硫酸法测定多糖 ,绘制层析图
谱 ,观察结果 。
2.4　清除自由基活性测定
2.4.1　多糖清除 · OH的测定 〔9, 10〕:利用 Mn2+与
H2O2作用(类似 Fenton反应 〔11〕),即 · OH迅速氧
化荧光类物质 ,以 362/448 nm测定荧光强度 F,计
算其与空白参比(羟甲香豆素与缓冲液)荧光强度 Fo
之差 ΔF,测定· OH的产生量。加入不同浓度的多糖
测定荧光强度 Fs,未加多糖的体系荧光强度为 F。使
用公式:清除率 =(Fs-F)/(Fo-F)×100%。
2.4.2　多糖清除 O-2·的测定〔12, 13〕:利用邻苯三酚
在碱性条件下能迅速自氧化为醌 ,发生双聚反应 ,具
有较强的荧光效率的特性间接检测 O-2·的生成量 ,得
到的荧光动力学曲线 0 ～ 6min部分的斜率为 Vo,相同
方法测不同浓度多糖的荧光曲线斜率 Vs。利用公式:
清除率 =(Vo-Vs)/Vo×100%。
3　结果
3.1　鹿蹄橐吾水溶性粗多糖提取　鹿蹄橐吾经水
提醇沉后得粗多糖(LW),为灰白粉末状固体 ,溶于
水 ,不溶于乙醇 、乙醚等有机溶剂。
3.2　鹿蹄橐吾水溶性多糖的分离纯化　粗多糖经
酶法和 Sevage法联合脱蛋白得初步纯化多糖 LW′,
经干燥后为棕黄色粉末状固体 ,得率为 49.71%。
LW′经酸性乙醇分级得到两个级分:pH=2.5的
95%乙醇至醇浓度达 50%下沉淀得 LW1;乙醇至醇
浓度达 60%下沉淀得 LW2。将 LW2上 DEAE-Seph-
adexA-25柱 ,收集 51 ～ 56管 ,乙醇沉淀 ,真空干燥后
得多糖 LW21。 LW21经 SephroseCL-4B(1.5 cm×90
cm)柱层析 ,苯酚-硫酸法检测得一单一对称峰 。醋
酸纤维薄膜电泳呈单一谱带。纸层析呈单一斑点 。
说明它们均为分子量均一的纯多糖。用紫外分光光
度法测定蛋白分布 ,结果显示在 280nm处无蛋白吸
收峰。说明 LW21为不含蛋白质的多糖。
3.3　鹿蹄橐吾多糖清除自由基活性测定
3.3.1　鹿蹄橐吾多糖对 · OH的清除作用:采用
不同浓度的鹿蹄橐吾多糖 ,按照实验方法的步骤进
行 ·OH清除率的测定 ,结果见图 1,表明 , LW、LW21
对 ·OH具有清除作用 ,而且在实验模拟的浓度范
围内与浓度成正相关 。LW、LW21在糖浓度为 0.02
mg/mL以上时清除率均高于 30%。由此说明 ,只有
达到一定浓度时 ,鹿蹄橐吾多糖才具有对 · OH的
清除作用 。且 LW21的清除率优于 LW,原因可能是
纯化后的多糖除去了干扰多糖发挥清除 ·OH作用
·1415·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 9期 2010年 9月
的物质 ,多糖活性作用得到更好的发挥。本实验采
用的自由基模型体系所产生 ·OH自由基浓度远大
于体内该自由基的浓度 〔14, 15〕。体外实验表明鹿蹄
橐吾多糖是良好的 ·OH自由基清除剂。
图 1　LW、LW21对羟自由基的清除作用
3.3.2　鹿蹄橐吾多糖对 O-2·的清除作用:采用不
同浓度的鹿蹄橐吾多糖 ,按照实验方法的步骤进行
O-2·清除率测定 ,结果见图 2。结果表明 LW、LW21
对 O-2·都具有很强的清除效果 ,而且在实验模拟的
浓度范围内与浓度成正相关 。 LW21在糖浓度为
0.02 mg/mL以上时清除率高于 30%, LW在糖浓度
为 0.05 mg/mL以上时清除率高于 30%。在实验模
拟的浓度范围内 ,多糖 LW21的清除作用均高于 LW,
当多糖浓度达 0.5 mg/mL时 , LW21清除率达
79.9%, LW清除率达 61.1%。原因可能是纯化后
的多糖除去了干扰多糖发挥清除 O-2·作用的物质 ,
多糖活性作用得到更好的发挥。本实验采用的自由
基模型体系所产生 O-2·自由基浓度远大于体内该
自由基的浓度 〔16, 17〕 ,体外实验表明鹿蹄橐吾多糖是
良好的 O-2·自由基清除剂。
图 2　LW、LW21对超氧阴离子的清除作用
4　结论
本实验通过对鹿蹄橐吾多糖进行粗多糖 LW的
提取 ,近一步分离纯化得纯化多糖 LW21 ,并对 LW、
LW21进行清除自由基活性研究 。清除自由基活性
实验模拟产生 · OH、O-2·的 2个体系 ,其浓度远大
于体内这 2种自由基的浓度。结果发现 ,鹿蹄橐吾
多糖 LW、LW21对 O-2·和 · OH都具有清除作用 ,而
且在实验模拟的浓度范围内与浓度成正相关 ,纯化
后的多糖 LW21对上述两种自由基的清除效果优于
粗多糖 LW。综上所述 ,鹿蹄橐吾多糖是一种良好
的清除自由基的抗氧化剂 。自由基与机体的衰老有
很密切的关系 ,推测鹿蹄橐吾水溶性多糖可作为抗
衰老保健或药物在临床上使用 ,但还有待于进一步
的体内实验 。多糖的结构与生物活性存在一定的关
系 ,鹿蹄橐吾多糖的结构和组成与其抗氧化作用之
间的关系是笔者正在研究的内容。
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