全 文 ：第 24 卷 第 2 期
1 9 9 8 年 3 月
作 物 学 报
A C T A A G R O N O M IC A S I N I C A
V
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.
2 4
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2
1 9 9 8
小麦 一中间堰麦草部分双二倍体 “ 中 5 ” 的
外源染色体的鉴定 `
马有志`
中田 升“
徐琼芳` 辛志勇` 富田 因则2
安室喜正 2 福井希一 3, ”
( ’中国农业科学院作物育种栽培研究所农业部作物遗传育种重点实验室 北京 , 10 0 0 81 ; “ 日本鸟取大学
农学部育种学研究室 , 鸟取 , 6 80 ; “ 日本农林水产省北陆农业试验场 ,上越 , 9 4 3一 0 1 )
提 要 应用染色体分带 ( c 一带 ) 一分子原位杂交技术对普通小麦一中间僵麦草 (hT lnD p y ur m ntI er -
m ed iu m nZ 一 42 , EI EI E ZE : x x )部分双二倍体 “ 中 5 ” ( 2n 一 56) 的外源染色体进行了鉴定分析 。 染色体分
带结果表明 : “ 中 5 ” 的 7对中间堰麦草染色体不显带或显示出与受体小麦亲本染色体相似的带型 , 单
靠带型很难准确地鉴定出这 7 对外源染色体 。 分带处理后进行分子原位杂交鉴定出 “ 中 5’ 的 7 对外源
染色体 , 并发现其中一对染色体发生了罗伯逊氏易位 (R ob er t so n i an t ar n sl oc at io n) 。 表明染色体分带技
术与分子原位杂交技术的有机结合 , 可以大大提高染色体的鉴定水平 。
关键词 中间堰麦草 ; 小麦 ; 部分双二倍体 ; 染色体分带 ; 分子原位杂交
中间堰麦草 (或天蓝冰草 , hT in oP y ur m int e~ d iu m 或 A g or P y r溯 in t~ ed iu m nZ 一 42
,
E I IE E
Z
E
Z
X X )是小麦属的野生近缘种 , 具有耐旱 、 抗寒和多种病害 (如 : 叶锈 、 条锈 、 秆锈病
及大麦黄矮病 )的抗性基因2j[ 。 因此 , 它做为小麦品种改 良的外源基因源受到了广泛的重视 。
早在 50 年代末期 , 黑龙江农业科学院就开展了普通小麦 ( T浓 ic “ m ae st iv u m )与中间堰麦草的
远缘杂交育种 , 并选育出小麦一中间堰麦草部分双二倍体 (2 n 一 56 ) , “ 中 1 ” 、 “ 中 2 ” 、 “ 中 3 ” 、
“ 中 4 ” 和 “ 中 5 ” 。 这些材料已成为我国许多育种单位进行抗病育种的中间材料 。 尽管如此 , 由
于至今尚没有对这些材料进行深入的细胞学分析 , 对它们的遗传基础缺乏了解 。
染色体分带及以染色体组 D N A 为探针的分子原位杂交 ( G en o m i。 in 疵 u h y br i id az it on ,
G IS H )技术都是进行染色体鉴定的有效方法 。 不过 , 染色体分带技术无法鉴定那些没有特征
带的染色体或染色体片段 ; G IS H 只能对外源染色体与受体亲本染色体加以区分 , 而外源染
色体相互之间却不易区分 。 进行染色体分带一 G IS H 处理 , 即用同一张染色体标本 , 在染色体
分带处理后进行 G IS H 处理 , 可以将两种技术的优势结合起来 , 相互取长补短 , 大大提高了
染色体的鉴定水平 。 iJ an g 和 iG l[ ` 1〕首次应用染色体分带一分子原位杂交技术鉴定了小麦一黑麦
易位系中的外源染色体片段 。
我们利用染色体分带一 G IS H 技术鉴定了 “ 中 5 ” 具有的中间堰麦草染色体 , 报道如下 。
1 材料与方法
1
.
1 材料
供试材料中间堰麦草及 “ 中 5’ 的种子由黑龙江农业科学院祁适雨先生惠赠 。
, 国家 8 63 计划及国家自然科学基金资助项目 。 ` . 联系人 。
收稿日期 : 1 9 9 6一 1 2一 2 6 , 收到修改稿日期 : 1 9 9 7一 1 0一 14
作 物 学 报 2 4 卷
1
.
2 染色体分带
应用酶解法制作染色体标本 。 参照 Gi n 等人 [9j 的方法对 “ 中 5’ 的体细胞中期染色体进行
C
一带处理 。 选择带型清楚的细胞进行照相记录 , 然后 , 将染色体标本在 70 %酒精中脱色后 ,
进入原位杂交 。
L 3 分子原位杂交
1
.
3
.
1 染 色体组 D N A 的提取和标记 参照 T o m it a 等 ls[ 〕的方法提取中间堰麦草和普通小
麦品种中国春的染色体组 D N A , 并按随机引物法以生物素 ( ib ot i n 一 1 6一d U T P )标记中间堰麦草
染色体组 D N A 。
1
.
3
.
2 原位杂交前的染 色体标本的预处理 将 6 0 0 拌l 的 R N a s e A ( 3 m g /m l S ig m a 公司 )
加到染色体标本上 , 37 ℃温育 1 小时 。 然后 , 在 70 % 、 95 % 、 9 %的酒精中依次脱水 , 每步 5
分钟 , 最后取 出空气干燥 。
1
.
3
.
3 分子原位杂交 将 15 川杂交液 (包含 : 50 % 甲酞胺 、 Z x S S C 、 10 陀鱿鱼精 D N A 、
60 gn 探针 D N A 、 8 ~ 10 拜g 封闭 D N A )在 85 一 92 ℃水浴锅中变性处理 10 分钟后 , 迅速转入
冰水中保持 5 ~ 10 分钟 。 然后 , 将杂交液滴加到经过预处理的染色体标本上 , 加盖片 、 封片 ,
置于分子原位杂交仪上 ( P H C 一 3 T ec h n e 公司 ) , 37 ℃温育 6 小时以上 。
1
.
3
.
4 杂交后 的漂洗 、 荧光信号的放大及检浏 均参照 F uk ul 等 8j[ 的方法进行 。 IF T C 和
IP 的荧光信号分别采用 B 激发滤光片组和 G 激发滤光片组检测 。 照相用 K od ak 15 0 1 0 彩色
胶卷 。
2 结果
“ 中 5 ” (2 n 一 56 )具有 21 对小麦染色体和 7 对中间堰麦草染色体 , C 一分带结果表明 : 除 B
染色体组的 7 对染色体及 ZA 、 ZD 、 4 A 等染色体具有明显的特征带 , 可以鉴定出来之外 。 其
它的小麦染色体由于具有同中间堰麦草染色体相似的带型 , 很难准确地使它们彼此分开 (图
A )
。 因此 , 单独使用 C 一分带技术不可能将 “ 中 5 ” 的外源染色体准确地鉴定出来 。
为了能准确地鉴定出“ 中 5” 的中间堰麦草染色体 , 针对图 A 的细胞又以生物素标记的中
间堰麦草染色体组 D N A 为探针 , 以普通小麦品种中国春的染色体组 D N A 为封闭 D N A 进行
了分子原位杂交 。 结果如图 B 所示 。 “ 中 5’ 具有的 56 条染色体中 , 有 14 条染色体呈现出黄绿
色杂交信号 , 说明这 14 条 (7 对 )染色体是来自中间堰麦草 , 其中一对染色体的长臂与小麦染
色体发生了罗伯逊氏易位 ( R o b e r t s o n ia n t r a n s l o e a t i o n ) 。 将图 A 与图 B 进行对照分析 , 借助染
色体的形态及带型特征 , 可以将 “ 中 5 ” 的 7 对中间堰麦草染色体准确地相互区分 、 鉴定出来
( 图 A 、 B 、 C ) 。 本文将 “ 中 5’ 的 7 对中间堰麦草染色体分别记为 “ 中 5 ” iT 一 1 、 “ 中 5 ” iT 一 2 ~
“ 中 5 ” T i一 7 。 它们的形态及带型特征如下 :
“ 中 5 ” T i一 1 : 中部着丝点染色体 (臂比 : 1 . 3 ) , 两臂具有端带 。
“ 中 5 ” T i一 2 : 中部着丝点染色体 (臂比 : 1 . 1 2 ) , 短臂具有端带 。
“ 中 5” T i一 3 : 中部着丝点染色体 (臂 比 : 1 . 30 ) , 短臂具有端带 。
“ 中 5” T i一 4 : 近中部着丝点染色体 (臂比 : 1 . 8 7 ) , 不显带 。
“ 中 5 ” T i一 5 : 中部着丝点染色体 (臂 比 : 1 . 2 0 ) , 不显带 。 该染色体的长臂被小麦的染色体
片段置换 。
“ 中 5 ” T i一 6 : 中部着丝点染色体 (臂比 : 1 . 3 7 ) , 除两臂具有端带外 , 短臂上还具有一条中
2 期 马有志等 : 小麦一 中间堰麦草部分双二倍体 “ 中 5 ” 的外源染色体的鉴定
间带 。
“ 中 5 ” T i 一7 : 中部着丝点染色体 (臂比 : 1 . 25 ) , 不显带 。
3 讨论
近年来 , G IS H 技术广泛应用于细胞及分子遗传学研究 , 并 已逐渐成为一项基本的实验
技术 。 应用该技术进行染色体组型分析 , 不仅可以有效地对异源多倍体植物的各染色体组进
行鉴定 , 同时还可以检测出各染色体组间存在的染色体结构变异 1[, ` “ , ` 3〕 ; 应用 G IS H 技术使
对一些利用染色体分带无法识别 的外源染色体或染色体片段进行鉴定成为可能 , 并可以准确
地鉴定出易位染色体易位片段的大小及易位点的位置川 。 进一步将染色体分带 、 G IS H 技术
有机结合 , 更使染色体的鉴定水平有了进一步的提高 。 G IS H 及染色体分带 、 G IS H 技术将成
为今后进行染色体组型分析及鉴定特定染色体或染色体片段的核心技术 。
通常 , 影响分子原位杂交效果的因素有染色体标本制作质量 、 分子杂交的条件 (包括杂
交液成份 , 如甲酞胺浓度 、 盐离子浓度等 , 及杂交温度 )及杂交后洗涤的强弱 。 一般认为 , 应
用酶解法制作染色体的标本 , 探针比较容易进入核内与染色体 D N A 进行分子杂交 , 获得 比
较理想的结果 ; 降低杂交液中的 甲酞胺浓度及提高盐离子浓度都可促进分子杂交 , 但同时也
降低了分子杂交的特异性 。 此外 , 影响 G IS H 成功与否的另一重要 因素是探针与封闭 D N A
的比例及封闭 D N A 片段长度大小 。 G IS H 是以各染色体组亲缘关系存在一定差异为前提的 ,
因此 , 在理论上 , 染色体组亲缘关系愈远 , G IS H 就愈容易成功 。 探针与封闭 DN A 的比例要
根据染色体组间亲缘关系远近及 D N A 的纯度而定 。 例如 , M u k a i 等〔` 3 ]及 s e h w a r z a e h e r 等 [“ ]
分别以黑麦染色体组 D N A 为探针 , 以“ 中国春 ” 染色体组 D N A 为封闭 DN A , 鉴定了导入 “ 中
国春 ” 的黑麦染色体 。 而他们采用的探针与封闭 DN A 的比例是不同的 , 前者是 1 : 2 , 后者是
1 : 3 5
, 两者的差异可能是来自封闭 D N A 的纯度不同 。 cS h w ar az hc e r 等山〕在利用 G IS H 技术
鉴定导入小麦的 介 . 占e s s a励 ic u m 、 五e 夕m u : m u zt比a u zis 、 万邵己e u m c 人ile n s e 、 H . v u l g a er 的染色
体时 , 采用的探针 比封闭 D N A 为 1 : 15 一 30 。 在本实验中采用的比例约为 1 : 10 0 。 山羊草属
与小麦属亲缘关系较近 , 通常用 G IS H 很难区别两属的染色体组 , K od o a dn M u ka il Z〕通过改
变探针与封闭 D N A 的比例及调整封闭 D N A 片段的长度成功地鉴定出两属的染色体组 。 本
实验中封闭 D N A 片段长度约为 5 0 0 b p 。 可见 , 在应用 G IS H 技术时 , 调整合适的探针与封闭
D N A 的比例及适当的封闭 D N A 片段长度尤为重要 。
本实验利用 C 一分带一 G IS H 技术 , 首次鉴定出 “ 中 5 ” 具有的 7 对中间堰麦草染色体 , 发现
染色体 “ 中 5 ” iT 一 5 的长臂被小麦染色体某一臂置换 , 形成罗伯逊 氏易位染色体 。 再一次说明
应用染色体分带一分子原位杂交技术进行外源染色体或染色体片段的鉴定是可行的 。 另外 , 我
们对 “ 中 3 ” 和 “ 中 4 ” 的染色体组成也进行了同样的分析 , 也发现了与“ 中 5” iT 一 5 染色体类似的
罗伯逊氏易位染色体 。 由此看来 , 在小麦一中间堰麦草部分双二倍体中 , 这种小麦与外源染色
体间自发的罗伯逊氏易位是普遍存在的 。 这有利于将外源基 因导入小麦 。
中间僵麦草由 E l 、 E Z 、 X 3 个染色体组组成 , 其中 E , 和 E : 染色体组是起源于二倍体长
穗堰麦草 ( hT . 刁臼之ga ut m , E E , 2n 一 1 4 ) , X 染色体组的起源尚不清楚 s[, `〕。 rF ieb e 等 6j[ 分析 了
中间堰麦草的染色体核型 , 发现 21 对中间僵麦草染色体中 , 有 14 对染色体具有明显的带型 ,
另 7 对染色体没有明显带型 。 由于二倍体长穗堰麦草的 7 对染色体都显示出明显的 C 一带困 ,
由此他们推测 14 对具有明显的带型的染色体是来 自 E , 或 E Z 染色体组 6j[ 。 在本实验中 , 根据
1 3 2 作 物 学 报 2 4 卷
“ 中 5 ” 的 7 对中间堰麦草染色体的带型特征 , 可以推测染色体 “ 中 5 ” iT 一 1 、 “ 中 5 ” iT 一 2 、 “ 中 5”
iT
一
3
、 “ 中 5 ” T i一 6 是来 自 E l 或 E : 染色体组 , 其余不具有明显带型的 3 对染色体可能是来 自 x
染色体组 。
参 考 文 献
1 马有志 、 徐琼芳 、 辛志勇 , 1 9 9 6 , 生物技术与作物种质资源研究学术讨论会 , 67 一 68
2 C a u d
e r o n , Y
.
B
. ,
19 7 3
,
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1 9 8 4
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. , 19 8 1
,
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, 4 8 1一 4 9 2
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, 2 6 , 66 9一 6 7 8
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,
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. ,
1 9 92
,
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.
, 8 4 , 8 9 9 ~ 9 0 5
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, 1 99 3
,
T h e o r
.
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. ,
8 6
, 1 4 1 ~ 一4 9
8 F u k u i
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, 1 9 9 4
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. , 8 7 , 8 9 3~ 8 99
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. , 19 9 1
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e , 3 4 , 8 3 0 ~ 8 3 9
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.
5
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, 1 9 9 3 , G e n o rn e
, 3 6 , 7 9 2一 7 9 5
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, 1 99 2
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5
.
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, 19 9 2
,
J p n
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J
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. ,
6 7 , 7 1 ~ 8 3
14 cS h w a r z a e h e r
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T
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,
T h e o r
.
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8 4 , 7 78一 7 8 6
15 T o m i t a
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, 1 9 93 , In
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.
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. , 7 8 7一 7 9 1
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