全 文 ：2009年第6期 总第163期2009年第6期 总第163期CAOYE YU XUMU 草业与畜牧 CAOYE YU XUMU草业与畜牧
王 娟
（宁夏大学生命科学学院，宁夏 银川 750021）
草地早熟禾高效丛生芽体系的建立
收稿日期：2008-11-24
作者简介：王娟（1982- ），女，河南省汝阳县人，硕士，助
教，现从事植物基因工程研究。
摘 要：本试验以草地早熟禾无菌种子苗茎尖为外植体，建立了高效的草地早熟禾丛生芽离体培养体系。结果表
明：茎尖在附加0.5 mg/L 2，4-D和3.0 mg/L 6-BA的MS培养基上可诱导茎尖部位基部膨大，且诱导率最高。膨大的基部
在2.0 mg/L 6-BA的丛生芽诱导培养基上，其诱导频率最大，然后将丛生芽转入附加3.0 mg/L 6-BA和0.07 mg/L 2，4-D
的培养基上可进行继代培养，丛生芽在 1/2MS培养基上生根率达100%。
关键词：草地早熟禾；丛生芽；离体培养
中图分类号：S688.4 文献标识码：A 文章编号：1673-8403（2009）06-0042-04
草地早熟禾（Poa pratensis L.）是温带地区最重
要的草坪草种之一。由于它具有色美、抗寒能力强、
耐荫、耐修剪等优点，在我国西北和华北地区被广泛
用作建坪草种[1]，但草地早熟禾也有其自身的缺点，
如耐高温能力差、不耐炎热、易受病虫危害和抗旱性
不强等 [2]，这些都极大地制约了草地早熟禾在夏季炎
热地区的进一步推广，因此有必要对草地早熟禾进行
品种改良。但由于草地早熟禾具有兼性无融合生殖的
特性[3]，采用常规育种技术改良这些不利性状难度
大，成功率低，因此采用基因工程手段培育早熟禾新
品种的工作受到国内外学者的重视，但由于草地早熟
禾组织培养和植株再生体系的不完善，导致早熟禾遗
传转化工作进展较慢。目前，国内外仍在草地早熟禾
组织培养和植株再生方面进行大量研究。最早的对草
地早熟禾进行组织培养研究的是1984年，McDonnell
和Conge[4]用成熟种子诱导产生胚性愈伤组织，但植株
再生率很低。此后，Van Ark[5]，Boyd[6] ，韩烈保[7]等以
种子，Van der Valk[8]以花序为外植体，分别诱导获得
了早熟禾的愈伤组织，但分化能力很低。朱根发[9]等
以草地早熟禾胚轴及幼穗为外植体，研究了其培养条
件和分化能力，研究表明草地早熟禾成熟胚愈伤组织的
胚胎发生能力很差，胚轴也很难诱导出具较高分化能力
的愈伤组织，二者均不是理想的外植体，可通过幼穗培
养出胚性愈伤组织，但用幼穗作外植体要受季节的限
制，操作也不太方便。Van der Valk[10]还建立了草地早
熟禾的原生质体悬浮培养体系，但未得到正常植株，
只获得了白化苗。皮伟[11]用种子和幼胚轴作为外植体
进行愈伤组织诱导和分化，虽然通过对培养基的改
良，可得到具有较高分化率的愈伤组织，但仍然不能
满足基因转化对组织培养再生率的要求。此外，佘建
明[12]等发现在继代培养中，早代选择外表呈干燥、紧
密、颗粒状愈伤组织能有效地克服随着继代培养时间
的延长愈伤组织再生植株能力显著下降这一障碍，但
同样也不能满足遗传转化对受体再生能力的要求。由
于受体系统难以建立和植株再生能力差，至今只有几
个实验室获得了转基因草地早熟禾植株[13~15]，因此找
到合适的受体系统对于利用基因工程手段来改良草地
早熟禾品质的研究有重要意义。本试验以草地早熟禾
无菌种子苗茎尖为外植体，诱导其基部愈伤化膨大，
然后于丛生芽诱导培养基上分化形成丛生芽，通过研
究不同外源激素对基部膨大诱导和丛生芽产生的影
响，以期建立高效的草地早熟禾离体丛生芽培养体
系，为草地早熟禾的遗传转化提供良好的受体系统。
1 材料与方法
1.1 材料
选用草地早熟禾栽培品种纳苏（Nassau） 和
Mardona的成熟种子。
1.2 培养基
基本培养基为MS培养基：附加 30 g/L 蔗糖，
200 mg/L水解酪蛋白（CH），6.5 g/L琼脂，调节pH值
5.8~6.0，120℃灭菌20 min。基部膨大诱导培养基中
附加不同浓度的6-BA和2，4-D。成丛培养基只附
加不同浓度的6-BA。继代培养基中附加0.07 mg/L
2，4-D和3.0 mg/L 6-BA。生根培养基为1/2MS培养基。
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1.3 方法
1.3.1 种子苗的获得：种子经70%乙醇灭菌3 min，
0.2% HgCl2灭菌5，10，15，20 min，无菌水冲洗数
次，然后接种于灭菌的内有3层湿润滤纸的三角瓶
内，温度25±2℃，黑暗条件下培养。
1.3.2 基部膨大的诱导培养：待胚芽伸长至2~5 cm，
切取生长点两侧约2~3 mm左右的茎尖部位，接种到
含有不同浓度2，4⁃D和6⁃BA的基部膨大诱导培养基
上培养。培养条件为温度25±2 ℃，光照12 h/d，光
照强度800~1 000 Lx。15~20 d后形成基部愈伤化膨大
的小苗，20 d后统计基部膨大的诱导率。
1.3.3 丛生芽的诱导培养：将20 d后形成的基部膨大
的小苗，切去叶片，留膨大的基部转到含有不同浓度
6⁃BA的丛生芽诱导培养基上培养。培养条件为温度
25±2 ℃，光照12 h/d，光照强度800~1000 Lx。15~
20 d后形成丛生芽块，20 d后统计丛生芽的诱导率。
1.3.4 丛生芽的继代培养：20 d后将形成的丛生芽块
分开成具2~3个小芽的约2~3 mm的小芽块，转移到继
代培养基上继续培养，每15 d继代1次。培养条件为
温度25± 2℃，光照12 h/d，光照强度800~1 000 Lx。
1.3.5 生根与移栽：丛生芽块在继代培养基上生长
15 d后，分开成单芽，转到生根培养基上，光照增加
到1 500~2 000 Lx。20 d后，打开瓶盖，加入少许自
来水，炼苗3 d。洗净根部的培养基，移栽到上层蛭
石、下层壤土的花盆中，30 d后移入大田。
2 结果与分析
2.1 种子苗的获得
用0.2% HgCl2 灭菌，处理15 min时，种子无污染
且萌发率较高，可达70%以上；处理5、10 min时，
种子均有污染现象出现；当处理20 min时，种子出芽
率很低。经消毒灭菌后暗培养的种子一般在4~5 d后
开始萌动，15 d后长成3~5 cm高的种子苗时，切取茎
尖部位（含生长点）作为诱导丛生芽的外植体（见图
1-A）。暗培养的黄化苗与光照下的正常苗相比，生长
点易于辨认，便于生长点部位的准确切取。
2.2 基部膨大的诱导培养
茎尖部位接种在适宜浓度的6⁃BA和2，4⁃D的基
部膨大诱导培养基上培养2~3 d后，茎尖开始伸长，
7~8 d后茎尖及其外叶鞘部位膨大，基部开始愈伤组
织化。10~15 d后从膨大的基部表面产生新叶，20 d
后发育成1~2 cm的小苗，小苗基部膨大至直径为2~
3 mm，淡黄色，且从膨大的基部表面上长出3片左右
的新叶，叶色嫩绿（见图1-B）。在实验中发现，不同
诱导培养基上，无论是基部膨大的诱导率（见表1）
还是小苗的生长形态都存在着明显的差异。当2，4-D
浓度较低（0.3~0.4 mg/L）时，诱导产生的膨大基部
较小，且多为褐色或暗黄色，诱导率较低，产生的小
苗叶片弯曲或扭曲，生长状态较差；在2，4-D浓度
高于0.5 mg/L的诱导培养基上，基部愈伤化膨大可达
4~5 mm，但多为白色，愈伤化组织较为疏松和粘稠，
诱导率也不是很高，不产生新叶或者长出的新叶较
小，且多有根发生；而在2，4-D浓度同为0.5 mg/L的
P5、P6培养基上基部膨大的现象基本一致，基部均可
膨大至2~3 mm，淡黄色，愈伤化组织较为致密，但
由于6-BA浓度的不同，由膨大的基部表面上长出的
叶片数目有所不同，在6⁃BA浓度较低（1.0 mg/L）的
P5培养基上一般只产生1~2片新叶，而在6⁃BA浓度为
2.0 mg/L的P6培养基上一般可以产生3片左右的新叶，
最多可达6片，且在P6培养基上基部膨大的诱导率也
稍高于P5培养基。纳苏和Mardona两种基因型基部膨
大诱导所需要的外源激素浓度组合基本相似，因此，
以P6培养基（MS培养基+0.5 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L
6-BA）为最适的基部膨大诱导培养基。
2.3 丛生芽的诱导培养
表1 不同基部膨大诱导培养基对基部膨大诱导的影响
培养基编号
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
2,4-D+6-BA （mg/L）
0.3+1.0
0.3+2.0
0.4+1.0
0.4+2.0
0.5+1.0
0.5+2.0
0.6+1.0
0.6+2.0
Mardona
平均诱导率（%）
60.67±1.20a
64.67±0.33ab
66.67±0.67bc
69.33±0.33bc
84.00±1.53e
90.67±3.18f
71.33±0.88c
78.33±2.19d
纳苏（Nassau）
平均诱导率（%）
59.67±1.20a
67.67±0.88b
72.33±0.88c
77.00±1.00d
79.67±0.88f
90.67±1.45e
86.67±0.33d
83.00±1.00g
注：表中数据是3次重复的平均值±标准差，每次重复为100个茎尖。方差分析用的是Duncan法，显著性水平P=0.05。
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20 d后将基部膨大的小苗切去叶片，留膨大的基
部接种到附加有不同浓度6-BA的丛生芽诱导培养基
上培养20 d。约9~10 d后，从膨大的基部长出部分小
芽，继续培养3~4 d后，这些小芽的叶腋处又长出很多
芽形成丛生芽，其余未分化成芽的膨大基部分化形成
根或者变黑死亡。实验发现，6-BA的浓度对草地早熟
禾丛生芽的产生情况及诱导率起着极为重要的作用
（见表2）。A1培养基6-BA浓度较低（1.0 mg/L），丛生
芽的诱导率较低，且每个芽丛的单芽数较少，一般只
有5~10个；在附加2.0 mg/L 6-BA的A2培养基上，丛
生芽的诱导率最高，每个芽丛的芽数也比较多，一般
在10~15个左右，丛生芽长势良好（见图1-C）；A3
培养基中的6⁃BA浓度最高为3.0 mg/L，但丛生芽的诱
导率与A2培养基相比，略有下降，且部分芽基部有
根毛产生。两种基因型丛生芽诱导需要的外源激素的
条件基本相似，因此最适宜的丛生芽诱导培养基是A2
培养基（MS培养基+2.0 mg/L 6⁃BA）。
2.4 丛生芽的继代培养
培养基编号
A1
A2
A3
6-BA（mg/L）
1.0
2.0
3.0
Mardona
平均诱导率（%）
71.67±1.67a
83.33±2.40b
78.67±0.33b
每丛芽数（个）
7~10
15~20
10~15
纳苏（Nassau）
平均诱导率（%）
76.67±0.88a
89.33±0.88c
84.33±0.88b
每丛芽数（个）
5~8
10~15
10~15
表2 不同丛生芽诱导培养基对丛生芽诱导的影响
注：表中数据是3次重复的平均值±标准差，每次重复为100个膨大基部。方差分析用的是Duncan法，显著性水平P=0.05。
将诱导产生的丛生芽分开成具2~3个小芽的约2~
3 mm的小芽块，接种到继代培养基上进行增殖继代培
养。4~5 d后小芽块开始膨大，从膨大的芽块基部表
面上产生2~3个小芽，15 d后形成由15~20个的单芽
所组成的旺盛芽丛（见图1-D）。适宜的继代培养基
为MS培养基+0.07 mg/L 2，4⁃D+3.0 mg/L 6-BA。当
2，4-D浓度较低时，丛生芽易老化，不容易产生新
芽；当2，4-D浓度较高时，芽基部愈伤化严重，丛
生芽形成能力降低。即使在最适浓度下继代5次以
后，丛生芽的增殖速率也会逐渐下降。为了保持草地
早熟禾丛生芽较高的再生能力状态，需要在继代4~5
次后将丛生芽分成单芽接种到P6培养基上，诱导产生
基部膨大，再转入到A2培养基上诱导形成丛生芽。
2.5 生根与移栽
将继代培养基上生长15 d的丛生芽块分开成单
芽，转到生根培养基上，一般8~10 d开始有白色的小
根产生（见图1-E） ，生根率达100 %。当根长至2~
3 cm左右，进行炼苗，3 d后可移栽入花盆，因为小
苗具有发达的根系，所以易于移栽，成活率达100％
（见图1-F）。
3 讨论与结论
以草地早熟禾茎尖为外植体诱导丛生芽的高频产
图1 草地早熟禾丛生芽离体培养
注：A：无菌种子苗上切取的茎尖生长点部位；B:诱导20d形成的基部膨大的小苗；C：诱导20d产生的丛生芽；
D：在继代培养基上生长15d的丛生芽；E：生根植株；F：移栽到花盆的植株。
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生依赖于适宜浓度的6-BA和2，4-D，尤以2，4-D
（0.5 mg/L）和6-BA（3.0 mg/L）作为基部膨大诱导培
养基， 6-BA（2.0 mg/L）作为丛生芽诱导培养基效果
最好。过低或过高的2，4-D、6-BA浓度会引起诱导
率的降低及生长状态欠佳。另外，过高浓度的6-BA
还会影响小苗的生根。此外，在继代培养过程中及时
剥去丛生芽基部包裹的叶鞘也是提高丛生芽高频发生
的重要因素之一。叶鞘的包裹会阻碍丛生芽对外源激
素及营养成分的吸收，从而抑制了芽尖分生组织的旺
盛增殖，影响新芽产生。
草地早熟禾遗传转化的受体通常为具有再生能力
的愈伤组织，由于受体系统难以建立和植株再生能力
差，至今只有几个实验室获得了转基因草地早熟禾植
株。本实验以草地早熟禾茎尖为外植体，经过基部膨
大和丛生芽发生的两步诱导方法，建立起了草地早熟
禾的高效丛生芽再生体系，该体系具有试验周期短、
植株再生频率高、基因型制约较小和取材不受季节限
制等优点，可用于早熟禾遗传转化和细胞工程研究以
及种质保存和快速繁殖。
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草坪园艺
High Efficiency Induction of Multiple Shoots from Poa pratensis L.
WANG Juan
（College of life science，Ningxia university，yinchuan 750021，China）
Abstract：In this research，an in vitro proliferation system of mutiple shoot clumps was established by using shoot
apices of seedlings as explants at a high efficiency. The results showed that swelled bases were induced from shoot apices
on MS medium supplemented with 0.5 mg/L 2，4-D and 3.0 mg/L 6-BA， then were transferred to shoot clumps
induction medium containing 2.0 mg/L 6-BA for the formation of mutiple shoot clumps，and multiple shoot clumps were
obtained on proliferation medium supplemented with 3.0 mg/L 6-BA and 0.07 mg/L 2，4-D. The rate of rooting of Poa
pratensis L. on 1/2 MS medium reached 100 %.
Key words：Poa pratensis L.; Multiple shoot clumps; In vitro culture
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