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响应面优化酶解法
制备蒲公英籽蛋白抗氧化肽工艺
张 杨，胡 磊，汪少芸，洪 晶*
(福州大学生物科学与工程学院，福建福州 350116)
收稿日期:2015－06－05
作者简介:张杨(1991－) ，女，硕士研究生，研究方向:食品生物技术，E－mail:xiah520@ 163.com。
* 通讯作者:洪晶(1981－) ，女，博士，副教授，研究方向:生物化学与分子生物学，E－mail:jhong@ fzu.edu.cn。
基金项目:福建省科技厅资助项目(2013J05050)。
摘 要:以蒲公英籽蛋白质抽提物为原料，采用响应面分析法(ＲSM)优化酶解蒲公英籽蛋白质制备抗氧化肽工艺。采
用碱性蛋白酶酶解制备蒲公英籽抗氧化肽，以酶解产物对 DPPH 自由基清除力为评价指标，考察酶解 pH、底物浓度、
酶底比及酶解温度对酶解产物抗氧化活性的影响。在单因素实验的基础上，采用三因素三水平的响应面分析法确定
酶解蒲公英籽蛋白质制备抗氧化肽工艺，同时建立酶解工艺的二次项数学模型并验证其可靠性。以酶解时间、酶底比
和酶解 pH为自变量，研究这 3 个因素的交互作用及最佳酶解工艺条件并进行验证。研究表明，对酶解蒲公英籽蛋白
质制备抗氧化肽工艺的影响因素主次顺序为:pH ＞酶底比 ＞酶解时间，最佳酶解工艺条件:酶解时间 4.90 h，pH8.5 和
酶底比 7.80%。在最佳工艺条件下，酶解产物的 DPPH自由基清除率为 79.13%。
关键词:响应面法，蒲公英籽，抗氧化肽，酶解工艺
Optimization of enzymolysis technology for preparation of
antioxidant peptides from dandelion seeds－derived proteins
by response surface methodology
ZHANG Yang，HU Lei，WANG Shao－yun，HONG Jing*
(College of Biological Science and Engineering，Fuzhou University，Fuzhou 350116，China)
Abstract:The aim of this study was to optimize the hydrolysis technology of preparation of antioxidant peptides
from dandelion seeds protein using response surface methodology(ＲSM).The protein extracted from dandelion
seeds was hydrolyzed by alcalase and antioxidant activity of the hydrolysates was evaluated by DPPH radical
scavenging activity. Effects of pH，substrate concentration，enzyme /substrate ratio and temperature on DPPH
scavenging activity of hydrolysates were evaluated. Based on the results of the single factor experiments，a
procedure optimized using the response surface analysis with three factors(pH，enzyme /substrate ratio and
hydrolysis time)was conducted in order to obtain the optimal enzymolysis condition.The quadratic term model of
the enzymatic preparation technology was established and the reliability was verified.The interaction effects of pH，
enzyme /substrate ratio and time were investigated，and the optimal hydrolysis condition was obtained and
checked out experimentally.The results indicated that the effect order of the three factors on antioxidant activity of
protein hydrolysates was pH ＞ enzyme /substrate ratio ＞ hydrolysis time，and the optimal enzymolysis conditions
were time of 4.90 h，pH8.5 and enzyme /substrate ratio of 7.80% .Under the optimal enzymolysis conditions，DPPH
radical scavenging rate of the hydrolysates was 79.13%，which indicated that the protein hydrolysates possessed
strong antioxidant activity.
Key words:response surface methodology;dandelion seed;enzymolysis technology;antioxidant peptides
中图分类号:TS201.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2016)05－0258－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2016． 05． 042
许多人工抗氧化剂如 BHT、BHA 等都无法避免
地带有潜在的毒副作用。通过食源性的蛋白质水解
得到的抗氧化肽抗氧化活性高，易吸收，而且无副作
用，因此成为研究新型抗氧化剂的热点。通过酶解
法利用植物蛋白制备高活性的抗氧化肽已有广泛研
究，如用螺旋藻蛋白［1］及玉米蛋白［2］等制备抗氧
化肽。
蒲公英为菊科多年草本生植物，是我国家喻户
259
晓的野生蔬菜和中草药。《千金方》、《本草纲目》等
中记载蒲公英具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋之
功效［3］。现代研究表明，蒲公英具有抑菌、抗肿瘤、保
肝利胆、促进肠胃动力、提高免疫力、清除自由基延
缓衰老的作用［4］。除了药用，蒲公英还可供食用，是
一种营养价值极高的野生蔬菜。蒲公英籽作为蒲公
英成熟干燥的种子，其营养、活性成分组成与蒲公英
全草相似。目前，国内外对蒲公英全草的研究较多，
而且主要研究蒲公英黄酮、多糖以及萜类化合物，而
对蒲公英籽的蛋白及多肽的研究很少。因此，本文
以蒲公英籽为原料，采用蛋白酶酶解法制备抗氧化
肽，以 DPPH自由基清除活力为考察指标，采用 Box－
Behnken设计实验，通过响应面法分析各因素对抗氧
化肽制备工艺的影响，以优化制备工艺获得最佳工
艺条件，为蒲公英籽蛋白的综合利用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
蒲公英籽 福州市种子市场，经中药粉碎机粉
碎成粉末后备用;中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白
酶、木瓜蛋白酶 诺特莱斯生物科技有限公司;
DPPH Sigma公司;其他试剂 国产分析纯。
XZ－21K型高速冷冻离心机 湘智离心机仪器
有限公司;EU2600 型紫外－可见分光光度计 昂拉
仪器有限公司;FE20 型 pH计 梅特勒－托利多仪器
上海有限公司;KDN－102C 定氮仪 纤检仪器有限
公司。
1.2 实验方法
1.2.1 蒲公英籽蛋白的酶解工艺 碱提酸沉法提取
蒲公英籽蛋白，将冷冻干燥后的蒲公英籽粗蛋白粉
作为酶解的原料，酶解采用下述工艺进行。
蛋白抽提物→酶解→灭酶→离心→上清液→酶解液
1.2.2 水解度的测定 甲醛滴定法［5－6］。取水解液
5.0 mL于小烧杯中，加入 60 mL蒸馏水，磁力搅拌下
用 0.01 mol /L标准 NaOH滴定至酸度计指示 pH8.2，
加入 pH已调至 8.2 的甲醛溶液 20 mL，记录将其 pH
滴至 9.2 时所消耗的 0.01 mol /L 标准 NaOH 溶液的
体积。计算公式:
n =(ΔV × C /W)×(V总 /V)
htot =(1 × Pro%)/110
DH(%)=(n－n0 /h tot)× 100 式(1)
式中，ΔV－滴定样品与滴定蛋白原液所消耗的
标准 NaOH 溶液体积之差;C－NaOH 标准溶液浓度
(mol /L) ;W－原料质量(g) ;V总 －酶解液的总体积
(mL) ;V－滴定取用的酶解液体积(mL) ;n0 －水解前
每克蛋白游离的氨基毫摩尔数(mmol /g) ;n－水解后
每克蛋白游离的氨基毫摩尔数(mmol /g) ;h tot －原料
蛋白质中所含肽键总数(mmol /g) ;Pro%－样品的蛋
白质含量;110－氨基酸平均分子量。
1.2.3 抗氧化活性测定 以 DPPH 自由基清除活力
作为指标，考察蒲公英籽酶解物抗氧化能力，参照
Chen等人的方法进行测定［7］。
取 0.5 mL样品溶液，加入 0.5 mL DPPH溶液(浓
度为 0.1 mmol /L，溶解于 95%的乙醇中进行配制) ，
迅速振荡、混匀后避光 30 min，在 517 nm处测定反应
液的吸光值，记作 Ai。DPPH自由基清除活性通过下
式计算:
DPPH自由基清除率(%)= 1－
Ai－Aj
A( )0 × 100
式(2)
式中，Ai－样品组(DPPH 溶液 +样品) ;Aj－对照
组(95%乙醇溶液 +样品) ;A0 －空白组(DPPH 溶液
+去离子水)。
1.2.4 单因素实验 酶解步骤如 1.2.1 节，分别对酶
的种类(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋
白酶)、底物浓度(0.5%、1%、2%、45、6%、8%)、酶
底比(4%、6%、8%、10%、12%、14%)、pH(7.5、8.0、
8.5、9.0、9.5、10.0)和酶解温度(40、45、50、55、60、
65 ℃)进行单因素实验，考察各因素对蛋白质酶解
工艺的影响。采用甲醛滴定法测定酶解物的水解
度，按公式(1)计算。采用 DPPH 自由基清除活力测
定酶解物的抗氧化活性，按公式(2)计算。
1.2.5 响应面法优化蒲公英籽抗氧化肽酶解工艺实
验 在单因素实验结果的基础上，根据 Box－Behnken
设计原理，采用软件 Design Expert V8.0.6 建立三因素
三水平实验，确定蒲公英籽蛋白酶解最佳工艺条件。
以酶解物的 DPPH 自由基清除率(Y，%)为考察指
标，酶解时间(A) ，酶底比(B)及 pH(C)为自变量，
因素水平编码见表 1。
表 1 因素水平编码表
Table 1 Code and level of factors chosen
因素
代码 水平
编码 非编码 + 1 0 － 1
时间(h) X1 A 8 5 2
酶底比(E /S) (%) X2 B 12 8 4
pH X3 C 9.5 8.5 7.5
2 结果与讨论
2.1 单因素实验
2.1.1 蛋白酶种类对酶解物抗氧化活性的影响 选
择木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶
对蒲公英籽蛋白进行酶解。4 种蛋白酶对蒲公英籽
蛋白的水解度与酶解物抗氧化活性随酶解时间的变
化分别如图 1、图 2 所示。由图 1、图 2 分析可知，碱
性蛋白酶的酶解效果最好，胰蛋白酶次之，中性蛋白
酶和木瓜蛋白酶酶解效果较差，因此选择碱性蛋白
酶为最适作用酶。由碱性蛋白酶的酶解进程曲线分
析可知，其水解度在酶解 4 h 时达到最大后趋于平
缓，而其 DPPH自由基清除率在酶解 4 h 以后开始下
降，故最适酶解时间选择 4 h。
2.1.2 底物浓度对酶解物抗氧化活性的影响 在
pH10.0，酶底比 8%和酶解温度为 45 ℃的条件下酶
解 4 h，考察不同底物浓度对蒲公英籽蛋白酶解物抗
氧化活性和水解度的影响。由图 3 可知，底物浓度
小于 2%时，酶解物的 DPPH自由基清除率和水解度
随底物浓度增加而增大;当底物浓度大于 2%时，其
清除率和水解度基本不变甚至呈下降趋势，这是因
260
图 1 不同蛋白酶水解蒲公英籽蛋白的进程曲线
Fig.1 Effect of different proteases
on dandelion seeds protein hydrolysis
图 2 不同蛋白酶对蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影响
Fig.2 Effect of different proteases on antioxidant activity of
dandelion seeds hydrolysates
为在底物浓度较低时，增加底物浓度能增大底物与
蛋白酶接触的机会，使反应向产物方向进行，但当底
物浓度到达饱和点时，体系流动性变差，反而不利于
底物与酶的接触［8］，因此酶解速率下降，故最适底物
浓度为 2%。
图 3 底物浓度对蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影响
Fig.3 Effect of substrate concentration
on antioxidant activity of dandelion seeds hydrolysates
2.1.3 酶底比对酶解物抗氧化活性的影响 在底物
浓度为 2%(w /v) ，酶解温度为 45 ℃和 pH10.0 条件
下酶解 4 h，考察不同酶底比对蒲公英籽蛋白酶解物
抗氧化活性和水解度的影响。如图 4 所示，酶解物
的 DPPH自由基清除率和水解度随酶量的增加而增
大，当酶底比为 8%时自由基清除率和水解度都达到
最大，随后增加酶底比自由基清除率和水解度降低。
这可能是因为底物浓度一定时，随着酶量的不断增
加，将已生成的具有抗氧化活性的多肽进一步酶解，
生成不具有抗氧化活性或者抗氧化活性更小的肽段
或氨基酸［9］，因此选择最适酶底比为 8%。
图 4 酶底比对蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影响
Fig.4 Effect of enzyme /substrate ratio
on antioxidant activity of dandelion seeds hydrolysates
2.1.4 pH对酶解物抗氧化活性的影响 在底物浓
度为 2%(w /v) ，酶解温度为 45 ℃，酶底比为 8%和
酶解时间 4 h的条件下，考察不同 pH 对蒲公英籽酶
解物抗氧化活性和水解度的影响。结果如图 5 所
示，在 pH为 8.5 时，酶解产物的抗氧化活性和水解度
都达到最大，当 pH高于或低于 8.5 时，其抗氧化活性
和水解度都呈下降趋势。这是因为酶分子及底物分
子的解离状态、酶蛋白构象等受 pH 的影响，进而影
响酶与底物的结合、酶稳定性及产物转化，最终影响
酶促催化效果［10－11］。因此选择最适酶解 pH为 8.5。
图 5 pH对蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影响
Fig.5 Effect of pH on antioxidant activity of
dandelionseeds hydrolysates
2.1.5 酶解温度对酶解物抗氧化活性的影响 在底
物浓度为 2%(w /v) ，酶底比为 8%和 pH8.5 的条件
下酶解 4 h，考察不同温度对酶解物抗氧化活性和水
解度的影响。由图 6 可知，在一定范围内，随着温度
的上升，酶解产物的抗氧化活性和水解度都在增加，
当温度高于 45 ℃时，其抗氧化活性和水解度都在显
著下降。这是因为在一定范围内，随温度升高，反应
速率增加、酶解物还原能力增强、水解度升高;但温
度过高会使酶失活、产物形成方向发生改变，导致水
解度的下降［12］。因此最适酶解温度选择 45 ℃。
2.2 响应面实验设计方案和结果分析
温度、pH和酶底比是影响酶解液活性的主要因
素［13］，综合单因素实验结果，选用碱性蛋白酶水解蒲
公英籽蛋白酶，固定底物浓度为 2%(w /v) ，温度为
45 ℃，选酶解时间、酶底比及 pH 为考察因素，根据
响应面分析法 Box－Behnken 设计原理进行响应面实
验。从单因素实验的结果来看，水解度的变化趋势
261
图 6 温度对蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影响
Fig.6 Effect of temperature on antioxidant activity of
dandelion seeds hydrolysates
与 DPPH自由基清除率的变化趋势基本一致，因此
选择 DPPH自由基清除率为主要指标。响应面的设
计及结果如表 2 所示。
表 3 模型回归方程方差分析
Table 3 ANOVA of regression equation
变异来源 平方和 自由度 均方和 F值 p值 显著性水平
模型 1693.76 9 188.2 399.72 ＜ 0.0001 ＊＊＊
A时间 5.22 1 5.22 11.09 0.0126 *
B酶底比 8.09 1 8.09 17.19 0.0043 ＊＊
C pH 18.75 1 18.75 39.82 0.0004 ＊＊＊
AB 4.51 1 4.51 9.57 0.0175 *
AC 5.06 1 5.06 10.75 0.0135 *
BC 3.42 1 3.42 7.26 0.0308 *
A2 534.77 1 534.77 1135.85 ＜ 0.0001 ＊＊＊
B2 403.34 1 403.34 856.68 ＜ 0.0001 ＊＊＊
C2 538 1 538 1142.69 ＜ 0.0001 ＊＊＊
残差 3.3 7 0.47
失拟 0.57 3 0.19 0.28 0.8398
净误差 2.73 4 0.68
总和 1697.06 16
注:p ＜ 0.001 代表极显著“＊＊＊”;p ＜ 0.01 代表较显著“＊＊”;p ＜ 0.05 代表显著“* ”;p ＞ 0.05 代表不显著。
利用 Design－Expert V8.0.6 软件进行多元回归拟
合，得到回归模型方程:
Y = 78.08－0.81X1 －1.01X2 －1.53X3 + 1.06X1X2 －
1.13X1X3－0.92X2X3－11.27X1
2－9.79X2
2－11.30X3
2
回归方程的方差分析结果见表 3，回归模型的
p值小于 0.0001，表明所得到的模型极显著;模型误
差失拟项中 p值为 0.8398，该模型失拟项不显著，即
说明该方程对实验拟合度好，可靠性较高。此外该
模型的决定系数(Ｒ2)为 0.9981 和调整决定系数
(Ｒ2Adj)为 0.9956，都接近 1.0，说明该回归方程能够对
蒲公英籽酶解工艺的结果进行很好的预测。
2.2.1 各因素对蒲公英籽酶解液抗氧化活性的影响
分析 用各因素的 F值可评价该因素对实验指标的
影响，F值越大，表明该因素的影响越显著。由表 3
可知，F(X1)= 11.09，F(X2)= 17.19，F(X3)= 39.82，
即各因素对蒲公英籽蛋白抗氧化活性的影响顺序为
pH ＞酶底比 ＞酶解时间。
等高线是响应面中水平方向的投影，等高线的
形状表明变量间的交互作用是否显著，椭圆等高线
表明变量间的交互作用显著，圆形等高线表明交互
作用不显著［14］。由图 7 至图 9 可知，酶解时间、pH
及酶添加量相互间的等高线都呈明显的椭圆状，表
明三因素间具有交互作用。
表 2 响应面法实验设计与实验结果
Table 2 Ｒespond surface experimental design and results
实验号
因素水平
X1 时间 X2 酶底比 X3 pH
Y DPPH自由基
清除率(%)
1 1 1 0 56.44
2 1 － 1 0 55.86
3 1 0 1 51.99
4 － 1 1 0 56.06
5 0 0 0 78.83
6 1 0 － 1 57.53
7 0 1 － 1 58.09
8 0 0 0 78.37
9 0 1 1 53.41
10 － 1 0 － 1 56.77
11 0 0 0 76.96
12 － 1 0 1 55.73
13 0 － 1 － 1 58.72
14 0 0 0 78.76
15 － 1 － 1 0 59.73
16 0 － 1 1 57.73
17 0 0 0 77.48
如果一个响应曲面坡度相对平缓，表明其可以
忍受处理条件的变异，而不影响到响应值大小，相
反，如果一个响应曲面坡度非常陡峭，表明响应值对
于处理条件的改变非常敏感［15］。由图 7 可知，在时
间 X1 与酶底比 X2 交互作用的响应面中，沿 X2 轴方
向的响应曲面的坡度明显高于 X1，说明酶底比的变
化对 DPPH自由基清除率的影响相比于时间对其的
262
影响大。从图 8 和图 9 中可以看出沿 X3 轴方向的响
应曲面比较陡峭，说明 pH的变化对 DPPH 自由基清
除率的影响比时间和酶底比的影响大。
图 7 酶底比和酶解时间
对抗氧化肽制备工艺影响的响应面图(pH = 8.5)
Fig.7 Ｒesponsive surfaces of effect of enzyme /substrate ratio
and time on preparation of antioxidant peptides(pH = 8.5)
图 8 酶解时间和 pH对抗氧化肽
制备工艺影响的响应面图(酶底比 = 8.0%)
Fig.8 Ｒesponsive surfaces of effect of
time and pH on preparation of
antioxidant peptides(amount of enzyme = 8.0%)
图 9 酶底比和 pH对抗氧化肽
制备工艺影响的响应面图(时间 = 5.0 h)
Fig.9 Ｒesponsive surfaces of effect of enzyme /substrate ratio
and pH on preparation of antioxidant peptides(time = 5.0 h)
综上分析，各变量对酶解蒲公英籽蛋白质制备
抗氧化肽工艺的影响主次顺序为:pH ＞酶底比 ＞酶
解时间。
2.2.2 最佳提取条件的确定及验证 由 Design －
Expert V8.0.6 软件分析得最佳实验条件为:酶解时间
4.86 h，pH8.45 和酶底比 7.76%。鉴于实验的可操作
性，将最佳酶解条件调整为:酶解时间 4.90 h，pH8.5
和酶底比 7.80%，其理论 DPPH 自由基清除率为
79.96%。通过多次(n ＞ 3)实验后测得最佳条件下
蒲公英籽酶解液的 DPPH 自由基清除率为 79.13%，
与理论自由基清除率无显著性差异，其相对误差为
0.59%，说明通过响应面法优化得到的模型回归方程
及最佳条件可靠。
3 结论
利用响应面法建立酶解蒲公英籽蛋白质制备抗
氧化肽工艺的二次项数学模型。通过方差分析，该
模型显著，所得回归方程拟合度好。影响酶解蒲公
英籽蛋白质制备抗氧化肽工艺的各因素主次顺序为
pH ＞ 酶底比 ＞ 酶解时间。最佳提取工艺条件是:
pH8.5，酶解时间 4.90 h 和酶底比 7.80%。在此条件
下，测得蒲公英籽蛋白质酶解物对 DPPH自由基的清
除率为 79.13%，与理论自由基清除率(79.96%)无显
著性差异，说明通过响应分析法得到的回归方程能
够较好预测实验结果。
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