全 文 ：＊通讯作者 , E-mai l:dongk uanhu@126.com
收稿日期:2010-08-17;修回日期:2010-10-01
基金项目:国家“十一五”科技支撑计划项目(2007BAD56B01)资助
作者简介:夏方山(1983-),男 ,山东潍坊人 , 在读硕士研究生 ,研
究方向为牧草抗逆性 , E-mail:xiafang shang1213@163.com.
文章编号:1673-5021(2011)01-0048-06
碱性盐胁迫对碱地风毛菊苗期脯氨酸代谢途径的影响
夏方山 ,董秋丽 ,董宽虎＊
(山西农业大学动物科技学院 ,山西　太谷　030801)
　　摘要:以 Na2CO3 和 NaH CO 3 对苗期碱地风毛菊(Saussurea runcinata)进行胁迫 , 探讨其苗期耐碱性及脯氨酸
代谢途径。结果表明:NaH CO 3 和 Na2CO 3 胁迫下 , 碱地风毛菊中脯氨酸含量增加 , 最大值为对照的 15.5 倍;吡咯
啉-5-羧酸合成酶(P5CS)活性受到抑制;鸟氨酸δ-氨基-转移酶(δ-OAT)活性升高 ,最大为 12.58 U/μg P ro tein;碱地
风毛菊中脯氨酸合成途径以鸟氨酸(Orn)途径为主;NaH CO3 胁迫下脯氨酸降解代谢旺盛 , Na2CO 3 胁迫下 , 碱地风
毛菊叶片中脯氨酸脱氢酶(P roDH)活性下降 ,根系中 ProDH 活性增大 , 脯氨酸降解代谢旺盛。
关键词:脯氨酸代谢;脯氨酸;δ-氨基转移酶;吡咯啉-5-羧酸合成酶;脯氨酸脱氢酶
中图分类号:Q945.78　　　文献标识码:A
1　引言
在盐渍条件下植物体内脯氨酸含量大量积累[ 1] ,
而且脯氨酸积累与植物对干旱和盐胁迫适应性之间
表现出正相关 ,其积累量与逆境水平及植物对这种逆
境的抗性有关[ 2] 。脯氨酸积累可能是植物受到胁迫
的一种信号[ 3] ,植物的脯氨酸合成 、累积及代谢是一
个受非生物胁迫和细胞内脯氨酸浓度调控的生理生
化过程。脯氨酸积累主要通过从头合成 ,已证明植物
体内存在两条脯氨酸合成途径 ,根据起始氨基酸分别
命名为谷氨酸途径和鸟氨酸途径[ 4] , 即以吡咯啉-5-
羧酸 合 成 酶(Pyrroline-5-carboxy late synthetase ,
P5CS)为关键酶的谷氨酸(Glu)途径和以鸟氨酸δ-氨
基转移酶(Ornithine-oxo-acid transaminase ,δ-OAT)为
关键酶的鸟氨酸(Orn)途径。脯氨酸合成过程中究竟
是哪一条途径居于主导地位 ,有待进一步研究[ 3] 。而
脯氨酸脱氢酶(ProDH)是催化盐胁迫下脯氨酸降解
反应中限速步骤的关键酶 ,对逆境条件下植物体内脯
氨酸的积累起重要作用。目前对碱地风毛菊(Saus-
surea runcinata)的耐盐性研究报道甚少 ,因此 ,本试
验以碱地风毛菊为材料 ,对其苗期盐胁迫下脯氨酸代
谢途径进行研究 ,以期明确在盐胁迫下碱地风毛菊的
脯氨酸代谢途径 ,为盐碱地植被恢复与改良提供依
据。
2　材料与方法
2.1　种子来源
试验用碱地风毛菊(Saussurea runcinata)种子于
2008年秋采自山西省右玉县威远镇后所堡村东的盐
碱化草地 ,海拔 1329m ,N39°59′26.2″、E112°19′19.8″。
2.2　试验方法
本试验在山西农业大学草业科学系日光能温室
进行 ,温度 14 ～ 30℃,湿度 65%～ 75%。采用直径
25cm 、高 20cm 的塑料盆 ,装入 1∶1的蛭石与珍珠
岩(v/v),插入 PVC 管以便浇水及营养液。采用完
全随机区组设计 ,播种量为 100 粒/盆 ,播种 75 盆 ,
每隔 3d 用 Hoag land 营养 液 浇 灌 一 次 , 于
17∶00 ～ 20∶00时进行 。其它时间每日用自来水补
充失水 ,以称重法确定失水量。出苗一个月后定苗 ,
定苗两周后进行盐分胁迫。试验分别以 N a2CO 3 和
NaHCO3 进行胁迫 , 浓度为 0(CK)、30mmol/L 、
60mmo l/L 、90mmol/ L 、120mmol/ L 、150mmol/L 、
180mmol/L7个梯度 , 3 次重复。以含有相应浓度
盐分的营养液为处理液 , 对照只浇灌 Hoag land 营
养液 。每天按 30mmol/L 的浓度梯度进行递增 ,直
至达到指定的浓度为止。盐胁迫两周后 ,分别采集
其叶片和根系 ,置于-80℃冰箱保存 ,进行相关指标
分析 。
2.3　测定指标及方法
2.3.1　脯氨酸含量的测定
采用紫外可见分光光度计法(磺基水杨酸-酸性茚
三酮),按照邹琦的方法进行[ 5] 。
—48—
第 33 卷　第 1 期　　　　　　　　　　中　国　草　地　学　报　　　　　　　　　　2011 年 1 月
　　Vol.33　No.1　　　　　　　　　　Chinese Journa l of G rassland 　　　　　　　　　 Jan.2011　　
2.3.2　P5CS活性测定方法
P5CS 的抽提方法按照 Kavi 等的方法进行[ 6] 。
蛋白含量以牛血清蛋白为标准蛋白质 ,按照 Brad-
fo rd的方法进行[ 7] 。P5CS 活性测定按照 Garcia-
Rios 等的方法进行[ 8] 。
2.3.3　δ-OA T 活性测定方法
δ-OAT 粗酶提取按照 Roosens 等的方法进
行[ 9] ,蛋白含量以牛血清蛋白为标准蛋白质 ,按照
Bradfo rd的方法进行[ 7] 。
δ-OAT 活性的测定参照 Kim 等的方法[ 10] 进
行 ,以每分钟生成 0.001mmol P5CS 的量为一个δ-
OA T 活性单位(U)。
2.3.4　ProDH 活性测定方法
参照 Lut ts等的方法提取[ 11] ,略做改动。样品
加 4倍体积提取缓冲液(w/v)于冰浴中研磨 ,提取
缓 冲 液 为 0.1mo l/L 的 Na2HPO 4-KH2 PO 4
(pH7.8),内含 1mmo l/L 的 EDTA , 10mmol/ L 的
巯基乙醇。匀浆液经三层纱布过滤后 4000g 离心
15min 。上清液加 TritonX-100 至终浓度 0.15%,
涡悬后于冰浴中放置 30min , 后于 20000g 离心
20min ,上清液测酶活性。
活性测定反应混合液体积为 2.5ml , 内含
0.15mol/L 的 Na2CO 3-NaHCO 3(pH10.3)缓冲液
1.6m l , 0.2m l 0.1mol/L 的 L-Pro , 0.2m l 0.9
mmo l/L的 2 , 6-二氯酚靛酚 。30℃水浴中保温
5min ,加入 0.5ml(0.8mg 蛋白/ml)酶提取液 ,混合
均匀后加入 0.2ml PM S试剂(9mg/ml ,现配),摇匀
后立即于 600nm 下检测光密度变化 。以每分钟
A600减少 0.001为一个 ProDH 酶活单位(U)。
2.4　数据处理方法
试验数据通过 Excel 2003和 SAS 8.0 统计分
析软件处理。
3　结果与分析
3.1　碱性盐胁迫对碱地风毛菊脯氨酸含量的影响
由表 1可以看出 ,N aHCO 3 和N a2CO 3 胁迫下 ,
碱地风毛菊中脯氨酸含量均显著高于对照(P <
0.05),且相同浓度胁迫下 ,根系中脯氨酸含量显著
高于叶片(P <0.05)。NaHCO 3 胁迫下 ,随其浓度
的增加 ,碱地风毛菊叶片中 Pro 含量呈先增加后下
降的趋势 , 在浓度为 150mmo l/L 时达到最大值
(114.67μg/g FW),为对照的 5倍;根系中脯氨酸含
量呈递增趋势 ,浓度为 180mmol/ L 时达到最大值
(892.38μg/g FW),为对照的 3.7倍;Na2CO 3 胁迫
下 ,随着其浓度的增加 ,碱地风毛菊叶片中脯氨酸含
量呈递增趋势 ,浓度为 180mmol/ L 时达到最大值
(354.36μg/g FW),是对照的 15.5 倍;根系中脯氨
酸含量呈先增加后下降的趋势 , 在浓度为 150
mmol/ L时达到最大值(651.36μg/g FW),为对照
的 2.7倍 。由表中脯氨酸的含量可以看出 , Na2 CO 3
胁迫对碱地风毛菊的伤害大于 NaHCO 3 。
表 1　碱性盐胁迫下碱地风毛菊的根系和叶片中脯氨酸含量变化(μg/g FW)
Table 1　Changes of proline content in the roots and leaves of Saussurea runcinata under alkaline salts stress(μg/ g FW)
浓度 Concent ration
(mmol/ L)
NaHCO 3 胁迫
NaHCO 3 s t ress
叶片 Leaves 根系 Roots
Na2CO 3 胁迫
Na2CO 3 st res s
叶片 Leaves 根系 Roots
0(CK) 22.93±1.61Fb 241.42±1.69Fa 22.93±1.61Gb 241.42±1.69Fa
30 50.71±1.62Ed 205.49±1.75Gb 95.91±0.24Fc 215.57±1.75Ga
60 54.40±1.06Dd 309.91±2.45Eb 106.84±1.66Ec 351.65±1.68Ea
90 56.62±0.70Dd 408.44±1.61Db 111.38±3.68Dc 469.47±1.57Da
120 63.07±1.03Cd 512.52±1.44Cb 129.7±1.22Cc 638.61±0.87Ba
150 114.67±4.34Ad 668.58±1.57Ba 267.41±1.80Bc 651.36±1.88Ab
180 73.72±0.79Bd 892.38±0.72Aa 354.36±0.61Ac 633.35±2.27C b
　　注:同列不同大写字母表示差异显著(P<0.05),同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同。
Note:Means in the s ame column w ith dif ferent capital let ters are signif icant ly di ff erent at 0.05 level , in the same row w i th dif feren t small
let ters are signi fican tly dif ferent at 0.05 level , the same as below.
—49—
夏方山　董秋丽　董宽虎　　　碱性盐胁迫对碱地风毛菊苗期脯氨酸代谢途径的影响
3.2　碱性盐胁迫对碱地风毛菊 P5CS活性的影响
由表 2 可以看出 , Na2CO 3 和 NaHCO3 胁迫下
碱地风毛菊中 P5CS 活性均显著低于对照(P <
0.05),NaHCO3 胁迫下碱地风毛菊叶片中 P5CS 活
性显著低于 Na2 CO 3 胁迫(P <0.05);在 N aHCO 3
胁迫下 ,随其浓度的增加碱地风毛菊叶片中 P5CS
活性呈先下降后升高的趋势 ,根系中 P5CS 活性呈
下降趋势 ,且根系中 P5CS活性显著(P<0.05)高于
叶片;在 Na2CO 3 胁迫下 ,随碱浓度的增加碱地风毛
菊叶片中 P5CS 活性呈先下降后升高的趋势 ,根系
中 P5CS 活性呈先升高后下降的趋势 。
表 2　碱性盐胁迫下碱地风毛菊的根系和叶片的 P5CS活性变化(U/μg Protein)
Table 2　Changes of P5CS in the roots and leaves of Saussurea runcinata under alkaline salts stress(U/μg Protein)
浓度 Concent ration
(mmol/ L)
NaHCO 3 胁迫
NaHCO 3 s t ress
叶片 Leaves 根系 Roots
Na2CO 3 胁迫
Na2CO 3 st res s
叶片 Leaves 根系 Roots
0(CK) 4.42±0.19Aa 2.83±0.17Ab 4.42±0.19Aa 2.83±0.17Eb
30 1.22±0.12Dd 2.80±0.05Aa 2.66±0.03Bb 2.57±0.01Fc
60 0.89±0.11Ed 2.48±0.02Bb 2.54±0.0BCa 2.24±0.02G c
90 0.70±0.04Fd 2.56±0.11Bb 2.42±0.04Cc 3.65±0.05Da
120 1.57±0.03Cd 2.25±0.02C b 2.16±0.05Dc 4.44±0.03Aa
150 1.56±0.03Cd 2.24±0.04Cc 2.47±0.02Cb 4.16±0.02Ba
180 2.63±0.02Bb 2.13±0.03C d 2.56±0.02BCc 4.02±0.05Ca
3.3　碱性盐胁迫对碱地风毛菊δ-OAT活性的影响
由表 3 可以看出 , Na2CO 3 和 N aHCO 3 胁迫
下 ,碱地风毛菊中 δ-OAT 活性均高于对照 , 且随
着盐浓度的增加碱地风毛菊叶片中δ-OA T 活性
呈先下降后增加的趋势 , 而根系中 δ-OA T 活性
呈先升高后下降趋势 。碱性盐胁迫下 ,碱地风毛
菊叶片和根系中 δ-OAT 活性均高于对照 , 说明
碱性盐胁迫下 , δ-OAT 在碱地风毛菊的 Pro 代谢
中起决定作用 。
表 3　碱性盐胁迫下碱地风毛菊的根系和叶片的δ-OAT活性变化(U/μg Protein)
Table 3　Changes ofδ-OAT in the roots and leaves of Saussurea runcinata under alkaline salts stress(U/μg Protein)
浓度 Concent ration
(mmol/ L)
NaHCO 3 胁迫
NaHCO 3 s t ress
叶片 Leaves 根系 Roots
Na2CO 3 胁迫
Na2CO 3 st res s
叶片 Leaves 根系 Roots
0(CK) 9.33±0.90Ca 9.92±0.85Da 9.33±0.90Da 9.92±0.85Da
30 11.10±0.35Bc 10.17±1.08CDc 15.43±0.43Aa 12.67±0.30Bb
60 10.18±0.25BCc 11.89±0.49Bb 14.66±0.17Ed 14.83±0.24Aa
90 9.88±0.78C c 14.26±0.37Aa 11.54±0.49Cb 12.05±0.30Bb
120 9.74±0.78Cd 12.15±0.15Bb 11.90±0.44Ba 10.87±0.51Cc
150 12.68±0.41Aa 11.14±0.08BCb 12.41±0.48Ca 12.19±0.33Ba
180 10.33±0.19BC b 10.18±0.46CDb 12.45±0.39Ca 12.58±0.23Ba
3.4　碱性盐胁迫对碱地风毛菊 ProDH 活性的影响
由表 4可以看出 , NaHCO 3 胁迫下碱地风毛菊
中 ProDH 活性均显著高于对照(P <0.05),且随其
浓度的增加 ,碱地风毛菊叶片中 ProDH 活性呈上
升趋势 ,而根系中 ProDH 活性呈先升高后下降趋
势;Na2 CO 3 胁迫下碱地风毛菊叶片中 ProDH 活性
均显著低于对照(P <0.05),且随碱浓度的增加呈
先下降后升高的趋势 ,而碱地风毛菊根系中 ProDH
—50—
中国草地学报　2011年　第 33 卷　第 1 期
活性均显著高于对照(P <0.05),且随碱浓度的增 加呈先升高后下降的趋势。
表 4　碱性盐胁迫下碱地风毛菊的根系和叶片的 ProDH活性变化(U/gFW)
Table 4　Changes of ProDH in the roots and leaves of Saussurea runcinata under alkaline salts stress(U/ gFW)
浓度 Concent ration
(mmol/ L)
NaHCO3 胁迫
NaHCO 3 s t ress
叶片 Leaves 根系 Roots
Na2CO 3 胁迫
Na2CO 3 st ress
叶片 Leaves 根系 Roots
CK 175.37±1.21Gb 193.74±3.10Ea 175.37±1.21Ab 193.74±3.10Ga
30 207.01±2.71Fc 221.42±1.90Db 149.37±1.13Bd 269.09±3.27Da
60 263.73±2.18Eb 222.37±1.91Dc 120.90±0.74Cd 310.74±2.46Ca
90 325.81±4.19Db 370.80±5.48Ba 98.34±0.72Dc 325.58±3.86Bb
120 358.43±0.45Cb 387.34±6.06Aa 54.47±0.27Fc 355.65±1.69Ab
150 367.35±1.04Ba 345.72±5.23C b 72.16±2.00Ed 239.47±1.75Ec
180 376.78±2.40Aa 139.40±0.89Fc 74.41±1.19Ed 229.76±1.83Fb
4　讨论
4.1　碱性盐胁迫对碱地风毛菊脯氨酸含量的影响
阮成江等[ 12] 的研究表明 ,盐胁迫下沙棘叶内脯
氨酸含量升高 ,渗透势降低 ,渗透调节能力增强。杨
帆等人的研究也表明 ,盐胁迫下构树幼苗叶片脯氨
酸含量显著高于对照[ 13] ,这与本实验结果相一致 ,
NaHCO 3 和 Na2CO3 胁迫下 ,碱地风毛菊中脯氨酸
含量均显著高于对照 ,说明脯氨酸在碱地风毛菊的
耐碱胁迫有重要作用 。NaHCO 3 胁迫下碱地风毛
菊中脯氨酸含量低于 N a2CO 3 胁迫下碱地风毛菊中
脯氨酸含量 ,这可能是 NaHCO 3 胁迫下碱地风毛菊
中 P5CS 活性和 δ-OA T 活性均低于 N a2CO 3 胁迫
下碱地风毛菊中 P5CS活性和δ-OAT 活性的原因。
4.2　碱性盐胁迫对碱地风毛菊 P5CS活性的影响
P5CS 是脯氨酸合成中 Glu 途径的限制酶 ,
P5CS的反馈调节在控制植物处于正常和胁迫条件
下脯氨酸的水平起着重要作用[ 14] 。植物的 P5CS
可以被脯氨酸反馈调节 ,且脯氨酸可在酶水平调节
自身的生物合成 , 但不能诱导 P5CS 基因的表
达[ 15] 。实验表明 ,NaHCO 3 胁迫下碱地风毛菊叶片
中 P5CS 活性显著低于 N a2CO 3 胁迫下碱地风毛菊
叶片中 P5CS 活性 NaHCO 3 胁迫下碱地风毛菊中
脯氨酸含量低于 N a2CO 3 胁迫下碱地风毛菊中脯氨
酸含量 ,说明在碱胁迫下 P5CS 对碱地风毛菊中脯
氨酸的积累有一定的作用;但 Na2CO3 和 N aHCO 3
胁迫下 ,碱地风毛菊根系和叶片中 P5CS 活性均显
著低于对照 ,而碱胁迫下碱地风毛菊叶片和根系中
脯氨酸含量均明显高于对照 ,说明 P5CS 活性在碱
胁迫下脯氨酸积累中期的作用不大。
4.3　碱性盐胁迫对碱地风毛菊δ-OAT活性的影响
植物中的脯氨酸可以由谷氨酸合成 ,也可以由
精氨酸/鸟氨酸合成 ,精氨酸通过精氨酸酶转变为鸟
氨酸 。δ-OAT 是脯氨酸合成途径中 Orn 途径中的
关键酶 ,它的活性不受脯氨酸的反馈抑制。在实验
中 , Na2 CO 3 和 NaHCO 3 胁迫下 ,碱地风毛菊根系和
叶片中δ-OA T 活性均高于对照 ,说明碱胁迫下 ,碱
地风毛菊的脯氨酸合成途径以 Orn 途径为主 ,余光
辉[ 16] 等对于假俭草的研究表明 ,在水分胁迫条件
下 ,脯氨酸累积的规律性与δ-OA T 的活性变化呈现
出很好的相关性 ,而与 P5CS 的活性呈负相关 ,这说
明假俭草植物脯氨酸的累积主要受到δ-OA T 的活
性调节 ,在长期自然干旱的条件下 , P5CS 酶的活性
也呈下降的趋势 ,而δ-OA T 的活性有不同程度的增
加[ 16] ,这与本实验结果相似。一般认为脯氨酸合成
的两条途径因植物和生长时期不同而各自起着重要
的作用[ 3] ,且有研究表明δ-OAT 在幼苗中的含量较
高[ 15] ,在渗透胁迫条件下 , PSCS mRNA 和δ-OAT
mRNA 表达与植物体内的氮素水平有关 ,在渗透胁
迫条件和低氮条件下谷氨酸途径占主导地位 ,而在
非胁迫条件及高氮条件下鸟氨酸途径又居于主导地
位 ,即在给植物提供高氮时则通过鸟氨酸途径合成
脯氨酸[ 4] , δ-OA T 活性升高。赵福庚等的研究结
果也表明:高胁迫强度时 P5CS 活性下降[ 17] ,故高
胁迫强度时 Orn途径对脯氨酸的积累起主导作用。
本试验结果可能是由于在碱地风毛菊苗期进行高氮
条件下的高碱胁迫造成的。脯氨酸累积依赖于很多
效应因子的相互作用 ,不同效应因子的水平在不同
—51—
夏方山　董秋丽　董宽虎　　　碱性盐胁迫对碱地风毛菊苗期脯氨酸代谢途径的影响
胁迫条件下可能不同 ,因而对脯氨酸合成以及降解
的影响也会不同 。
4.4　碱性盐胁迫对碱地风毛菊ProDH活性的影响
脯氨酸降解是控制脯氨酸累积的重要因素 ,其
降解过程基本是合成途径的逆转。ProDH 是脯氨
酸降解途径中的关键酶 , NaHCO 3 胁迫下碱地风毛
菊根系和叶片中 ProDH 活性均高于对照 , 说明
NaHCO 3 胁迫下 ,碱地风毛菊的降解反应旺盛 , 碱
地风毛菊在碱胁迫过程中产生大量的脯氨酸 ,脯氨
酸在植物体内过量积累会诱导其降解;N a2CO 3 胁
迫下碱地风毛菊根系中 ProDH 活性均高于对照 ,
但是碱地风毛菊叶片中 ProDH 活性对于对照 , 这
与黄诚梅等[ 18] 的研究一致 ,他们发现甘蔗在 PEG
胁迫 72h以前 ,ProDH 活性呈降低趋势。说明 Pro
的积累是合成增加和降解减少共同作用的结果。
5　结论
5.1　随着碱性盐浓度的增加 ,碱地风毛菊中脯氨酸
含量均显著高于对照 ,且相同浓度胁迫下 ,根系中脯
氨酸含量显著高于叶片 , Na2 CO 3 胁迫对碱地风毛
菊的伤害要大于 NaHCO 3 。
5.2　NaHCO 3 和 Na2CO 3 胁迫下 ,碱地风毛菊中
P5CS活性均低于对照 ,而碱地风毛菊中δ-OAT 的
活性均高于对照 , NaHCO3 胁迫下碱地风毛菊中
ProDH 活性均显著高于对照 , Na2CO 3 胁迫下碱地
风毛菊叶片中 ProDH 活性均低于对照 , 根系中
ProDH 活性均显著高于对照 。
5.3　NaHCO 3 和 Na2 CO 3 胁迫下 ,碱地风毛菊中脯
氨酸合成途径以 O rn途径为主 。
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Effect of Alkaline Salts on Proline Metabolism of Saussurea
runcinata at Seedling Stage
XIA Fang-shan , DONG Qiu-li , DONG Kuan-hu
(Collegeo f Animal Science , Shan xi Agricultural Universi ty , Taigu 030801 , China)
　　Abstract:The experiment w as carried out to asse ss the proline metabolism and salini ty tolerance of
Saussurea runcinata seedling under varying levels of Na2CO3 and NaHCO 3(0 , 30 , 60 , 90 , 120 , 150 and
180 mmo l/L).The results showed that the proline content in Saussurea runcinata seedling s increased sig-
nificant ly under Na2CO 3 and NaHCO 3 st ress , P5CS activity w as inhibited , but δ-OA T act ivity w as en-
hanced , the pro line metabo lism synthesis pathw ay in Saussurea runcinata seedling s w as mainly the path-
way of o rnithine;the proline deg radation o f w as act ive under NaHCO 3 st ress , ProDH activity in leaves of
Saussurea runcinata was declined under N a2CO 3 st re ss , ProDH activi ty in roo ts w as increased , and proline
deg radation w as act ive.
Key words:Proline metabolism ;Proline;δ-OA T ;P5CS;ProDH
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夏方山　董秋丽　董宽虎　　　碱性盐胁迫对碱地风毛菊苗期脯氨酸代谢途径的影响