全 文 ：· 论　　著·
通光藤苷 J的 HPLC分析方法及应用
邢旺兴1, 2 ,郑筱祥 1 ,马炬明 2 ,邹晓华2　 ( 1.浙江大学生物医学工程和仪器科学学院 ,浙江杭州　 310027; 2. 解放
军第 117医院药剂科 ,浙江杭州　 310013)
[摘　要 ]　目的　建立通光藤中通光藤苷 J的高效液相色谱分析方法。方法　使用 Hypersil ODS色谱柱 ( 5μm, 250mm× 4. 5mm) ,
流动相: 乙腈 -水 -三乙胺 ( 8∶ 92∶ 0. 2, v /v /v ) ,流速: 0. 5ml /min,检测波长: 223nm,灵敏度 0. 5 AU FS,进样量: 20μl。结果　在 15分
钟内可实现通光藤苷 J的有效分离和测定 ,在 43. 8～ 1810μg /ml范围内线性关系良好 ( r= 0. 9995,n= 6) ;平均回收率为 97. 9% ,
RSD为 3. 45% ;日内 R SD 1. 66%和日间 R SD 2. 53% ;不同产地、不同提取部位中通光藤苷 J的含量均存在显著性差异 (P < 0. 05)。
结论　本法简便、快速、准确 ,为科学评价通光藤药材质量提供了有效手段。
[关键词 ]　通光藤 ;通光藤苷 J;高效液相色谱法
中图分类号: 　 R927　　文献标识码:　 A　　文章编号:　 1672-271X( 2006) 01-0012-03
Determination of tenacissosides J by HPLC and its application
X ING Wang-x ing1, 2 , Z HEN G X iao-x iang1 ,MA Ju-ming2 , ZOU X iao -hua2　 ( 1. College of Biomedical Engineering , Zhejiang
University , Hangzhou 310027, Zhejiang , China; 2. Department of Pharmaceutical Preparations, the 117th Hospital of P LA ,
Hangz hou 310013, Zhejiang , China )
[Abstract ]　 Objective　 To analysis the contents o f tenacissosides J by HPLC method. Methods　 Applied to the Hyper sil ODS
column( 5μm, 250mm× 4. 5mm) , the sepa ration w as achiev ed in acetonitrile-wa ter-triethylamine ( 8∶ 92∶ 0. 2, v /v /v ) as the mobile
pha se and a flow ra te o f 0. 5ml /min. 20μl sample of tenacissosides J w ere intr oduced into co lumn of and w ave leng th monito red at
223 nm and sensibility w as 0. 5 AUFS. Results　 The determination could be completed w ithin 15 min and th e ana ly tical results of
samples demonstrated a good linea r relationship(r= 0. 9995,n= 6) within the 43. 8～ 1810μg /ml. The r ela tiv e standa rd devia tion
(R SD) w as 3. 45% and tha t o f intra-day w as 1. 66% , inter-day w as 2. 53% . The average recoveries w er e 97. 9% . The contents of
tenacissosides J in differ ent producting place and o f ex tractiv e ma terials on differ ent po sition o f Ma rsdenia e tenacisso sides all had
significant diffe rence (P < 0. 05) . Conclusion　 Th e method is accura te, sim ple, sensitiv e and reliable, w hich can be applied to the
determina tion o f tenacisso sides J content.
[Key words ]　 Marsdenia e tenacissima; Tenacisso sides J; HPLC
　　化学成分研究发现 ,通光藤含甾体苷、甾体新苷类
化合物等多种化学成分 ,具有广泛的生理活性 [1～ 5 ]。其
正丁醇提取部位主要含有 C21甾体苷类成分 ,它们具有
显著抗肿瘤活性 ;通光藤苷 J为 95%乙醇提取的皂苷
部位的 1个主要成分 ,具有免疫调节和抗肿瘤活性 [3 ]。
为此 ,我们建立了分离分析通光藤药材总提取物及其
提取部位中通光藤苷 J含量的 HPLC方法 ,为通光藤
的进一步研究提供科学依据。
1　材　料
1. 1　仪器系统　高效液相色谱仪 (美国 Waters公司
产品 )包括 515泵 , 2487检测器 , Rheodyne 7725进样
阀 , SR2000色谱工作站 ; Cary 100双光束紫外可见分
作者简介:邢旺兴 ,男 , 1966年生 ,浙江诸暨人 ,药学博士 ,副主
任药师 ;研究方向:中药现代化和医院药学。
光光度仪 (V arian公司产品 ) ; p HS-3c型酸度计 (上海
雷磁仪器厂产品 ) ; 80-2型离心沉淀器 (上海手术器械
厂产品 ) ; AE240S电子分析天平 (梅特勒 -托利多仪器
上海有限公司产品 )。
1. 2　试药　通光藤苷 J对照品由作者自行用柱层析法
分离制备 ,纯度为 97. 1% ;通光藤药材购自昆明市医药
药材公司;甲醇、乙腈为 HPLC级 ,其余试剂为 AR。
1. 3　样品　采自全国 3个产地的通光藤样品 ,分别购
于云南昆明医药药材公司、解放军第 533医院中医科
采自昆明和采自贵州贞丰。 对昆明产的通光藤样品分
取其幼枝及叶再进行分析 ;对购自云南昆明医药药材
公司的样品 ,采用热提法获得总提物 ,并进一步得到其
不同化学提取部位。
1. 4　样品制备
1. 4. 1　标准溶液制备　精密秤取通光藤苷 J适量 ,用
甲醇溶解配制成 1. 81mg /m l溶液备用。
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《东南国防医药》 2006年 2月第 8卷第 1期
1. 4. 2　药材分析　通光藤茎粗粉 12g ,置 100ml烧瓶
中 ,加甲醇 30ml , 80℃水浴回流提取 30分钟 ,同法再重
复提取 2次 ,合并提取液 ,过滤后置 100ml容量瓶中 ,
加甲醇定容至刻度即为贮存液。取 10ml贮存液减压浓
缩至干 ,残渣用 0. 5ml分离用缓冲液溶解 ,并用分离用
缓冲液补足至 1m l,过滤 ( 0. 45μm)后按上述条件进行
分离测定。
1. 4. 3　提取部位分析　取提取部位适量 ,加甲醇适量使
溶解 , 4 000rpm离心 , 15min,取上清液直接进样分析。
2　方法和结果
2. 1　色谱方法的建立
2. 1. 1　色谱条件　色谱柱: Hypersil ODS, 5μm,
250mm× 4. 5mm (大连依利特科学仪器有限公司产
品 ) ,流动相:乙腈 -水 -三乙胺 ( 8∶ 92∶ 0. 2, v /v /v ) ,流
速: 0. 5m l /min,检测波长: 223nm,灵敏度 0. 5AU FS,
进样量: 20μl。
2. 1. 2　检测波长的选择　由于通光藤苷 J的最大吸
收波长为 223nm和 280nm ,且 223nm处的吸收远大于
280nm处 ,故选择 223nm为检测波长。
2. 1. 3　流动相选择　试验了甲醇、乙腈等不同体系 ,
经反复筛选 ,发现下述流动相较好: 乙腈 -水-三乙胺
( 8∶ 92∶ 0. 2, v /v /v )。
2. 1. 4　色谱图　在此色谱条件下 ,通光藤苷 J得到较
合适的分离 , tR约 7min,见图 1。
图 1　通光藤苷 J和通光藤样品的高效液相色谱
A. 标准品 ;　 B. 样品 ;　 TJ. 通光藤苷 J
2. 2　测定方法的评价
2. 2. 1　标准曲线制备　精密称取干燥至恒重的通光
藤苷 J适量用甲醇溶解于 1m l容量瓶中使成 1. 81mg /
m l溶液 ,再用流动相稀释成不同浓度的标准溶液 ,按
上述色谱条件分别进样测定 ,以样品浓度 ( C,μg /ml )
对峰面积 ( A)作线性回归 ,得直线回归方程为: A=
2300. 42C- 100510. 51,n= 6, r= 0. 9995,线性范围为
43. 8～ 1810μg /ml ,表明线性关系良好。
2. 2. 2　精密度实验　取 1待测溶液 ,重复进样 6次 ,每
次 20μl,测定其含量的 RSD为 0. 57% ,见表 1,表明测
定方法的重现性良好。
表 1　精密度实验结果 (n= 6)
序号 积分面积 均值 RSD (% )
1
2
3
4
5
6
2281624. 6
2243606. 0
2255198. 6
2268399. 4
2263180. 5
2258354. 7
2261727. 3 0. 57
2. 2. 3　稳定性试验　取同一待测溶液 ,在室温条件
下 ,日内每 4小时测定 1次 ,共 3次 ,日间测定 3天 ,分别
计算 RSD值 ,分别为 1. 66%和 2. 53%。 见表 2。
表 2　稳定性试验结果 (n= 3)
序号 积分面积 均值 RSD (% )
日内
日间
2243606. 0
2221354. 1
2294305. 8
2275847. 3
2291632. 4
2185981. 6
2253088. 6
2251153. 8
1. 66
2. 53
2. 2. 4　重复性试验　平行称取干燥量待测样品 5份 ,
同法制备和进行 HPLC测定 , RSD为 3. 09%。见表 3。
表 3　重复性试验结果 (n= 5)
序号 积分面积 均值 RSD (% )
1
2
3
4
5
2484321. 6
2459754. 5
2598832. 6
2587932. 7
2426345. 5
2511437. 4 3. 09
2. 2. 5　加样回收率试验　取 1待测样品 ,分别加入其
含有量的 0. 5倍、 1倍、 2倍的通光藤苷 J甲醇溶液 ,各 3
份 , 60℃烘干 ,按样品测定方法制备和测定 ,得到平均
回收率为 97. 9% 。见表 4。
表 4　加样回收率试验结果 (n= 3)
样品 加入量
( mg )
测得量
( mg )
回收率
(% )
平均回收率
(% )
R SD
(% )
X1
0. 356
0. 712
1. 424
0. 336
0. 721
1. 397
94. 4
101. 3
98. 1
97. 9 3. 45
2. 3　样品分析
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《东南国防医药》 2006年 2月第 8卷第 1期
2. 3. 1　不同产地通光藤的分析　用所建立的方法对
不同产地的通光藤进行了测定 ,可见不同产地通光藤
中所含 C21甾体苷成分通光藤苷 J的含量相差较大 ,总
含量为 0. 001%～ 0. 253% ,含量最高为解放军第 533
医院第 2次提供的样品 ,高达 0. 253% ,含量最低的为
第 1次从云南昆明医药药材公司所购样品 ,为
0. 001% ,而从贵州贞丰县所购黑骨藤中未能测到通光
藤苷 J;不同产地的通光藤药材中所含 C21甾体苷成分
通光藤苷 J的含量差异最终会反映在药效学上的差
异 ,提示我们应注意其药材的道地性 ;另外 ,同一药材
的不同部位 ,通光藤苷 J含量相差较大 ,从叶、嫩茎、老
茎顺序 ,含量依次提高 ,说明通光藤中通光藤苷 J成分
的积累与通光藤的成熟过程相一致 ,提示我们应用通
光藤最好取用其老藤部位。由于药材来源不多 ,目前尚
无法作出定论 ,需进一步收集样品和分析测定 ,并结合
药效学试验结果 ,以判断其道地产区。
2. 3. 2　通光藤不同提取部位的分析　结果见表 5。
表 5　通光藤不同提取部位通光藤苷 J的含量 ( mg /m l)
序号 提取部位 测得量 峰面积 含量
1 乙醇总提物 9. 72 5699025. 3 0. 28
2 乙醚提取部位 20. 88 1158008. 4 0. 02
3 乙酸乙酯提取部位 13. 31 1035786. 4 0. 04
4 乙酸乙酯乳化层 27. 80 3027433. 7 0. 05
5 正丁醇提取部位 5. 27 8213710. 1 0. 74
6 50%皂苷部位 5. 02 47096138. 5 4. 43
7 95%皂苷部位 3. 75 685395. 4 0. 08
　　应用 HPLC法对通光藤的不同提取部位进行分
析 ,考察 C21甾体苷类成分在通光藤中的变化规律 ,对
探讨通光藤化学成分与药理活性的关系 ,应是一种有
益的尝试和探索。由表 5可见 ,通光藤的不同提取部位
中所含 C21甾体苷成分通光藤苷 J的含量相差很大 ,含
量最高为 50%皂苷部位 ,达 0. 443% ,含量最低的是乙
醚部位 ,为 0. 002% ;乙酸乙酯乳化层部位所含 C21甾体
苷成分通光藤苷 J的含量与乙酸乙酯部位相近 ,一定
程度上说明这 2个部位的化学成分相似 ;通光藤苷 J在
各提取部位中的变化规律为乙醇总提物 ( 0. 028% )主
要向正丁醇部位 ( 0. 074% )转移 ,并进一步富集于 50%
皂苷部位 ( 0. 443% ) ,这应该反映了通光藤所含 C21甾
体苷成分的普遍规律 ,提示我们与 C21甾体苷成分相关
的药理活性应为 50%皂苷部位为终极部位。
3　讨　论
已有多项试验证明 ,通光藤制剂对食管癌、胃癌、
肺癌等多种恶性肿瘤有确切疗效 [6, 7 ] ,但现有通光藤药
品的批准文号为地方标准 ,其质量标准水平低下 ,未规
定作含量测定 ,只要求了性状检查及皂苷类的鉴别试
验 ,因此迫切需要对能反映通光藤临床功效与药理作
用的有效成分进行定量控制。
通光藤苷 J为作者从通光藤中发现的 2个新 C21甾
体苷类成分之一 [3 ] ,通光藤苷 J具有免疫调节和抗肿
瘤活性 ,为此我们建立了中药通光藤中通光藤苷 J的
高效毛细管电泳分析法 [ 8] ,可实现通光藤苷 J的有效
分离和测定 ,方法简便、快速、准确 ,为科学评价通光藤
药材质量提供了有效手段 ,但考虑到高效毛细管电泳
仪国内尚未普及 ,故拟建立多数单位广为应用的高效
液相色谱测定法。
由于通光藤样品十分坚韧 ,溶剂较难渗透 ,因此 ,
实验中采取加热回流法提取 2次 ,并使用对植物组织
渗透性好的甲醇代替乙醇为溶剂进行提取 ,以尽可能
提取完全。流动相中乙腈浓度的变化可显著影响通光
藤苷 J的色谱行为 ,当乙腈浓度增大时 ,通光藤苷 J的
保留时间明显缩短 ,反之 ,则显著延长。
本实验建立了通光藤苷 J的 HPLC方法 ,通光藤
苷 J与其它组分的分离良好 ,并用于测定不同产地、不
同提取方法通光藤中通光藤苷 J的含量 ,能够对通光
藤药材及其化学部位中含有的 C21甾体苷类成分进行
较准确的定量 ,具有操作简便、结果准确可靠、重现性
好、专属性强等特点 ,为科学评价通光藤药材的质量提
供了有效手段 ,也为进一步研究通光藤制剂、通光藤苷
J药效学及开发新药提供了科学依据。
参 考 文 献
[1 ]　邢旺兴 ,程荣珍 ,陈园昕 ,等 .通光藤的药理作用与临床应用 [ J ].
中南药学 , 2003, 1( 4): 229～ 231.
[ 2 ]　木全章 .香港科技大学生物技术研究所中药研究与开发综述
( 1997～ 1999) [M ] .北京:科学出版社 , 2000. 223～ 254.
[3 ]　邢旺兴 ,陈　斌 ,宓鹤鸣 ,等 .通光藤中两个新 C21甾体苷类成分
[ J] .药学学报 , 2004, 39( 4): 272～ 275.
[4 ]　邢旺兴 ,陈　斌 ,宓鹤鸣 ,等 .通光藤的化学成分研究 [ J] .中国中
药杂志 , 2004, 29( 12): 1148～ 1151.
[5 ]　邢旺兴 ,陈　斌 ,张玉荣 ,等 .中药通光藤中脂溶性成分的 GC-M S
分析 [ J] .中草药 , 2004, 35( 12): 1339～ 1341.
[6 ]　孙　珏 ,沈建华 ,朱美华 ,等 .消癌平对人胃癌细胞治疗作用的实
验研究 [ J ].上海中医药大学学报 , 2000, 14( 2): 41～ 43.
[7 ]　孙　珏 ,沈建华 ,朱美华 ,等 .中药消癌平针剂经肝动脉介入治疗
转移性肝癌的临床研究 [ J ].上海中医药杂志 , 2000, 34( 1 ): 14～
17.
[8 ]　邢旺兴 ,程荣珍 ,林培英 ,等 .中药通光藤中通光藤苷 J的高效毛细
管电泳分析 [ J ].第二军医大学学报 , 2003, 24( 12): 1338～ 1340.
(收稿日期: 2005-06-20;修回日期: 2005-09-05)
　　 (本文编辑　邵达泉 )
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《东南国防医药》 2006年 2月第 8卷第 1期