全 文 ：文章编号:1001-4829(2005)05-0634-04
　　收稿日期:2005-07-20
作者简介:高海波(1979-),男 ,内蒙赤峰人 , 硕士 ,主要从事植
物分类生物学研究。
小麦-中间偃麦草异附加系
Z4的外源染色质的分子标记
高海波1 , 2 ,陈　孝1 ,陈　明1 ,徐兆师1 ,李连城1 ,马有志1＊
(1.中国农业科学院作物科学研究所 ,农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 ,农业部作物遗传育种重点开放实验室 ,北京
　100081;2.内蒙古农业大学农学院 ,内蒙古 呼和浩特　010018)
摘　要:以中间偃麦草基因组 DNA为探针对小麦―中间偃麦草异附加系 Z4进行基因组原位杂交分析 , 表明异附加系 Z4附加的
一对中间偃麦草染色体与普通小麦的一对染色体发生了相互易位。对中间偃麦草 、Z4和普通小麦品种宛 7107进行 RAPD 分析 ,
在 100条随机引物中 ,有两个引物― S1053和 S1068在Z4中能扩出中间偃麦草的特异带。在利用 Z4进行小麦抗锈病育种时 , 可
使用这两个标记进行辅助选择。
关键词:中间偃麦草;异附加系;抗锈病;基因组原位杂交;RAPD
中图分类号:S336;S512　　　文献标识码:A
Molecular markers of alien chromatin in Z4
wheat-Thinopyrum intermedium addition line
GAO Hai-bo1 , 2 , CHEN Xiao1 , CHEN Ming1 , XU Zhao-shi1 , LI Lian-cheng1 , MA You-zhi1＊
(1.Inst itute of C rop science , Chinese Academy of Agriculture Sciences , National Key Science Facility of C rop Gene Resources and Gene
Imp rovement , Key laboratory of crop Genetics and Breeding , Minist ry of Agricult ru re , Beijing 100081 , China;2.College of Agronomy , In-
ner Mongolia Agricultural University , Mongolia Huhehot 010018 , China)
Abstract:The result s of genomic in situ hybridization(GISH), in w hich Thinopyrum intermedium genome DNA was used as probe ,
p roved that reciprocal t ranslocat ion was accrued betw een a pair of Th.intermedium chromosomes and a pai r of common w heat ch romo-
somes in Z4 additional line.RAPD analysis for Th.in termedium , Z4 and common wheat cv.Wan7107 show ed that tw o primers-S1053
and S1068 amplified speci fic DNA bands of Th.intermedium in Z4 among the 100 random primers involved in this study.Both markers
could be applied for assistant selecting w hen rust resistance breeding was carried out by using Z4 as resistant source.
Key words:Th inopyrum in termed ium;addi tion line;rust resistance;GISH;RAPD
　　小麦锈病 ,包括条锈 、叶锈和秆锈 ,是小麦上发
生范围最广 、为害最大 、记录最早的一类病害[ 1] 。
选育抗病品种是防止锈病发生的最安全 、有效的手
段。至今国际上已命名了 33个抗条锈基因 、58 个
抗叶锈基因和 50个抗秆锈基因[ 2 ～ 4] ,它们分别源自
普通小麦及其近缘种属 ,如斯卑尔脱小麦 、提莫菲维
小麦 、野生二粒小麦 、黑麦 、顶芒山羊草 、方穗山羊
草 、偏凸山羊草 、小伞山羊草 、中间偃麦草 、长穗偃麦
草 、节节麦等[ 2～ 4] 。由于病原菌的高度变异性和人
为栽培品种的单一化 ,使很多抗性基因丧失抗性 ,不
断寻找和利用新的抗源对小麦抗病育种具有非常重
要的意义。
中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)是禾本科
小麦亚族中的多年生草本植物 ,对小麦的条锈 、叶锈 、
秆锈 、白粉病等免疫 ,对黑穗病 、叶枯病 、根腐病 、条纹
花叶病等高抗 ,成为小麦遗传改良的重要基因源[ 5] 。
Cauderon等[ 6]利用中间偃麦草与普通小麦杂交 ,选育
出了部分双二倍体 TAF46 ,并获得 6个小麦异附加
系 ,其中 3个附加系分别带有抗条锈 、叶锈和秆锈病
基因。Wienhues等[ 7]选育出抗三锈的小麦—中间偃
麦草异附加系 ,并获得了 9个异代换系 。祁适雨等[ 8]
在中间偃麦草与小麦的杂交后代中选育出了远中 1-7
634
西　南　农　业　学　报
Sou thw est China Journal of Agricultural S ciences
　　　　　　　　　　　　　　2005年 18卷 5期
Vol.18　　No.5
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2005.05.028
部分双二倍体和若干异附加系 、异代系。Lakin等[ 9]
利用中 5(即远中 5)与普通小麦杂交得到了 Z1 ～ Z6 6
个异附加系和代换系 ,其中 Z4附加的一对中间偃麦
草染色体带有未知的抗条锈 、叶锈和秆锈病基因 。本
研究目的是鉴定 Z4中的外源染色体 ,并寻找抗病基
因的分子标记 ,以期利用分子标记辅助育种 ,加速小
麦抗锈病育种的进程。
1　材料和方法
1.1　材料
中间偃麦草(2n=42)、小麦-中间偃麦草异附
加系 Z4(2n=44)(宛 7107×远中 5)、普通小麦品种
宛 7107均由中国农业科学院作物科学研究所提供 。
1.2　方法
1.2.1　抗条锈病鉴定　分别在田间及可控温室进
行抗病鉴定 ,采用喷雾法和涂抹法成株期人工接种 ,
病原菌小种采用条中 32号 ,抗性反应分为免疫和感
病两级。
1.2.2　抗叶锈病鉴定　在可控温室进行抗叶锈病
鉴定 ,使用混和叶锈病菌小种涂抹法成株期叶片人
工接种 ,抗性反应分为免疫和感病两级 。
1.2.3　基因组原位杂交分析　①染色体标本的制
备:Z4种子在室温下萌发 ,根尖生长至 1 ～ 2 cm 时
切下冰浴 24 h ,卡诺固定48h ,柠檬酸缓冲液浸泡 15
min ,37 ℃酶解压片 ,液氮冷冻揭片 ,气干待用 。 ②
探针标记:用 N IPPON GENE 公司的 DNA La-
belling Ki t ,以生物素(biotin-16-dUTP)通过随机引
物法标记中间偃麦草基因组 DNA。 ③杂交及检测:
按马有志等的方法进行[ 10] 。用 OLYMPUS 荧光显
微镜观察 ,SPOT-RT CCD相机采集图象。
1.2.4　RAPD分析　基因组 DNA 提取按 Doy le 的
方法进行[ 11] , RAPD分析方法参考Willanms等的
图 1　抗条锈病(A)及抗叶锈病(B)鉴定结果
Fig.1　Resistant test to st ripe rust(A)and yellow rust(B)of the
materials
方法[ 12] ,稍加改动 。PCR扩增总体积为 25 μl:1×
PCR buffer , 2.0 mmol/ L MgCl2 , 250 μmol/ L
dN TP ,0.4μmol/ L 引物 , 1 U r Taq 聚合酶 。PCR
扩增条件为:94 ℃预变性 3 min ,每个循环 94 ℃变
性 45 s ,37 ℃复性 60 s ,72 ℃延伸 90 s , 40个循环 ,
最后 72 ℃延伸 10 min。扩增产物用 1.2 %琼脂糖
凝胶电泳检测 ,紫外下观察照相 。
2　结果与分析
2.1　抗病性鉴定
用条锈病菌和叶锈病菌进行人工接种 , 2周后
调查结果显示 ,普通小麦宛 7107 感条锈病和叶锈
病 ,小麦-中间偃麦草异附加系 Z4 对这两种病菌
免疫(图 1)。
2.2　基因组原位杂交
利用生物素标记的中间偃麦草基因组 DNA 作
探针对 Z4 进行 G ISH 分析 ,在 Z4的两对染色体上
检测到了黄绿色信号 ,其中一对染色体信号在长臂
远端约 55 %的区域 ,而另外一对较短的染色体除其
长臂远端 60 %区域外都有较强的黄绿色信号。这
表明 ,Z4中附加的一对中间偃麦草染色体与普通小
麦的染色体发生了相互易位(图 2)。
2.3　RAPD分析
以中间偃麦草 、小麦-中间偃麦草异附加系 Z4
和普通小麦品种宛 7107为材料 ,以十聚体寡核苷酸
为引物进行了 RAPD分析 ,从 100 个引物中 ,筛选
出 S1053和 S1068 两个引物可以在中间偃麦草和
Z4中扩增出特异带 ,其中 , S1053能扩增出一条长
890 bp的特异带 ,S1068能扩增出一条长约 2 kb的
特异带(图 3),在普通小麦品种宛 7107中不能扩出
这两条特异带。表明S1053和S1068这两个标记为
异附加系 Z4上外源中间偃麦草染色体所特有 ,可
用于抗锈病基因的追踪检测 。
图 2　Z4 中期染色体基因组原位杂交(箭头所指为杂交
信号)
Fig.2　GISH analysi s of Z4(alien f ragments pointed by arrow)
6355期 高海波等:小麦—中间偃麦草异附加系Z4的外源染色质的分子标记
1.DNA marker;2.中间偃麦草;3.Z4;4.宛 7107
1.DNA marker;2.Thinopyrum intermedium ;3.Z4;4.Wan 7107
图 3　RAPD结果(左 S1053 ,右 S1068)
Fig.3　RAPD analysis of the addition line by S1053(lef t) and
S1068(right)
3　讨　论
关于中间偃麦草的染色体组成 ,在早期的研究
中 ,人们用 E1E2St作为其组成符号[ 13～ 14](E1 、E2 分
别来自 Th.elongarum 和 Th.besarabicum ,St来源
于 Pseudoroegneria)。后来 Chen[ 15 ～ 16]等的研究表
明 ,源自中国的中间偃麦草的染色体组成为 14 St +
7 J
s +21 J(St 来源同上 , Js 和 J 来自 Th.pon-
ticum),中 5的染色体组成为 40 W+4 St +2 Js+2
Js-W+2 S-S-Js+2 S-Js+2 S-J+2 W-Js(“-”指两个
不同染色体之间的易位 ,如W-Js和 J s-W 指小麦
与中间偃麦草基因组之间的易位)。Tang[ 17]等的研
究指出 ,Z4的染色体组成为 40 W+2 W -Js +2 Js
-W(其中W-Js 为 图 2中黄绿色信号区的较长的
一对染色体 , Js -W 指信号区较短的一对染色体)。
本研究的原位杂交结果也证明了异附加系 Z4的这
种相互易位结构 。
RAPD技术是一个使用方便 ,灵敏度高 ,安全性
能好的基因标记技术。Devos 和 Gale 等[ 18] 认为 ,
RAPD标记对于鉴定导入小麦中的外源染色体片断
尤其有用 ,迄今为止 ,已经获得了许多小麦抗锈病基
因的 RAPD标记[ 19～ 22] 。牛永春等[ 19] 找到了与抗
条锈基因 YrLee 连锁的 RAPD 标记 OPR07 , Ch-
ague等[ 20]发现两个与 Y r15 紧密连锁的 RAPD 标
记 ,Olivier Robert等[ 21]利用 RAPD技术对抗条锈基
因 Yr17 进行了定位研究 ,找到了与 Yr17 连锁的
标记 OPY15580 ,并将其转化为稳定的 SCAR标记 ,
陈晓红等[ 22]利用变性 PAGE-银染法找到了与 Y r5
完全 和紧 密 连锁 的 RAPD 标 记 S1320207 和
S1348363 。Naik , Siedler , Willam 等[ 23～ 26] 发现了抗
叶锈基因 Lr9 、Lr24 、Lr25 、Lr29 、Lr37 、Lr49 等的
RAPD标记。本研究使用 RAPD的方法在 Z4中找
到了中间偃麦草特有的 S1053和 S1068两个新的分
子标记 ,在利用 Z4 与普通小麦杂交育种时 ,可使用
这两个标记对杂交后代进行筛选 ,从而加速育种进
程 。
参考文献:
[ 1] 金善宝.中国小麦学[ M ] .北京:中国农业出版社 , 1996.783-
789.
[ 2] 陈国跃.人工合成六倍体小麦的遗传多样性研究与抗条锈病新
基因的发掘[ D] .中国农业科学院学位论文 , 2004.
[ 3] Colin H , Julian T , Brent M.Locat ing the broad-spectrum w heat leaf
rust resistance gene Lr52(LrW)t o chromosome 5B by a new cyto-
genet ic method[ J] .Theor Appl Genet , 2005 , 110:1453-1457.
[ 4] McIntosh R A.Catalog of gene symbols for w heat:2004 Supple-
ment.
[ 5] 王洪刚 ,刘树兵 ,亓增军 ,等.中间偃麦草在小麦遗传改良中的应
用研究[ J] .山东农业大学学报(自然科学版), 2000 , 31(3):333
-336.
[ 6] Cauderon Y , Saigne B , Douge M.The Resistance to Wheat Rusts of
Agropyron intermed ium and it s Use in Wheat Imp rovement [ J] .
Wheat Genet ic Symposium , 1973 , 4:401-407.
[ 7] 李振声 ,容珊 , 陈漱阳 ,等.小麦远缘杂交[ M ] .北京:科学出版
社 , 1985.
[ 8] 祁适雨 ,于世选 ,张耀辉 ,等.春小麦与天兰冰草远缘杂交育种的
研究[ J] .中国农业科学 , 2000 , 20(1):10-15.
[ 9] Lakin P J , Banks P M , Lagudah E S , et al.Disomic Thinopyrum in-
termedium addi tion lines in w heat with barley yellow dw arf vi rus re-
si stance and w ith rust resistance[ J] .Genome , 1995 , 38:385-394.
[ 10] 马有志 ,富田因则 ,中田升 ,等.应用分子原位杂交技术解析小
麦-天兰冰草部分双二倍体-远中 2号的染色体构成[ J] .遗传
学报 , 1997 , 24(4):344-379.
[ 11] Doyle J J , Doyle J L.Isolat ion of plant DNA from fresh ti ssue[ J] .
Focus , 1987 , 12:13-15.
[ 12] Williams J G K , Kubelik A R , Livak K J , et al.DNA polymorphism
amplified by arbit rary primers are useful as genetic markers[ J] .Nu-
cleic Acid Reseach , 1990 , 21:6531-6535.
[ 13] Liu Z W , Wang RRC.Genome analysis of Elytrigia caespi tosa ,
Lophopyrum nodosum , Pseudoregneria genicu lata ssp.scythica and
Thinopyrum intermedium[ J] .Genome , 1993 , 36:102-111.
[ 14] Zhang X Y , Dong Y S ,Wang R C.Characterization of genomes and
chromosomes in partial amphiploids of the hybrids Tr it icum aes-
t ivum × Th inopyrum pont icum by in situ hyb ridizat ion, isozyme
analysis and RAPD[ J] .Genome , 1996 , 39:1062-1071.
[ 15] Chen Q , Conner R L , Laroche A , et al.Genome analysis of
Thinopyrum intermedium and Th.pont icum using genomic in situ
hybridization[ J] .Genome , 1998 , 41:580-586.
[ 16] Chen Q ,Conner R L , Li H J , et al.Molecular cytogenetic discrimi-
nation and react ion to wheat streak mosaic virus and the wheat curl
mite in Zhong series of wheat- Thinopyrum intermedium patial am-
phiploids[ J] .Genome , 2003 , 46:135-145.
[ 17] T ang S X , Li Z S , Jia X , et al.Genomic in situ hyb ridization
636 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　18卷
(GISH)analysis of Thinopyrum intermedium , i ts partial amphiploid
Zhong 5 and disease resistant derivatives in wheat [ J] .T heor Appl
Genet , 2000 , 100:344-352.
[ 18] Devos K M , Gale M D.The use of random amplified polymorphic
DNA markers in w heat [ J] .Theor Appl Genet , 1992 , 84:567-
572.
[ 19] 牛永春 ,刘红彦.小麦品种“Lee”种抗条锈基因的 RAPD 标记
[ J] .高技术通讯 , 1998 , 12:11-14.
[ 20] Chague V , Fahima T , Dahan A , et al.Isolation of microsallite and
RAPD markers flanking the Y r15 gene of w heat using NILs and
bulked segxegant analysis[ J] .Genome , 1999 , 42:1050-1056.
[ 21] Oliver R , Christine A. Identif icat ion of molecular markers for the
detection of the yellow rust resistance gene Y r17 in wheat [ J] .
Molecular Breeding , 1995 , 5:167-175.
[ 22] 陈晓红 ,牛永春 ,胡宝忠.用变性 PAGE-银染法鉴定抗条锈基
因 Yr5 的 RAPD 标记[ J] .遗传学报, 2004 , 31(3):270-274.
[ 23] Naik S ,Gill K S , Prakasa R , et al.Ident ification of a STS marker
linked to the Aegi lops speltoides-derived leaf rust resistance gene
Lr28 in wheat[ J] .Theor Appl Genet , 1998 , 97:535-540.
[ 24] Siedler H , Schachermayr G , Gale M D , et al.DNA marked-based
analysis of near-isogenic wheat lines wi th Lr19 resistance gene[ A] .
Li Z S ,Xin Z Y , Proc.8th Intern Wheat Genet ics Symposium , Vol2
[ C] .Beijing:China Agricultural S ci Tech press , 1993.813-815.
[ 25] Willam H M , Hoisington D ,S ingh R P , et al.Detection of quanti ta-
tive t rai t loci associated with leaf rust resitance in bread w heat [ J] .
Genome , 1997 , 40:253-260.
[ 26] 杨文香 ,刘大群.小麦抗叶锈基因的定位及分子标记研究进展
[ J] .中国农业科学 , 2004 , 37(1):65-71.
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