全 文 ：·
138 3
· 第 二 军 医
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20 0 3De e; 2 4( 2 1)
大 l i
· 抢 著 ·
中药通光藤中通光藤昔 J的高效毛细管电泳分析
邢 旺兴 ` ’ “ , 程荣珍 “ , 林培英 ’ , 陈 斌 , , 必鹤鸣 ’ ,吴 玉 田 `
(1
. 第二军医大学药学院药物分析学教研室 , 上海 2 0 0 4 3 3 ; 2 .
有限公司 )
解放军第 117 医院药剂科 ,杭州 3 1 0 0 1 3 ; 3 . 杭州尖峰德康药业
[摘要」 呵 的 : 建立 中药通光藤中通光藤普 J 的高效毛细管电泳 ( c z E ) 分析 方法 。 方 法 :使 用空心熔融石 英毛细管 (7 5 拜m x
4 7 c m )
, 用苯甲酸为内标 , 背景电解质为含 2 0 % 乙睛的 5 0 m m ol / I矛 硼砂缓冲液 ( p H 9 . 28) , 运行 电压 2 0 kV , 温度 2 5 C , 重力进
样 , 时间 5 5 , 紫外检测波长 21 4 n m , 两次进样间用 0 . 1 m ol 月沪 氢氧化钠溶 液冲柱 1 m in , 以水冲柱 1 m in , 再用 电解 液冲柱 1
m in
。 姑 果 : 在 15 m in 内可实现通光藤普 J 的分离和测定 , 在 43 . 43 ~ 1 7 32 . 06 拜g / m l 范围内线性关系良好 ( : 二 0 . 9 8 5 , 、 -
6 ) ;加样 回收率 9 5 . 1% 一 10 4 . 7% , 平均 1 0 2 . 4% ; 日内 R S D毛 2 . 5 0 % 和 日间 R S D镇 5 . 1 6% ; 不同产地 ( 云 南昆明 X l一 X ; 、 贵州
贞丰 X S ) 、 不同化学部位 ( 乙醚部位 、 乙酸 乙醋部位 、 正 丁醇部位 、 5 0% 乙醇部位 、 9 5 % 乙醇部位 ) 和不 同制剂 (片剂 、 糖 浆 、 注 射
液 ) 中通光藤普 J 的含量均有显著不同 。 结抢 : 本 法简便 、 快速 、 准确 , 为科学评价通光藤药材质蚤提供了有效手段 。
仁关键词 ] 通光藤 ;通光藤普 J ; 电泳 , 毛细管
〔中图分类号〕 R 9 1 7 仁文献标识码 ] A [文章编号 ] 0 2 5 5 一 8 7 9X ( 2 0 0 3 ) 1 2 一 1 3 3 8 一 0 3
D e t e r m i n a t i o n o f t e n a e i s s o s i d e s J i n M a sr d e n i a t e n a e i s s i m a b y e a P i l l a r y z o n e e l e e t r o P h o r e s i s
X IN G W
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,
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,
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d M i li t a r y M e d ie a l U n i v e r s i t y
,
S h a n g h a i 2 0 0 4 3 3
,
C h i n a , 2
.
D e p a r t m e n t o f
P h a r m a e e u t ie a l P r e p a r a t i o n s
,
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1 1 7 H o s p it a l
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〔A B s T R A e T 〕 o b j e e t iv e : T o d e t e r m i n e t h e e o n t e n t s o f t e n a e i s s o s id e s J i n M泛sr d e n i a t e , a c i s s i m a b y e a p i ll a r y z o n e e l e e -
t r o P h
o r e s is ( C Z E )
.
M e t h
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e in t e r n a l
s t a n d a r d ( 1 5 )
, t h e e le e t r o P h o r e t i e s e p a r a t io n w a s a e h ie v e d
w i t h 2 0 %
a e e t o n i t r il
e i n 5 0 m m o l / I
J
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u f f e r ( p H 9
.
2 8 )
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n g b u f fe r a n d a v o l t a g e o f 2 0 k V w a s a p p l ie d t o t h e
4 7 e m 又 7 5 拌m ( ID ) e a P il la r y . T h e a n a ly s i s w e r e in t r o d u e e d in t o e a P il l a r y b y s i Ph o n ( 5 5 ) a n d d e t e r m in e d w i t h o n 一e o l u m n U V
m
o n it o r in g a t 2 1 4 n m
.
R e s “ I亡s : T h e d e r e r m i n a t io n e o u l d b e e o m p l e t e d w i t h i n 1 5 m in a n d t h e a n a l y t ie a l r e s u l t s o f s a m p l e s
d
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o n s t r a t e d a g o o d l in e a r r e l a t io n s h ip w it h in 4 3
.
4 3
一
1 7 3 2
.
0 6 拌g / m l . T h e r e l a t iv e s t a n d a r d d e v ia t io n (R S D ) o f in t r a 一 d a y w a s
l
e s s t h a n 2
.
5 0 %
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.
1 6 %
.
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e r e e o v e r ie s w e r e 9 8
.
1%
一
1 0 4
.
7 %
.
C o n e l u s i o n : C Z E 1
5 a e e u r a t e ,
5 im P l e a n d r e l ia b le
,
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o d e t e r m i n e t e n a e is s o s id e s J in M
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d
e n i a t e n a c i s s i从 a .
[K E v w o RD s 〕 材口 r s以e n i a t e n a c i s s i阴 a ; t e n a e is s o s id e s J ; e l e e t r o p h o r e s is , e a p i ll a r y
〔A e a d J S e c M i l M e d U n i v , 2 0 0 3 , 2 4 ( 1 2 ) : 1 5 3 8一 1 3 4 0 ]
化学成分研究发现 ,通光藤含幽体苦味醋普 、 通
光藤新昔类化合物及多糖和少量生物碱 、 树脂等 1[, 2〕 ,
具有广泛的生理活性川 。 其正丁醇提取部位主要含有
C
Z ; 街体昔类 成分 , 具有显著的抗生 育和抗肿瘤 活
性比 5 〕 ;通光藤昔 J 为以 95 % 乙醇提取的皂昔部位的
1 个主要成分 ,具有免疫调节和抗肿瘤活性 。
本研究采用高效毛细管电泳 ( h i g h p e r f o r m a n e e
e a p i l l a r y e l e e t r o p h o r e s i s
,
H p C E ) 中常用的毛 细管
区带电泳 ( e a p i l l a r y z o n e e l e e t r o p h o r e s is , C Z E )分离
模式 , 以 C 2 1幽体醋昔— 通光藤昔 J 为分析对象 ,通过减少管壁吸附 、 优选缓冲液体系及定性信息校
正等步骤 ,建立了分离分析通光藤药材及其制剂中
通光藤昔 J 含量的 C Z E 方法 , 为中药学研究提供一
种新的方法和手段 。
1 材 料
1
.
1 仪 器 系统 W a t e r C a p i l l a r y Io n A n a l y z e r (美
国 w a t e r s 公 司 ) ,数据的采集 、 分析和仪器的控制 由
工作站完成 ; H A 一 2 02 M 电子天平 ( 日本 A乙G 有限
公 司 ) ;熔融石英毛细管柱 (河北永年光导纤维厂 ) ;
p H S
一
c3 型酸度计 (上海雷磁仪器厂 ) , 8 0一 2 型离心
沉淀器 (上海手术器械厂 ) , T r a n s s o n i s 一 3 1 0 超声波
振 荡仪 ( 西 德 E lm a 公 司 ) ; Z o r b a x S P E C 18 一E C
C a r t ( 5 0 0 m g
,
6 m l ) 为 A g i l e n t T e e h n o l o g i e s 公司产
〔甚金项 目〕 全军 医学科研重点课题基金 (0 12 0 64) .
【作者简介〕 邢旺兴 ( 1 9 66一 ) ,男 (汉族 ) ,博士 ,副主任药师 .
,
C o r r e s p o n d i n g a u t h o r
.
E
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:
w u y t k@ o n l i n e
.
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.
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第1 2期 .邢旺兴 , 等 . 中药通光藤中通光藤昔 J 的高效毛细管电泳分析 一 1 3 3 9 .
品 。
1
.
2 试药 通光藤昔 J 对照品由作者 自行用柱层
析分离制备 , 纯度为 97 . 1% ; 通光藤制 剂消癌平片
(批 号 9 91 10 2 , 规格 1 . 5 9 /片 ) 、 消癌平糖 浆 (批 号
9 04 08
, 规格 5 9 / 1 0 m l) 及 消癌 平 注射 液 ( 批 号
0 0 0 10 6
,规格 20 9 / 2 0 m l) 均为中国河南新乡前卫制
药厂产品 ; 苯 甲酸 (内标 , IS )为化学对照品 ,购 自中
国药品生物制品检定所 , 批号 。 8 45 一 9 50 1 ; 硼砂为上
海云岭化工厂产品 , 乙睛为色谱纯 ,磷酸 、 氢氧化钠
等试剂均为分析纯 。
1
.
3 样品 采 自全国 5个产地的通光藤样品 ,分别
由必鹤 鸣教 授购 自云南 昆 明医 药药 材公 司 ( X l 、
X : )
、 解放军第 5 3 3 医院中医科采 自昆明 ( X 3 、 X 4 ) 、
郑水清硕士采 自贵州贞丰 ( X S ) 。 对 X 4 分取其幼枝
及叶再进行分析 ; 对 X : 采用热提法获得总提物 ,并
进一步得到其乙 醚部位 、 乙 酸乙 醋部 位 、 正丁醇部
位 、 95 % 乙醇洗脱皂昔部位和 50 写乙醇洗脱皂昔部
位等不同化学提取部位 。
2 方法和结果
2
.
1 样品制备和分析
2
.
1
.
1 标准溶液配制 精密称取通光藤昔 J 对照
品适量 ,用 甲醇溶解配制成 1 . 81 m g /m l 溶液 ;精密
称取苯甲酸适量 , 用甲醇溶解配制成 0 . 5 81 m g /m l
溶液为内标液 。
2
.
1
.
2 药材分析 通光藤茎粗粉 12 9 ,置 1 0 0 m l
烧瓶中 , 加 甲醇 3 0 m l , s o C水浴 回流提取 3 0 m i n ,
同法再 重复提取 2 次 , 合并提取 液 , 过滤后置 10 0
m l 容量瓶中 ,加甲醇定容至刻度即为贮存液 。 取 10
m l 贮存液减压浓缩至干 ,残渣用 0 . 5 m l 分离用硼
砂缓冲液溶解 ,加 内标溶液 2 0 川 ,并用分离用缓冲
液定容至 l m l , 滤膜 ( 0 . 45 拼m )过滤后按上述电泳
条件进行测定 。
2
.
1
.
3 化 学部 位 分 析 取 化 学 部 位 适 量 , 加
M
e ( ) H 适量使溶解 , 4 0 0 O r / m i n 室温离心 1 5 m i n ,
取上清液 0 . 2 m l ,加内标液 4 川 ,混匀 ,进样分析 。
2
.
1
.
4 通 光 藤制 剂 分析 利 用 固相提 取 技 术
( S P E )制备样品 ,分别取消癌平注射液 12 m l 、 消癌
平片 10 片 (称量 , 用水适量冷浸使崩解 ) 、 消癌平糖
浆 2 0 m l , 分次上 S P E 小柱 , 4 o o o r / m i n 室温离心
1 5 m i n
,水洗 2 次 ,用 2 . 5 m l 甲醇洗脱 , 4 O O0 r / m i n
室温离心 巧 m in , 洗脱液于 60 C水浴蒸 干 ,残渣加
甲醇 0 . 4 m l 溶解 , 4 0 0 0 r / m i n 室温离心 1 5 m i n ,取
上清液 0 . 2 m l ,加内标液 4 川 , 混匀 , 待测 。
2
.
2 分离条件的选择
2
.
2
.
1 检测波长 通光藤昔 J 最大紫外吸收波长
为 2 8 0 和 2 2 3 n m , 仪器 只配备 2 5 4 和 2 1 4 n m 检测
波长 , 为此 , 比较 21 4 n m 和 2 54 n m 的出峰数 、 峰
形 、 分离度 , 以 21 4 n m 为佳 , 因此 , 选择测 定波长
2 1 4 n m
o
2
.
2
.
2 p H 由于通光藤昔 J 含有多个经基 ,所 以
p H 的变化可以显著影响分离情况 , 比较不 同 p H 的
2 5 m m ol / L 硼砂缓冲体系 , 以 p H 9 . 28 的硼砂溶液
为佳 。
2
.
2
.
3 分离模式 选用 C Z E 和胶束电动毛细管色
谱法 (M E K c )两种分离方式考察对通光藤昔 J 分离
度的影响 , M E K C 中试验了 10 、 15 、 2 5 m m o l / L 3 种
S D S 浓 度 的 硼 砂 溶 液 , 发 现 C Z E 模 式 要 好 于
M E K C 模式 , 因此 ,本实验选用 C Z E 分离模式 。
2
.
2
.
4 硼砂浓度 考察了不同硼砂浓度对分离的
影响 。 结果表明 : 硼砂浓度增加能使昔的峰形改善 ,
柱效增加 ,选择 50 m m ol I/ J 硼砂液浓度 。
2
.
2
.
5 缓冲液 中乙睛浓度 在硼砂溶液中 ,加人乙
睛能使昔的峰形改善 。 增加 乙睛浓度 , 迁移时间增
加 , 且其 与 其他 组分 的分 离得 到显 著 改善 , 在含
2 0 % 乙睛 的 5 0 m m ol / L 硼砂溶液液中 , 昔及所选内
标可与其他组分较好的分离 。
2
.
2
.
6 内标物 考察 了苯甲酸 、 水杨酸 、 丁香酸 、 肉
桂酸 、 酮基布洛芬等 ,发现丁香酸的紫外吸收较差 ,
水杨酸有分解产物 ,酮基布洛芬的迁移时间过长 ,而
苯甲酸既可保证与所含组分分离 , 又可在相对较短
的时间内完成分析 。
2
.
2
.
7 运行 电压 电压增加 , 迁移时间缩短 , 但焦
耳热相应增加 , 因此 , 在考察 了 12 一 2 k V 后 发现
2 0 k V 较宜 。
在综合考虑分离度 、 分析时间 、 重现性等因素 ,
选择电泳条件如下 : 空心熔融石英毛细管 ( 75 拌m x
4 7 c m )
,背景电解质为含 2 0 % 乙睛 的 50 m m ol I/ J 硼
砂缓 冲液 ( p H 9 . 2 8 ) , 运行 电压 2 0 k V , 温度 2 5 C ,
重力进样 ,时间 5 5 , 紫外检测波长 2 14 n m , 两次进
样间用 0 . 1 m ol 八J 氢氧化钠溶液冲柱 1 m in , 以水
冲柱 1 m in ,再用 电解液冲柱 1 m in 。 在此条件下 ,通
光藤昔 J 和内标 的迁移 时间分别 为 5 . 45 m in 和
1 3
.
12 m i n
,完全分离 。
2
.
3 测定 方 法的评价
2
.
3
.
1 标准 曲线绘制 精取对照品溶液适量溶于
运行缓 冲液 中 , 再精密量取标准溶液适量于 10 m l
容量 瓶 , 分别加 入 内标液 0 . 2 m l , 使 昔 的浓 度为
4 3
.
4 3
、
9 0
.
7 8
、
1 8 9
.
7 2
、
3 9 6
.
5 2
、
8 2 8
.
7 3
、
1 7 3 2
.
0 6
拌g /m l , 内标浓度为 n . 62 拌g /m l 。 按上述电泳条件
·
3 14 0
·
第二军 医大学学报 2。。 3年 1 2月 , 第 24 卷
进行分离测定 。 在此浓度范围内昔与内标峰面积之
比 Y 和 浓 度 X 的 回 归 方 程 为 : Y = 0 . 0 19 67 十
0
·
1 0 7 I X
, n = 6
, r 一 0 . 9 9 8 5 ,表明线性关系良好 。
2
.
3
.
2 精密度 对浓度分别为 2 . 0 、 5 . 0 、 20 . 0 拼g /
m l 的昔对照品溶液进行 日内和 日间精密度实验 , 结
果 日内和 日间 R S D ( n = 3 )分别为 0 . 5 5% ~ 2 . 5 0 %
和 2 . 18 % ~ 5 . 16 写 ; 表明测定方法的重现性 良好 。
2
.
3
.
3 方法重现性 取标准溶液 (2 0 . 0 拌g /m l) 连
续 进样 6 次 , 测 得 迁 移 时间 的 R S D 为 0 . 36 % 一
1
.
6 5%
,峰面积的 R SD 为 1 . 5 4% ~ 7 . 1 1% 。
2
.
3
.
4 加样 回收率 精取通光藤粗粉适量 ,置 10 0
m l 烧瓶中 , 分别加人 6 . 4 、 12 . 8 、 2 5 . 6 拼g /m l 标准溶
液 ,按 2 . 1 . 2 药材分析项下的步骤进行测定 ,昔回收
率范围为 98 . 1% ~ 1 04 . 7% , 平均 10 2 . 4% , R S D蕊
3 %
。
2
.
3 样品 测 定 结果不 同产地的通光藤 中昔的含
量为 0 . 01 6 7 ~ 2 . 0 17 m g / g , 含量高低有相差 12 倍
之多 。 以 X ; 样品含量为最高 (2 . o l7 m g / g ) , 其次为
X
S 样 品 ( 1 . 2一7 m g / g ) , 而 x , 样 品 含 量 最 低
(0
.
o l6 7 m g / g )
,可见其质量控制的必要性 。 不同植
物部位中昔的含量不同 , 以 X ; 样品为例 ,其老茎 、 幼
枝及叶中昔的含量分别为 2 . 0 1 7 、 0 . 1 5 8 3 m g / g 和
0
.
0 1 6 7 m g / g
, 与其生理成熟过程相一致 。 通光藤的
不同化学部位中所含通光藤昔 J 的含量相差很大 。
以 X : 为例 , 含量最高为部位为 50 % 乙醇提取皂昔
部 位 ( 0 . 4 5 2 m g / g ) , 含量最低 的乙醚部位 ( 0 . 0 0 1
m g / g ) ; 乙 酸乙酷乳化层部位所含通光藤昔 J 的含
量与乙酸乙醋部位相近 (0 . 0 06 、 o . 0 04 m g / g ) ,一定
程度上说明这两个部位的化学成分相似 。 通光藤昔
J 在各化学部位中的变化规律为乙醇提取物 ( 0 . 03 5
m g / g ) 主要向正丁醇部位 (0 . 08 6 m g / g )转移 ,并进
一步富集于 5 0% 乙醇提取皂昔部位 (0 . 45 2 m g / g ) 。
通光藤制剂中通光藤昔 J 的含量较高为消癌平
注射液和消癌平糖浆 ,分别为 3 . 8 和 6 . 4 群g / g ,而消
癌平片的含量较低 ,只有 1 . 1 拜g / g 。
3 讨 论
通光藤制剂对食管癌 、 胃癌 、 肺癌等多种恶性肿
瘤有确切疗效 ,但现有通光藤药品的批准文号为地
方标准 ,其质量标准水平低下 , 未规定作含量测定 ,
只要求性状检查及皂昔类的鉴别试验 , 因此迫切需
要对能反映通光藤临床功效与药理作用的有效成分
进行定量控制 。
由于通光藤样品十分坚韧 ,溶剂较难渗透 , 因
此 ,实验中采取加热回流法提取 2 次 , 并使用对植物
组织渗透性好的甲醇代替乙醇为溶剂进行提取 , 以
尽可能提取完全 。
本实验建立的 C Z E 法 , 通光藤昔 J 与其他组分
的分离良好 ,能够对通光藤药材及其制剂 中含有的
C
Z ; 幽体昔类成分进行准确定量 ,为科学评价通光藤
药材质量提供了有效手段 。
致谢 : 感谢北京四环 医药科技股份有 限公 司对本课
题的资助 。
〔参 考 文 献 ]
「1」 罗思齐 ,徐光漪 ,易大年 , 等 . 通光藤中一个新 C 2 1菌族化合物
的化学结构测定〔J」. 化学学报 , 19 8 2 , 4 0 ( 4 ) : 32 1一 3 2 4 ·
仁2〕 S i n g h a l s , K h a re M P , K h a r e A . s t r u e t u r e o f a n e w d i s a e c h a r 记 e
m e t h y l g ly e o s id e f r o m t h e s e e ds o f M a rs d e o i a t。
。 a c i s s i m “ 「J〕.
I n d i a ” J C h e m ( S e c t B ) , 19 8 0 , 1 9B ( 5 ) ; 4 2 5一 4 2 8
.
[ 3 〕 Q i u S X , I u o S Q , I i n L Z , 。 t a l . F u r t h e r p o l y o x y p r e g n a n e s f r o m
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13 8 8
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仁收稿 日期〕 2 0 0 3一 0 4 一 1 0 [修 回日期〕 2 0 0 3一 0 7一 2 6
〔本文编辑」 曹 静 , 尹 茶
叫卜 一州卜一十 . 冲~ 翻刊卜 . 州卜一卜 . 叫卜 . 内卜 一司卜 . 叫卜 . 州卜 . 州卜~ 州卜一卜 。 刊卜一州 卜· 州卜
《中国临床康复 》征订启事
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