全 文 ：麦类作物学报　２０１１，３１（２）：１９４－２０１
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ　Ｃｒｏｐｓ
偃麦草ＥｒＡＢＦ１基因克隆及功能分析
＊
高世庆，唐益苗，杨 颖，柳 珊，陈京瑞，
马锦绣，田立平，张风廷，赵昌平
（北京农林科学院杂交小麦工程技术研究中心，北京１０００９７）
摘　要：抗逆相关ｂＺＩＰ（Ｂａｓｉｃ　ｌｅｕｃｉｎｅ　ｚｉｐｐｅｒ）转录因子家族基因主要参与ＡＢＡ、干旱、高盐等胁迫应答
反应，其过表达能够显著增强植物的抗逆性。本研究从偃麦草（Ｅｌｙｔｒｉｇｒｉａ　ｒｅｐｅｎｓ　Ｌ．）中分离到一个抗逆相关
ＥｒＡＢＦ１（Ｅ．ｒｅｐｅｎｓ　ＡＢＡＢｉｎｄｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　１）基因，氨基酸序列比对分析发现，该基因与小麦、玉米、拟南芥等
ｂＺＩＰ转录因子基因同源性较高，亲缘关系较近；ＥｒＡＢＦ１基因的表达受到ＡＢＡ、干旱、高盐、低温的强烈诱导；
在２％ＰＥＧ、２００ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ胁迫培养基上初步功能分析表明，ＥｒＡＢＦ１过表达提高了转基因烟草对干
旱、高盐的胁迫耐性。
关键词：偃麦草；ＥｒＡＢＦ１ ；烟草；胁迫耐性
中图分类号：Ｓ５１２．９；Ｓ３３０　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１００９－１０４１（２０１１）０２－０１９４－０８
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＥｒＡＢＦ１　Ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍＥｌｙｔｒｉｇｒｉａ　ｒｅｐｅｎｓ
ＧＡＯ　Ｓｈｉ－ｑｉｎｇ，ＴＡＮＧ　Ｙｉ－ｍｉａｏ，Ｙａｎｇ　Ｙｉｎｇ，ＬＩＵ　Ｓｈａｎ，ＣＨＥＮ　Ｊｉｎｇ－ｒｕｉ，
ＭＡ　Ｊｉｎ－ｘｉｕ，ＴＩＡＮ　Ｌｉ－ｐｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｆｅｎｇ－ｔｉｎｇ，ＺＨＡＯ　Ｃｈａｎｇ－ｐｉｎｇ
（Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｗｈｅａｔ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００９７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ｄｒｏｕｇｈｔ，ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ　ａｎｄ　ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｓｅｖｅｒｅｌｙ　ａｆｆｅｃｔ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｒｅｐｏｒｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｐｌａｙｅｄ　ｖｉｔａｌ　ｒｏｌｅｓ　ｉｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ
ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　ｏｆ　ａｄｖｅｒｓｉｔｙ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ．Ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｂＺＩＰ　ｔｒａｎ－
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ（ｂａｓｉｃ　ｌｅｕｃｉｎｅ　ｚｉｐｐｅｒ）ｍａｉｎｌｙ　ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｄ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ＡＢＡ，ｄｒｏｕｇｈｔ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ
ｓｔｒｅｓｓｅｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｏｕｌｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　ａｄｖｅｒｓｉｔｙ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｐｌａｎｔｓ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ
ｓｔｕｄｙ，Ｅｌｙｔｒｉｇｒｉａ　ｒｅｐｅｎｓ　ｗｉｔｈ　ｓｔｒｏｎｇ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ａｎｄ　ｓａｌｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ　ａｎｄ　ｏｂｔａｉｎ　ａ　ｂＺＩＰ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｇｅｎｅ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｎｏｍｉｎａｔｅｄ　ａｓ　ＥｒＡＢＦ１（Ｅ．ｒｅｐｅｎｓ　ＡＢＡ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　１）．Ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＥｒＡＢＦ１ｈａｄ　ｈｉｇｈｅｒ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｒａｔｈｅｒ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎ－
ｓｈｉｐｓ　ｗｉｔｈ　ｂＺＩＰ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，ｗｈｅａｔ　ａｎｄ　ｍａｉｚｅ，ｅｔｃ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｒ－
ＡＢＦ１ｗａｓ　ｉｎｔｅｎｓｉｖｅｌｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＡＢＡ，ｄｒｏｕｇｈｔ，ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ　ａｎｄ　ｌｏｗ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ　ｆｕｎｃ－
ｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　２％ＰＥＧ　ａｎｄ　２００ｍＭ　ＮａＣｌ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＥｒＡＢＦ１－ｏｖｅｒ－
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｔｈｅ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｅｌｙｔｒｉｇｒｉａ　ｒｅｐｅｎｓ　Ｌ．；ＥｒＡＢＦ１ ；Ｔｏｂａｃｃｏ；Ｓｔｒｅｓｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ
＊收稿日期：２０１０－１１－０２　　　修回日期：２０１０－１２－２０
基金项目：国家抗逆转基因重大专项（２００８ＺＸ０８００２－００２、２００８ＺＸ０８００２－００３、２００８ＺＸ０８００２－００４）；北京市科技新星项目（２００７Ｂ０５６、
２００８Ｂ０３５）；北京农林科学院院青年基金项目；北京市自然基金项目（５１０２０１６）。
作者简介：高世庆（１９７７－），男，博士，助理研究员，主要从事小麦抗逆转基因育种研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｓｈｉｑ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者：赵昌平（１９６２－），男，博士，研究员，主要从事小麦遗传育种及杂种优势利用研究。Ｅ－ｍａｉｌ：Ｂｊｈｗｃ２００３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
　　干旱、盐碱等非生物逆境是影响农作物产量
和品质的主要限制因素。目前，利用生物技术手
段已将许多与抗旱、耐盐相关的基因转化到作物
中，转基因植株的抗逆性得到显著提高。如将胆
碱脱氢酶基因ＢｅｔＡ转化到烟草中，获得了耐盐、
耐低温的表型［１］。将大麦ＨＶＡ１ 基因导入水稻，
提高了转基因水稻的耐旱性［２］。将烟草Ｍｎ－ＳＯＤ
基因转入苜蓿中，增强了转基因苜蓿的耐旱性及
存活率［３］。然而，植物对干旱、高盐等非生物逆境
胁迫的耐性受多基因控制，导入单个功能基因不
能达到有效增强植物抗逆性的目的。从改良或增
强一个关键的转录因子基因着手是提高作物抗逆
性的更为有效的方法和途径［４］。
ｂＺＩＰ（Ｂａｓｉｃ　ｌｅｕｃｉｎｅ　ｚｉｐｐｅｒ）转录因子蛋白是
真核生物转录因子中分布最广泛、最保守的一类
蛋白，主要参与种子贮藏基因的表达、光形态的发
生以及器官建成的控制，还参与植物对脱落酸、光
周期和发育中各种信号的反应［５］。目前，根据拟
南芥ｂＺＩＰ转录因子的结构差异，可将其划分为
１０个亚族。其中，Ａ亚族成员包括ＡＢＦ１、ＡＢＦ２、
ＡＢＦ３、ＡＢＦ４等，主要参与调节ＡＢＡ、干旱、高盐、
低温、热、氧化胁迫逆境应答反应，在提高植物的
抗逆性中起着至关重要的作用［６－８］。研究表明，
ＡＢＦ２ 过表达的转基因拟南芥，比其野生型增强
了干旱及氧化胁迫耐性 ［９－１１］。转ＡＢＦ３、ＡＢＦ４ 基
因的拟南芥对低温、热、氧化胁迫的耐性比野生型
拟南芥明显增强［１１－１２］。在农作物中，抗逆相关的
ｂＺＩＰ转录因子基因已被分离，如玉米的ＡＢＰ９［１３］、
大麦的ＨｖＡＢＩ５［１４］、水稻的ＴＲＡＢ１［１５，１６］、ＯｓｂＺ－
ＩＰ２３、ＯｓｂＺＩＰ７２［１７－１８］和ＯｓＡＲＥＢ１［１９］、大豆的Ｇｍ－
ｂＺＩＰ４４、ＧｍｂＺＩＰ１３２ ［２０－２１］ 和 番 茄 的 ＳｌＡＲＥＢ
［２２］等，这些基因的过表达能够有效增强转基因植
株对干旱、盐碱等的非生物逆境胁迫耐性。
在小麦野生近缘属植物中对于抗逆相关ｂＺ－
ＩＰ转录因子基因功能的研究目前报道较少。本
研究以抗旱、耐盐性极强的小麦野生近缘属植物
新疆偃麦草为实验材料，分离、获得了抗逆相关
ｂＺＩＰ转录因子基因，并将其构建植物表达载体利
用农杆菌转化烟草，通过对转基因烟草植株进行
耐旱、耐盐性鉴定，以期初步明确该基因的功能，
为小麦抗旱、耐盐转基因新种质、新材料的创制提
供重要的候选基因资源，同时也为小麦抗逆基因
工程育种提供重要的理论依据。
１　材料与方法
１．１　材料处理
将室温２５℃条件下光照培养２～３周左右的
采自新疆的偃麦草（Ｅｌｙｔｒｉｇｒｉａ　ｒｅｐｅｎｓ　Ｌ．，由北
京农林科学院草业中心孟林研究员提供）植株进
行不同的胁迫处理。ＡＢＡ处理是给新疆偃麦草
幼苗叶片整株喷施２００μｍｏｌ·Ｌ
－１　ＡＢＡ溶液；高
盐处理将新疆偃麦草幼苗置于２００ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ＮａＣｌ溶液中浸泡；干旱处理是将新疆偃麦草幼苗
整个植株从花盆中移出，用蒸馏水将根部泥土冲
洗干净，然后置于滤纸上干旱胁迫；低温处理是将
新疆偃麦草幼苗置于４℃恒温冰箱低温胁迫。所
有胁迫处理均按０、１、２、５、１０和２４ｈ时间段取样
并迅速置于液氮中低温处理后－８０℃保存备用。
１．２　ＥｒＡＢＦ１基因的克隆及序列分析
将经干旱处理５ｈ的新疆偃麦草幼苗根据
ＴａＫａＲａ公司试剂盒进行总ＲＮＡ提取，以Ｏｌｉｇｏ
ｄＴ（１８）序列为引物，采用Ｒｅｖｅｒｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ
（Ｍ－ＭＬＶ）进行反转录。同时，以小麦、大麦、水
稻等ｂＺＩＰ家族基因序列为种子序列进行 ＮＣＢＩ
数据库Ｂｌａｓｔ搜索，获得大量的新疆偃麦草ＥＳＴ
序列并通过ＣＡＰ３网站（ｈｔｔｐ：／／ｐｂｉｌ．ｕｎｉｖ－ｌｙｏｎ１．
ｆｒ／ｃａｐ３．ｐｈｐ）进行电子拼接克隆。利用Ｐｒｉｍｅｒ
５．０软件设计引物ＥｒＡＢＦ１－Ｆ：５′－ＣＧＧＡＴＧＧＡ
ＣＴＴＣＣＧＧＧＡＧＧＡ－３′；ＥｒＡＢＦ１－Ｒ：５′－ＣＣＡＡＧＧ
ＧＣＣＣＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣ－３′，以干旱处理５ｈ的ｃＤ－
ＮＡ为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，扩增程序：９４℃
预变性５ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，６４℃退火５０ｓ，７２
℃延伸１ｍｉｎ，３０个循环，７２℃３０ｍｉｎ，４℃保
存。对 ＰＣＲ产物进一步进行回收、测序，采用
ＤＮＡＭＡＮ　６．０、ＭＥＧＡ　４．０生物学软件分别进
行多序列比对、进化树分析。
１．３　ＥｒＡＢＦ１基因表达特性检测
对生长３周左右的新疆偃麦草幼苗分别进行
ＡＢＡ、干旱、高盐、低温处理（处理时间为０、１、２、
５、１０和２４ｈ），并分别提取总ＲＮＡ。ＥｒＡＢＦ１基
因 荧 光 定 量 引 物 Ｑ－ＥｒＡＢＦ１　Ｆ：５′－ＧＡＴ－
ＣＡＡＧＡＡＣＣＧＧＧＡＧＴＣＴＧ－３′；Ｑ－ＥｒＡＢＦ１Ｒ：５′－
ＡＴＣＴＣＣＧＣＣＴＧＴＴＴＴＣＴＣＴＧ－３′。Ａｃｔｉｎ基因
荧 光 定 量 引 物 Ｑ－Ａｃｔｉｎ　Ｆ：５′－ＧＴＧＡＧＣＣＡ－
ＣＡＣＴＧＴＴＣＣＧＡＴ－３′；Ｑ－Ａｃｔｉｎ　Ｒ：５′－ＡＧＣＣＡＣ－
ＣＡＡＴＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧ－３′。采用 ＴａＫａＲａ公司
的荧光定量 ＲＴ－ＰＣＲ（Ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ）试剂盒（反应
·５９１·第２期　　　　　　　　　　　　　　　高世庆等：偃麦草ＥｒＡＢＦ１基因克隆及功能分析
体系参照说明书）在北京农林科学院蔬菜中心罗
氏荧光定量Ｌｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ　４８０ＰＣＲ仪上进行ＰＣＲ
反应（９５℃１ｍｉｎ；９５℃５ｓ，６０℃３０ｓ，７２℃４５ｓ，
３０Ｃｙｃｌｅｓ）。扩增产物定量分析采用罗氏荧光定
量分析软件２－△△ＣＴ法（版本号：ＬＣＳ　４８０　１．０．５．
３９）进行统计分析，实验设３次重复。
１．４　植物表达载体构建及烟草转化
将ｐＢＩ３５Ｓ、ｐＢＩ２９Ａ（质粒载体由中国农科院
作物所马有志研究员提供）（３５Ｓ为花椰菜花叶病
毒ＣａＭＶ３５Ｓ启动子；２９Ａ为拟南芥干旱胁迫响
应ＲＤ２９Ａ启动子）载体分别用ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ
进行双酶切，同时通过ＰＣＲ将５′端带有ＳｍａＩ，３′
端带有ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ酶切位点的引物（Ｆ［ＳｍａＩ］：
５′－ＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＡＴＧＧＡＣＴＴＣＣＧＧＧＡＧ－
ＧＡ－３′；Ｒ１ ［ＳｐｅＩ］：５′－ＧＡＴＡＣＴＡＧＴＣＣＡ
ＡＧＧＧＣＣＣＧＴＣＡＧＣＧＴＣ－３′；Ｒ２ ［ＸｂａＩ］：５′－
ＧＡＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＧＴＣＡＧＣＧＴＣ－
３′）引 入ＥｒＡＢＦ１ 基 因 两 端，连 接 转 化 获 得
ｐＢＩ２９Ａ－ＥｒＡＢＦ１、ｐＢＩ３５Ｓ－ＥｒＡＢＦ１植物表达载体，
转化农杆菌ＥＨ１０５菌株通过叶盘法浸染烟草叶
片，对获得的转基因阳性植株进行叶扩繁形成不
同转基因株系群体（每个株系３０～４０株）。
１．５　转基因烟草胁迫处理及表型分析
将叶扩繁３周左右、生长状态一致的转基因
烟草株系和野生型 Ｗ３８植株转移到含有２％
ＰＥＧ、２００ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ的１／２ＭＳ培养基上，
２５℃光照培养４～５周进行干旱、高盐胁迫处理。
观察不同胁迫培养基上转基因植株与野生型的表
型变化及生根情况，对不同胁迫的转基因植株与
野生型的基因表达及根长进行统计分析。
２　结果与分析
２．１　ＥｒＡＢＦ１基因分离、克隆结果
利用小麦、大麦和水稻抗逆相关的ｂＺＩＰ转
录因子基因核酸序列在 ＮＣＢＩ网站 （ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）ＥＳＴ数据库
中搜索与ｂＺＩＰ转录因子相关的ＥＳＴ序列，通过
ＣＡＰ３网站进行序列电子拼接、ＮＣＢＩ网站Ｂｌａｓｔ
比对分析获得含有ｂＺＩＰ保守域基因全长。利用
Ｐｒｉｍｅｒ　５．０软件设计引物从新疆偃麦草（Ｅｌｙｔｒｉ－
ｇｒｉａ　ｒｅｐｅｎｓ）进行ＰＣＲ扩增。如图１所示，扩增
获得了１ｋｂ大小的ｃＤＮＡ片段。然后，将其克
隆、测序和序列比对分析显示，该ｃＤＮＡ片段是
由１　０６５个核苷酸组成、编码３５４个氨基酸、含有
ｂＺＩＰ保守域的全长基因。因此，我们将其命名为
ＥｒＡＢＦ１（Ｅ．ｒｅｐｅｎｓ　ＡＢＡ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　１）。
　　１．新疆偃麦草ｃＤＮＡ片段；Ｍ．ＤＬ２　０００ｍａｒｋｅｒ（１００、２５０、
５００、７５０、１　０００、２　０００ｂｐ）。
１．ｃＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ；Ｍ．ＤＬ２　０００ｍａｒｋ－
ｅｒ（１００、２５０、５００、７５０、１　０００、２　０００ｂｐ）．
图１　以新疆偃麦草ｃＤＮＡ为模板ＰＣＲ
扩增含有ｂＺＩＰ保守域的ｃＤＮＡ片段
Ｆｉｇ．１　ｃＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｂｙ　ＰＣＲ　ｆｒｏｍ　Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ
２．２　ＥｒＡＢＦ１基因序列分析
将ＥｒＡＢＦ１基因编码的氨基酸序列进行
ＢＬＡＳＴｐ比对发现，该基因含有Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３和Ｃ４
四个保守的磷酸化位点区域和一个ｂＺＩＰ保守区
（图２Ａ）。将ＥｒＡＢＦ１基因的氨基酸序列与Ｅｅ－
ＡＢＦ６、ＡｔＡＢＦ１、ＡｔＡＢＦ２、ＡｔＡＢＦ３、ＡｔＡＢＦ４进
行多序列比对分析显示，ＥｒＡＢＦ１与ＥｅＡＢＦ６的
同源性较高，达到８４％；与拟南芥 Ａ 亚族成员
ＡＢＦ２同源性达到４１．９％，与ＡｔＡＢＦ１、ＡｔＡＢＦ３、
ＡｔＡＢＦ４同源性较低（图２Ｂ）。进化树分析显示，
ＥｒＡＢＦ１ 与 拟 南 芥 ＡｔＨＹＨ、ＡｔＨＹ５、Ａｔ－
ＢＺＯ２Ｈ１、小麦（Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ）ＴａＡＢＩ５、玉米（Ｚ．
ｍａｙｓ）ＺｍＡＢＩ５亲缘关系较近，而与大麦（Ｈ．
ｖｕｌｇａｒｅ）ＡＢＩ５、水稻（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）ＯｓＡＢＩ５、ＯＳＢＺ８
和 ＯｓＴＲＡＢ１、拟南芥 （Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＡｔＡＢＩ５、
ＡｔＡＢＦ１－ＡｔＡＢＦ４、ＡｔＤＰＢＦ２、ＡｔＤＰＢＦ３、ＡｔＧ－
ＢＦ１和ＡｔＴＧＡ１和高粱（Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒ）ＳｂＡＲＥＢ等
之间的亲缘关系较远（图２Ｃ）。
２．３　ＥｒＡＢＦ１基因逆境胁迫条件下的表达特性
为了明确ＥｒＡＢＦ１基因在各种非生物逆境胁
迫下表达特性，对ＡＢＡ、干旱、高盐和低温胁迫后
的新疆偃麦草材料进行ＥｒＡＢＦ１基因 Ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ
表达谱分析。在ＡＢＡ处理下，１ｈ后转录量开始
升高，随时间的延长表达量逐渐增加，在２４ｈＥｒ－
ＡＢＦ１基因ｍＲＮＡ的积累量达到最大，为０ｈ表
达量的１０倍。说明ＥｒＡＢＦ１基因的表达受到了
ＡＢＡ的强烈诱导（图３Ａ）。在高盐胁迫条件下，
ＥｒＡＢＦ１基因的转录也受到明显诱导，ｍＲＮＡ在
１ｈ开始积累，在２ｈ时的转录积累量达到最高点，
·６９１· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３１卷
　　Ａ．ＥｒＡＢＦ１基因推测的磷酸化位点及保守域结构分析。Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３和Ｃ４表示磷酸化位点区域；ＮＬＳ表示核定位信号区；ＢＲＬＺ表
示ＥｒＡＢＦ１基因的ｂＺＩＰ保守域。Ｂ．多序列比对分析（数据分析由ＤＮＡＭＡＮ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　６．０软件完成）。其中，黑色区域代表１００％同源；
粉色区域代表７５％的同源性；蓝色区域代表５０％的同源性；４个磷酸化位点区域及ｂＺＩＰ保守域的氨基酸已标识。Ｃ．ＥｒＡＢＦ１与其它
ｂＺＩＰ转录因子氨基酸序列进化树分析（数据分析由 ＭＥＧＡ　４．０软件完成）。
Ａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ＥｒＡＢＦ１ｇｅｎｅ．Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，Ｃ４ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｆｏｕｒ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　ａｒｅａｓ；ＮＬＳ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ；ＢＲＬＺ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｂＺＩＰ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｄｏｍａｉｎ．Ｂ．Ａｌｉｇｎ－
ｍｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍａｎｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｄａｔａ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　ＤＮＡＭＡＮ　６．０ｓｏｆｔｗａｒｅ）．Ａｍｏｎｇ　ｔｈｅｍ，ｔｈｅ　ｂｌａｃｋ　ａｒｅａｓ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　１００％ｈｏｍｏｌｏ－
ｇｏｕｓ；Ｐｉｎｋ　ａｒｅａ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　７５％ｏｆ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ；Ｂｌｕｅ　ａｒｅａ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　５０％ｏｆ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ；ｆｏｕｒ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　ａｒｅａｓ　ａｎｄ　ｂＺＩＰ
ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ａｎｎｏｔａｔｅｄ．Ｃ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＥｒＡＢＦ１ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｂＺＩＰ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ
（Ｄａｔａ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　ＭＥＧＡ　４．０ｓｏｆｔｗａｒｅ）．
图２　ＥｒＡＢＦ１基因序列分析
Ｆｉｇ．２　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＥｒＡＢＦ１　ｇｅｎｅ
·７９１·第２期　　　　　　　　　　　　　　　高世庆等：偃麦草ＥｒＡＢＦ１基因克隆及功能分析
之后 ｍＲＮＡ 的转录水平逐渐降低，在２４ｈ时
ｍＲＮＡ转录量降到最低，为０ｈ表达量的２倍（图
３Ｂ）。在低温胁迫条件下，ＥｒＡＢＦ１基因对低温做
出快速响应，在１ｈ表达量迅速达到最高值，为０
ｈ表达量的９．５倍。在低温胁迫２ｈ、５ｈ时，Ｅｒ－
ＡＢＦ１基因转录呈下降趋势；在胁迫１０ｈ时，表达
量又迅速增加但增加的幅度较小，为０ｈ表达量
的７．５倍；在２４ｈ时，ＥｒＡＢＦ１基因表达量降低，
为０ｈ表达量的４倍（图３Ｃ）。在干旱胁迫１ｈ后
ｍＲＮＡ的积累迅速增加，胁迫处理５ｈＥｒＡＢＦ１
的转录水平达到最高点，为０ｈ表达量的１０．５倍；
在干旱胁迫到２４ｈ时，转录水平快速降低，为０ｈ
表达量的３倍左右（图３Ｄ）。上述结果表明，Ｅｒ－
ＡＢＦ１基因均受到ＡＢＡ、高盐、低温和干旱胁迫的
不同程度的诱导表达。
　　Ａ．ＥｒＡＢＦ１基因在２００μｍｏｌ·Ｌ－１　ＡＢＡ胁迫下的表达模式分析；Ｂ．ＥｒＡＢＦ１基因在高盐（２００ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ）胁迫下的表达模式
分析；Ｃ．ＥｒＡＢＦ１基因在低温（４℃）胁迫下的表达模式分析；Ｄ．ＥｒＡＢＦ１基因在干旱胁迫下的表达模式分析。以ａｃｔｉｎ基因作为内标，实
验重复三次。
Ａ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ＥｒＡＢＦ１ｇｅｎｅ　ｕｎｄｅｒ　２００μｍｏｌ·Ｌ－１　ＡＢＡ．Ｂ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ＥｒＡＢＦ１ｇｅｎｅ　ｕｎｄｅｒ　ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ
（２００ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ）．Ｃ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ＥｒＡＢＦ１ｇｅｎｅ　ｕｎｄｅｒ　ｌｏｗ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（４℃）．Ｄ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　Ｅｒ－
ＡＢＦ１ｇｅｎｅ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｄｒｏｕｇｈｔ．Ａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｆｏｒ　ｔｈｒｅｅ　ｔｉｍｅｓ　ａｎｄ　ａｃｔｉｎｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａｎ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｓｔａｎｄａｒｄ．
图３　ＥｒＡＢＦ１基因的表达特性分析
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ＥｒＡＢＦ１ｇｅｎｅ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ
２．４　ＥｒＡＢＦ１转基因烟草阳性植株的获得
将含有ｐＢＩ３５Ｓ－ＥｒＡＢＦ１和ｐＢＩ２９Ａ－ＥｒＡＢＦ１
（图４Ａ）农杆菌植物表达载体的ＥＨ１０５农杆菌转
化烟草叶片。经分化、筛选获得具有植物抗性
（Ｋａｎａ）抗性的转基因 Ｔ０ 代再生植株８９株 （图
４Ｂ）。为了检测ＥｒＡＢＦ１基因是否转到烟草中，根
据ＥｒＡＢＦ１基因的序列设计引物，以烟草再生植株
的ＤＮＡ为模板，以 Ｗ３８为阴性对照进行ＰＣＲ检
测。检测结果显示，在大部分转基因烟草植株中
能够检测到１ｋｂ大小的目的基因片段，而阴性对
照 Ｗ３８及水对照中均无扩增带，证明ＥｒＡＢＦ１基
因已转化到烟草中（图４Ｃ）。对不同启动子驱动
的ＥｒＡＢＦ１基因阳性植株进行统计，获得了２８株
３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１转基因烟草阳性植株，３２株２９Ａ：：
ＥｒＡＢＦ１转基因烟草阳性植株。
２．５　转ＥｒＡＢＦ１基因烟草的耐盐性
为了鉴定转基因烟草的耐盐性，将３周左右
生长状态一致的对照 Ｗ３８、２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１及
３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１转基因阳性株系各３０株转入含有
２００ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ的培养基中进行盐胁迫处
理３５ｄ，２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１和３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１转基因株
系在盐胁迫条件下茎叶生长较快，根系发达，叶片
颜色深绿。然而，对照 Ｗ３８叶片失绿、发白，在盐
胁迫下不能生根导致植株死亡（图５Ａ）。半定量
ＲＴ－ＰＣＲ分析显示，ＥｒＡＢＦ１基因在２９Ａ：：Ｅｒ－
ＡＢＦ１和３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１转基因烟草株系中表达量
较高，而在对照植株中未检测到ＥｒＡＢＦ１基因的表
达，说明ＥｒＡＢＦ１基因的表达在转基因烟草抵抗盐
胁迫过程中发挥着重要作用（图５Ｂ）。根长统计
分析显示，２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１和３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１转基因
·８９１· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３１卷
　　Ａ．３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１和２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１植物表达载体构建过程；Ｂ．转基因烟草愈伤分化筛选、植株再生；Ｃ．转基因烟草ＰＣＲ检测。１
～９：３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１转基因烟草；１０～１３：２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１转基因烟草；１４：Ｗ３８对照；１５：阳性对照；１６：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ。
Ａ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１ａｎｄ　２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１；Ｂ．Ｃａｌｕｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓ；Ｃ．ＰＣＲ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓ．１～９：３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓ；１０～１３：２９Ａ：：Ｅｒ－
ＡＢＦ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓ．１４：Ｗ３８ｃｏｎｔｒｏｌ；１５：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ；１６：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ．
图４　植物表达载体构建及转基因烟草的获得
Ｆｉｇ．４　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓ
　　Ａ．２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１、３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１转基因烟草株系在含有２００ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ培养基上的生长情况；Ｂ．经２００ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ
盐胁迫培养基上处理的ＥｒＡＢＦ１转基因烟草表达分析；Ｃ．２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１和３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１转基因烟草株系盐胁迫下根长统计分析。
Ａ．２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１ａｎｄ　３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｌｉｎｅｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｏｎ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　２００ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ．Ｂ．Ｅｘｐｒｅｓ－
ｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＥｒＡＢＦ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｇｒｏｗｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　２００ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ．Ｃ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒｏｏｔ　ｌｅｎｇｔｈ
ｏｆ　２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１ａｎｄ　３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｌｉｎｅｓ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．
图５　 转基因烟草耐盐性鉴定
Ｆｉｇ．５　Ｓａｌｔ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓ
　　Ａ．２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１及３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１转基因烟草在含有２％ＰＥＧ培养基上的生长情况；Ｂ．转基因烟草在含有２％ ＰＥＧ培养基上表
达分析；Ｃ．２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１和３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１转基因烟草株系干旱胁迫下根长统计分析。
Ａ．２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１ａｎｄ　３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｏｎ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　２％ＰＥＧ．Ｂ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓ　ｇｒｏｗｎ　ｏｎ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　２％ＰＥＧ．Ｃ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒｏｏｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１ａｎｄ　３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｌｉｎｅｓ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．
图６　转基因烟草耐旱性鉴定
Ｆｉｇ．６　Ｄｒｏｕｇｈｔ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓ
·９９１·第２期　　　　　　　　　　　　　　　高世庆等：偃麦草ＥｒＡＢＦ１基因克隆及功能分析
株系的根长分别达到了７．３ｃｍ及８．２ｃｍ；而野
生型 Ｗ３８几乎不生根（图５Ｃ）。上述结果表明，
ＥｒＡＢＦ１基因的过表达导致 ２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１和
３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１转基因烟草比野生型烟草表现出
较强的耐盐性。
２．６　ＥｒＡＢＦ１转基因烟草的耐旱性
将生长３周左右的对照 Ｗ３８、２９Ａ：ＥｒＡＢＦ１
和３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１转基因烟草株系各３０株转入含
有２％ＰＥＧ的培养基中进行胁迫处理３５ｄ。结
果显示，２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１和３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１转基因植
株在２％ＰＥＧ培养基上生长不同程度受到抑制，
叶片变小、轻度卷曲、叶色基本正常；而对照 Ｗ３８
叶尖发黄萎蔫、叶片卷曲，根基部叶片老化严重，
植株几乎不能生根，最终导致死亡（图６Ａ）。半定
量表达分析显示，ＥｒＡＢＦ１基因在转基因烟草中表
达量较高，而在野生型烟草中未检测到表达（图
６Ｂ）。根 长 统 计 分 析 显 示，２９Ａ：：ＥｒＡＢＦ１和
３５Ｓ：：ＥｒＡＢＦ１转基因株系的根长分别达到了８．１
ｃｍ及７．０ｃｍ；而野生型不生根（图６Ｃ）。上述结
果说明，ＥｒＡＢＦ１基因的表达使转基因烟草比对照
（Ｗ３８）表现出较强的耐旱性。
３　讨 论
３．１　不同ｂＺＩＰ转录因子家族基因结构特点与
表达特征、功能的关系
对拟南芥ｂＺＩＰ转录因子的结构差异进行分
类，可将其划分为１０个亚族。其中，Ａ亚族（如
ＡＢＦ１、ＡＢＦ２、ＡＢＦ３和ＡＢＦ４等）由四个保守的磷
酸化位点及一个ｂＺＩＰ保守域组成，主要参与调
节ＡＢＡ、干旱、高盐、低温、热、氧化胁迫逆境应答
反应，在提高植物的抗逆性中起着至关重要的作
用［６，８，９］。其他几个功能较明确的亚家族，如Ｃ亚
家族由两个保守的磷酸化位点及一个ｂＺＩＰ保守
域组成，主要参与种子萌发、种子贮藏基因的表
达；Ｈ亚家族由一个保守的磷酸化位点及一个
ｂＺＩＰ保守域组成，主要参与光形态的发生及光调
控信号转导；Ｓ亚家族仅含有一个ｂＺＩＰ保守域，
主要参与蔗糖信号转导，在逆境条件下该家族基
因下调表达。Ｌｉａｏ等从大豆中分离、克隆了Ｇｍ－
ｂＺＩＰ４４、ＧｍｂＺＩＰ６２、ＧｍｂＺＩＰ７８ｂＺＩＰ类转录因子
基因，它们分别属于Ｓ、Ｃ、Ｇ亚家族成员，均受到
ＡＢＡ、高盐、低温等的诱导表达，这三个基因分别
过表达转基因拟南芥增强了对高盐和低温胁迫耐
性［１９］。在本研究中，我们所克隆、获得的ＥｒＡＢＦ１
基因进化树分析显示，它与小麦的ＴａＡＢＩ５、玉米的
ＺｍＡＢＩ５ 及拟南芥 Ｈ 亚家族ＨＹＨ、ＨＹ５基因亲
缘关系也较近，与拟南芥Ａ亚家族抗逆相关基因
的亲缘关系较远。然而，该基因的表达受干旱、高
盐、低温和ＡＢＡ的强烈诱导，其过表达提高了转
基因烟草对干旱及高盐的胁迫耐性。因此，从上
述研究结果可以推测，在不同物种中，不同亚家族
ｂＺＩＰ转录因子成员在结构、表达特征及其功能等
方面存在明显差异；同时，不同ｂＺＩＰ转录因子亚
家族成员虽然其基因的结构不同，但也可能交叉
参与同一个信号调控途径。对不同物种及同一物
种不同ｂＺＩＰ转录因子亚家族之间的基因结构、
表达特征及其信号途径交叉等方面内容今后还有
待于进一步深入分析研究。
３．２　ｂＺＩＰ基因过表达对转基因植株生长发育的
影响
ｂＺＩＰ基因过表达提高了转基因植物抗逆性，
同时也对转基因植物的生长发育产生抑制作
用［９，２３］。对ＡＢＦ２、ＡＢＦ３和ＡＢＦ４ 过表达转基因拟
南芥的功能研究发现，ＡＢＦ２ 基因过表达转基因
植株增强了对干旱、盐、冻、热和氧化胁迫耐性，转
基因种子萌发及苗期生长较慢；将ＡＢＦ２ 基因敲
除后，转基因苗期生长较快［１０，２４］。ＡＢＦ３、ＡＢＦ４
基因过表达的转基因拟南芥也有类 似 的 表
现［１０，１２，２５－２６］。然而，在本研究中利用拟南芥逆境
诱导型启动子ｒｄ２９Ａ 和组成型启动子３５Ｓ分别
构建了植物表达载体并转化烟草，发现这两种类
型的启动子驱动下的转基因烟草的生长发育基本
正常，该基因的过表达提高了转基因烟草对干旱、
高盐的胁迫耐性，但没有发现植株异常矮化现象，
说明不同物种的ｂＺＩＰ转录因子基因过表达对转
基因植株的生长发育造成的表型异常的原因很复
杂，推测可能与不同物种ｂＺＩＰ基因的类型、基因
结构、启动子类型、转基因植株的不同生长时期以
及调控下游的靶基因种类等多种因素有关。但本
研究为Ｔ０ 代转基因组培材料株系的基因功能分
析初步结果，对新疆偃麦草的ＥｒＡＢＦ１基因功能的
深入研究还需对Ｔ２代转基因烟草纯系在胁迫条
件下的种子萌发到苗期表型观察等方面进行系统
的抗逆性功能验证，来分析验证该基因的过表达
对转基因植株的表型产生影响。
·００２· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３１卷
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［１９］Ｊｉｎ　Ｘ　Ｆ，Ｘｉｏｎｇ　Ａ　Ｓ，Ｐｅｎｇ　Ｒ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．ＯｓＡＲＥＢ１ ，ａｎ　ＡＢＲＥ－
ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ＡＢＡ　ａｎｄ　ｇｌｕｃｏｓｅ，ｈａｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ－
ｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１０，４３（１）：３４－３９．
［２０］Ｌｉａｏ　Ｙ，Ｚｏｕ　Ｈ　Ｆ，Ｗｅｉ　Ｗ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｏｙｂｅａｎ　ＧｍｂＺＩＰ４４，ＧｍｂＺ－
ＩＰ６２ａｎｄ　ＧｍｂＺＩＰ７８ｇｅｎｅｓ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｓ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ
ＡＢＡ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｏｎｆｅｒ　ｓａｌｔ　ａｎｄ　ｆｒｅｅｚｉｎｇ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｒａｎｓ－
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ＩＰ１３２ｕｎｄｅｒ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ［Ｊ］Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ
Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００８ｂ，５０：２２１－２３０．
［２２］Ｈｓｉｅｈ　Ｔ　Ｈ，Ｌｉ　Ｃ　Ｗ，Ｓｕ　Ｒ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｏｍａｔｏ　ｂＺＩＰ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒ，ＳｌＡＲＥＢ，ｉｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｗａｔｅｒ　ｄｅｆｉｃｉｔ　ａｎｄ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅ－
ｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ，２０１０，２３１（６）：１４５９－１４７３．
［２３］Ｓａｔｏｈ　Ｒ，Ｆｕｊｉｔａ　Ｙ，Ｎａｋａｓｈｉｍａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｓｕｂｇｒｏｕｐ　ｏｆ
ｂＺＩＰ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ａｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ　ｉｎ　ｈｙ－
ｐｏｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＰｒｏＤＨ　ｇｅｎｅ　ｉｎ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００４，４５：３０９－３１７．
［２４］Ｐａｓｔｏｒｉ　Ｇ　Ｍ，Ｆｏｙｅｒ　Ｃ　Ｈ．Ｃｏｍｍｏｎ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｎｅｔｗｏｒｋｓ，ａｎｄ
ｐａｔｈｗａｙｓ　ｏｆ　ｃｒｏｓｓ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｓｔｒｅｓｓ．ｔｈｅ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｒｏｌｅ　ｏｆ′
ｒｅｄｏｘ′ａｎ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏ－
ｇｙ，２００２，１２９：４６０－４６８．
［２５］Ｋｉｍ　Ｓ，Ｃｈｏｉ　Ｈ　Ｉ，Ｒｙｕ　Ｈ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．ＡＲＩＡ，ａｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ａｒｍ
ｒｅｐｅａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ａ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ
ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｓ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ａｂｓｃｉｓｉｃ
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［２６］Ｋｉｍ　Ｓ　Ｙ．Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ＡＢＦ　ｆａｍｉｌｙ　ｂＺＩＰ　ｃｌａｓｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，２００６，
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·１０２·第２期　　　　　　　　　　　　　　　高世庆等：偃麦草ＥｒＡＢＦ１基因克隆及功能分析