全 文 ：书麦类作物学报　２０１４，３４（１２）：１５９５－１６０２
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ　Ｃｒｏｐｓ　 ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－１０４１．２０１４．１２．０１
网络出版时间：２０１４－１２－８
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３５９．Ｓ．２０１４１２０８．１１２４．００１．ｈｔｍｌ
基于ＴＲＡＰ的长穗偃麦草ＳＣＡＲ标记的开发及应用
收稿日期：２０１４－０８－０５　　　修回日期：２０１４－０９－２８
基金项目：国家自然科学基金项目（３１０７１４０６）；高等学校博士学科点基金项目（２０１２３２５０１１００１０）；江苏省科技支撑计划项目
（ＢＥ２０１３４３９）
第一作者：Ｅ－ｍａｉｌ：６０３３４５２９８ｑｉｎ＠１６３．ｃｏｍ（秦树文）；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｚｄｘｄａｉｙｉ＠１６３．ｃｏｍ（共同第一作者戴 毅）
通讯作者：陈建民（Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｍｃｈｅｎ＠ｙｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）
秦树文１，戴 毅１，陈士强２，张璐璐１，刘慧萍１，
曹文广３，ＦＥＤＡＫ　Ｇｅｏｒｇｅ３，高 勇１，陈建民１
（１．扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州２２５００９；２．江苏省里下河地区农科所，江苏扬州
２２５００７；３．东部粮油作物研究中心，加拿大渥太华）
摘　要：为了开发长穗偃麦草的特异标记，依据ＴＲＡＰ技术，利用５６对固定引物与随机引物的组合对中
国春－长穗偃麦草附加系等材料进行ＰＣＲ扩增，共筛选出１６０条分布于长穗偃麦草１Ｅ－７Ｅ染色体的特异扩增
片段。通过对１０４个片段的序列进行同源比对，选择与小麦无同源序列的区段设计１３８对引物，分别对中国
春、长穗偃麦草、中国春－长穗偃麦草附加系进行ＰＣＲ扩增，最终获得３０个长穗偃麦草特异ＳＣＡＲ标记，发展
标记的效率为５３．６％。利用这些特异ＳＣＡＲ标记对硬粒小麦（ＡＡＢＢ）与异源六倍体小麦（ＡＡＢＢＥＥ）杂交产
生的Ｆ２中３８个单株进行扩增鉴定，９个单株仅附加了１条相同的Ｅ染色体，其余为多条Ｅ染色体或者无Ｅ
染色体附加。这些ＳＣＡＲ标记在不同材料和世代表现出优越的特异性和稳定性，可用于检测小麦背景中附
加的相关长穗偃麦草染色体。
关键词：长穗偃麦草；小麦；ＴＲＡＰ技术；基因组特异标记；染色体特异标记
中图分类号：Ｓ５１２．９；Ｓ３３６　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１００９－１０４１（２０１４）１２－１５９５－０８
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＳＣＡＲ　Ｍａｒｋｅｒｓ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｔｏ　Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍｂｙ　ＴＲＡＰ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ＱＩＮ　Ｓｈｕｗｅｎ１，ＤＡＩ　Ｙｉ　１，ＣＨＥＮ　Ｓｈｉｑｉａｎｇ２，ＺＨＡＮＧ　Ｌｕｌｕ１，ＬＩＵ　Ｈｕｉｐｉｎｇ１，
ＣＡＯ　Ｗｅｎｇｕａｎｇ３，ＦＥＤＡＫ　Ｇｅｏｒｇｅ３，ＧＡＯ　Ｙｏｎｇ１，ＣＨＥＮ　Ｊｉａｎｍｉｎ１
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ　２２５００９，Ｃｈｉｎａ；２．Ｌｉｘｉａｈｅ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ　２２５００７，Ｃｈｉｎａ；３．Ｅａｓｔｅｒｎ　ｃｅｒｅａｌ　ａｎｄ　ｏｉｌｓｅｅｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｃｅｎｔｅｒ，Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍｉｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ａｌｉｅｎ　ｇｅｎｅ　ｐｏｏｌ　ｆｏｒ　ｗｈｅａｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ．Ｉｔ　ｉｓ
ｎｅｃｅｓｓａｒｙ　ｔｏ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｏｆ　Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍｆｏｒ　ｉｔｓ　ｕｓｅｆｕｌ　ｇｅｎｅｓ　ｔｏ　ｂｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｉｎｔｏ
ｗｈｅａｔ．Ｆｉｆｔｙ　ｓｉｘ　ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ｆｉｘｅｄ　ａｎｄ　ａｒｂｉｔｒａｒｙ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ．Ｏｎｅ　ｈｕｎｄｒｅｄ　ａｎｄ　ｓｉｘｔｙ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ　Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　１Ｅｔｏ　７Ｅｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ａｍｏｎｇ　ｔｈｅｍ，１０４
ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｅｘｉｓｔｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ　ｉｎ　ＧｅｎＢａｎｋ．Ｏｎｅ　ｈｕｎ－
ｄｒｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｉｒｔｙ　ｅｉｇｈｔ　ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ａ－
ｎａｌｙｓｉｓ．ＤＮＡｓ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ，Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍａｎｄ　ｓｅｒｉｅｓ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ－Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅｓ
ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　１３８ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ．Ｅｖｅｎｔｕａｌｙ，ｔｈｉｒｔｙ　ＳＣＡＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｏ
Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍｗｅｒｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　５３．５％ａｎｄ　ｅａｃｈ　Ｅ－ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　ｏｆ　Ｔｈ．ｅｌｏｎ－
ｇａｔｕｍｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅｓｅ　ＳＣＡＲ　ｍａｒｋｅｒｓ．Ｔｈｅｓｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＳＣＡＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ
ｓｃｒｅｅｎ　３８Ｆ２ｐｌａｎｔｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃｒｏｓｓ　ｏｆ　ａ　ｄｕｒｕｍ“Ｌａｎｇｄｏｎ”（ＡＡＢＢ）ｗｉｔｈ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｈｅｘａｐｌｏｉｄ
ｗｈｅａｔ（ＡＡＢＢＥＥ）．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　９ｐｌａｎｔｓ　ｈａｄ　ａｎ　Ｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎ；ｔｈｅ　ｒｅｓｔ　ｗａｓ
ｗｉｔｈ　ｍｏｒｅ　Ｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　ｏｒ　ｎｏ　Ｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　３８Ｆ２ｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ　ｔｈｅｓｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＳＣＡＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ　ｅｘｃｅｌｅｎｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｎｏｔ　ｏｎｌｙ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｅ
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ－ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｂｕｔ　ａｌｓｏ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｓｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍａｒｋｅｒｓ
ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｃｋｉｎｇ　ｏｆ　Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　ｉｎ　ｗｈｅａｔ　ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍ；Ｗｈｅａｔ；ＴＲＡＰ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｇｅｎｏｍｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍａｒｋｅｒ；Ｃｈｒｏｍｏ－
ｓｏｍｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍａｒｋｅｒ
　　偃麦草属（Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍｓｙｓ．Ｅｌｙｔｒｉｇｉａｓｙｓ．
Ｌｏｐｈｏｐｙｒｕｍｓｙｓ．Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ）由禾本科小麦族
多年生草本植物组成，具有抗多种小麦病害及抗
寒、耐旱、耐盐碱等特点，是小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉ－
ｖｕｍ）的三级基因库［１－３］。偃麦草属的长穗偃麦草
（Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｅｌｏｎｇａｔｅ；Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍ；
Ｌｏｐｈｏｐｙｒｍｎ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍ；Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ　ｅｌｏｎｇａ－
ｔｕｍ ）主要有二倍体 （２ｎ＝２ｘ＝１４）、四倍体 （２ｎ
＝４ｘ＝２８）和十倍体（２ｎ＝１０ｘ＝７０）３种染色体
倍型，也有六倍体的报道［４］。偃麦草属植物的染
色体组成复杂，至今没有一致的染色体组成公式，
但认为二倍体长穗偃麦草（Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ，２ｎ＝
２ｘ＝１４）含基本染色体组Ｅｅ［５］。Ｄｖｏｒａｋ等［６－７］将
长穗偃麦草的７对染色体分别附加到小麦中国春
背景中，育成了一套中国春－长穗偃麦草二体附加
系（２ｎ＝４４），在此基础上又选育了全套二体代换
系。人们利用这些材料对长穗偃麦草Ｅｅ 染色体
组的抗病性进行了研究，发现在１Ｅ和７Ｅ染色体
上携带有赤霉病抗性基因［８－１０］；在３Ｅ染色体上具
有抗小麦条锈病显性基因（ＹｒＥ）［１１］。此外，长穗
偃麦草还具有多花、大穗以及极强的抗逆境等优
良特性，因此，通过远缘杂交将其优良性状导入小
麦，并有效地鉴定出长穗偃麦草的遗传物质，对小
麦遗传改良具有重要意义［１２］。
随着分子生物学技术的发展，借助ＤＮＡ 分
子标记可以准确检测外源遗传物质的存在及基因
组水平的差异。目前，利用 ＲＡＰＤ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＡＦＬＰ （ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ
ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＳＳＨ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｕｂ－
ｔｒａｃｔｉｖｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）和 ＳＬＡＦ－ｓｅｑ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｌｅｎｇｔｈ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）等技术已
经获得了一些Ｅ染色体特异标记。而以上开发
分子标记技术并未依靠长穗偃麦草序列信息，因
小麦与长穗偃麦草基因组间的同源性较高，使长
穗偃麦草特异标记开发的效率较低，难以发展大
量的长穗偃麦草特异标记。在众多分子标记中，
序列特异性扩增区（ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ａｍ－
ｐｌｉｆｉｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ，ＳＣＡＲ）在标记辅助选择实践中最
易成为与具体性状连锁并能自动化的首选标
记［１３］。在陆地棉中筛选到１个与 ＨＢ（红花）连锁
的特异ＳＣＡＲ标记，为杂交种的纯度鉴定提供了
有效手段，促进了红花性状杂交种的标记辅助育
种进程［１４］。ＳＣＡＲ标记扩增的条带数少、易分辨
和稳定性好，但是其最大的缺点是标记的来源及
数目有限。
目标区域扩增多态性（ｔａｒｇｅｔ　ｒｅｇｉｏｎ　ａｍｐｌｉ－
ｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＴＲＡＰ）是从相关序列扩增多
态性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，
ＳＲＡＰ）［１５］改进而来的新型分子标记技术，具有操
作简单，多态性高、稳定性强的特点［１６］，是一种适
合于植物种质遗传多样性研究的分子标记［１７－１８］。
ＴＲＡＰ技术利用ＥＳＴ序列，由于可能具有功能信
息而被应用于小麦等不同作物的遗传图谱构建和
ＱＴＬ的定位分析［１９－２１］、重要性状基因标记的研究
中［２２－２４］。ＴＲＡＰ技术还可以扩增小麦 Ａ、Ｂ、Ｄ基
因组单一染色体而作为特异标记，但扩增条带的
划分很费时间［２５］。目前没有长穗偃麦草的全基
因组序列，加上小麦与长穗偃麦草的同源性高，利
用小麦的ＥＳＴ序列很难获得大量的长穗偃麦草
特异标记［２６］，从而使长穗偃麦草的优良基因和分
子标记的连锁分析难以研究。目前尚未见到基于
ＴＲＡＰ技术开发长穗偃麦草染色体特异ＳＣＡＲ
标记的报道。因此，本研究旨在建立依据ＴＲＡＰ
技术开发长穗偃麦草染色体特异ＳＣＡＲ标记的
体系，开发多个特异的ＳＣＡＲ标记确定和跟踪小
麦背景中长穗偃麦草相应的染色体或片段，为小
麦背景中长穗偃麦草遗传物质的有效鉴定及长穗
偃麦草种质在小麦遗传改良中的有效利用提供新
方法。
１　材料与方法
１．１　试验材料
中国春－长穗偃麦草附加系（ＡＤ　ｌｉｎｅｓ）７份，
中国春－长穗偃麦草代换系（ＤＳ　ｌｉｎｅｓ）２０份及中
·６９５１· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３４卷
国春（ＣＳ）、二倍体长穗偃麦草（２ｎ＝２ｘ＝１４）和中
国春－长穗偃麦草１Ｅ／１Ａ代换系与扬麦１５８杂交
的Ｆ２ 代；硬粒小麦（Ｌａｎｇｄｏｎ，ＡＡＢＢ）、异源六倍
体小麦（８８０１，ＡＡＢＢＥＥ）及其它们杂交产生的Ｆ２
代。以上材料均由加拿大农业部的 Ｄｒ．Ｆｅｄａｋ
提供。
１．２　ＰＣＲ扩增引物
在ＧｅｎＢａｎｋ中查找到长穗偃麦草的ＥＳＴ序
列 （ＤＴ０４５９３４），大小为６９９ｂｐ，与高分子量谷蛋
白基因相关。以此序列设计的８个固定引物（表
１，Ａ１～Ａ４及Ｃ１～Ｃ４）及已公布的１４个随机引
物［１５］（表１）排列组合成５６对引物（Ｑ１～Ｑ５６）。
表１　所用引物序列信息
Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
引物名称
Ｎａｍｅ　ｏｆ
ｐｒｉｍｅｒｓ
引物序列（５′－３′）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′－３′）
碱基数
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ
ｂａｓｅ／ｂｐ
引物名称
Ｎａｍｅ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ
引物序列（５′－３′）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′－３′）
碱基数
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ
ｂａｓｅ／ｂｐ
Ａ１ ＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＧＡＧＧＡ　 １８ Ｂ４ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡ　 １８
Ａ２ ＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＡＧＴ　 １９ Ｄ１ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＣＡＣＧＣＴＧＡ　 １９
Ａ３ ＣＡＡＴＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣ　 １８ Ｄ２ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＣＡＣＧＣＡＡＣ　 １９
Ａ４ ＡＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＣＡＧ　 １８ Ｄ３ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＣＡＣＧＣＧＣＡ　 １９
Ｃ１ ＴＣＴＣＣＧＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＡＡ　 １８ Ｄ４ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＣＡＣＧＣＣＴＧ　 １９
Ｃ２ ＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＡＴＴＴ　 １８ ＴＤ１ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣ　 １７
Ｃ３ ＣＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＡＡＧＣＴＧＡＣ　 １９ ＴＤ２ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧ　 １７
Ｃ４ ＣＧＡＣＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＧＡＧＣ　 １８ ＴＤ３ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＡＡ　 １７
Ｂ１ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＴＡ　 １７ ＴＤ４ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＴ　 １８
Ｂ２ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＴ　 １７ ＴＤ５ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣ　 １８
Ｂ３ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣ　 １８ ＴＤ６ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡ　 １８
　　Ａ１～Ａ４及Ｃ１～Ｃ４为固定引物，其余为随机引物
Ａ１～Ａ４ａｎｄ　Ｃ１～Ｃ４ａｒｅ　ｆｉｘｅｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ，ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒｓ　ａｒｅ　ａｒｂｉｔｒａｒｙ　ｐｒｉｍｅｒｓ
１．３　实验方法
１．３．１　基因组ＤＮＡ的提取和ＰＣＲ扩增
以ＳＤＳ酚－氯仿法微量提取各材料ＤＮＡ［２７］。
ＰＣＲ扩增反应体系为２５μＬ，包括模板ＤＮＡ（１００
ｎｇ·μＬ
－１）１．０μＬ、１０×ＰＣＲ缓冲液２．５μＬ、
ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）２．０μＬ、引物１（１０μｍｏｌ
·Ｌ－１）１．０μＬ、引物２（１０μｍｏｌ·Ｌ
－１）１．０μＬ、
ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ·μＬ
－１）０．３μＬ、ｄｄＨ２Ｏ定容
至２５μＬ。ＰＣＲ程序：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃
变性４５ｓ，３５℃退火４５ｓ，７２℃延伸６０ｓ，５个循
环；９４℃变性４５ｓ，５０℃退火４５ｓ，７２℃延伸
９０ｓ，３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。６％聚丙烯
酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）检测扩增结果，筛选同一
引物组合在不同材料间扩增的特异条带。
１．３．２　特异条带再次扩增
将特定扩增条带切割，分别用２００μＬ　０．１×
ＴＥ溶液和ｄｄＨ２Ｏ 浸泡３０ｍｉｎ，去除液体，再加
入３０μＬ　ｄｄＨ２Ｏ，１００℃水浴１０ｍｉｎ后将胶块捣
碎，３　７００ｒ·ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ，取３μＬ上清液
作为２５μＬ的ＰＣＲ反应体系中的模板，利用扩增
该特异条带的引物再次以相同程序进行ＰＣＲ扩
增。１％琼脂糖凝胶电泳同时检测再次扩增产物
与原扩增产物，若两者的电泳迁移率相同，说明切
割回收的条带为正确的特异条带。
１．３．３　特异条带测序及引物设计
按产品操作说明书，回收琼脂糖凝胶上的特
异ＤＮＡ片段与ｐＭＤ１８／１９－Ｔ（ＴａＫａＲａ）进行连
接，连接产物转化大肠杆菌并从转化平板上挑取
白色单菌落，３７℃下震荡培养８ｈ后进行菌落
ＰＣＲ，对阳性克隆进行测序。最后将序列结果在
ＧｅｎＢａｎｋ中与已知小麦ＤＮＡ 序列进行比对，无
同源性或同源性小于５０％的序列即视为长穗偃
麦草染色体特异序列，依据这些特异序列利用
ｐｒｉｍｅｒ　５．０设计引物开发长穗偃麦草的ＳＣＡＲ
标记。
２　结果与分析
２．１　长穗偃麦草Ｅｅ组染色体的特异扩增片段
利用５６对引物组合分别对中国春、长穗偃麦
草和中国春－长穗偃麦草附加系进行扩增，ＰＡＧＥ
分离。若某引物组合在中国春－长穗偃麦草附加
系和长穗偃麦草中均能扩增相同大小的片段，而
在中国春中却不能扩增，则初步判断该片段为长
穗偃麦草特异的片段。利用中国春－长穗偃麦草
·７９５１·第１２期 秦树文等：基于ＴＲＡＰ的长穗偃麦草ＳＣＡＲ标记的开发及应用
不同Ｅ染色体附加系，可将扩增的特异片段定位
到不同的Ｅ染色体。依据上述标准共获得１６０
条分布于长穗偃麦草Ｅｅ 组所有染色体上的特异
片段（图１）。
２．２　Ｅｅ基因组和Ｅ染色体的特异ＳＣＡＲ标记
回收１６０条特异片段并测序，获得了１０４条
片段的ＤＮＡ序列。依据比对结果，选择与小麦
高同源性区段之外序列部分，共设计出１３８对特
异性引物，其中有的片段序列设计了２对或者３
对引物。以１３８对特异引物，对中国春、长穗偃麦
草和中国春－长穗偃麦草附加系以及中国春－长穗
偃麦草代换系进行ＰＣＲ扩增，获得长穗偃麦草特
异ＳＣＡＲ标记２１个，其中染色体特异标记１８
个，包括１Ｅ的２个、２Ｅ的５个、３Ｅ的２个、４Ｅ的
１个、５Ｅ的４个、６Ｅ的１个、７Ｅ的３个，基因组特
异标记３个（表２），这些重新设计的引物所扩增
的染色体和最初回收条带所在染色体有８３．３％保
持一致。各Ｅ染色体在中国春－长穗偃麦草附加系、
中国春、长穗偃麦草的ＰＣＲ扩增结果见图２。
　　１～７：附加系 ＤＡ１Ｅ ～ＤＡ７Ｅ；８：中国春；９：长穗偃麦草
（２Ｘ）；Ａ～Ｇ：１Ｅ～７Ｅ染色体特异的扩增片段
１～７：Ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ＤＡ１Ｅｔｏ　ＤＡ７Ｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；８：
Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ（ＣＳ）；９：Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ（２Ｘ）；Ａ～Ｇ：Ｔｈｅ　ａｍｐｌｉ－
ｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　１Ｅｔｏ　７Ｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
图１　引物组合对长穗偃麦草Ｅｅ组染色
体特异扩增片段的筛选
Ｆｉｇ．１　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
ｏｎ　ｅａｃｈ　Ｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｏｆ　Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ
ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
表２　长穗偃麦草染色体特异ＳＣＡＲ标记及引物序列
Ｔａｂｌｅ　２　Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＳＣＡＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏｒ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　ｏｆ　Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ
引物组合和片段
Ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
ａｎｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ
ＳＣＡＲ标记
ＳＣＡＲ　Ｍａｒｋｅｒ
引物序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ（５′－３′）
正向引物Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ 反向引物 Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ
扩增染色体及片段大小
Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ
ａｎｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｓｉｚｅ／ｂｐ
Ｑ１２－Ｔ１ ＳＭ１Ｅ＿１ ＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＡＧＡＣＴＣＡＣＴＣ　 ＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡ　 １Ｅ／１３０
Ｑ１４－Ｔ１ ＳＭ１Ｅ＿２ ＣＧＡＣＧＡＡＡＣＡＧＧＴＧＴＧＣＴＡ　 ＧＡＡＴＣＡＴＴＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧ　 １Ｅ／２１５
Ｑ１６－Ｔ１ ＳＭ２Ｅ＿１ ＣＡＧＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＣＣ　 ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＧＴＴＣＣＧＣＡＧ　 ２Ｅ／４８０
Ｑ１９－Ｔ１ ＳＭ２Ｅ＿２ ＣＧＣＧＣＡＴＣＧＴＡＣＣＡＧＴＴＡＧＴ　 ＧＴＡＧＴＴＣＡＴＧＣＧＣＡＣＡＣＡＣＴ　 ２Ｅ／４００
Ｑ１９－Ｔ２ ＳＭ２Ｅ＿３ ＧＴＧＴＧＴＧＣＧＣＡＴＧＡＡＣＴＡＣＴＴ　 ＧＧＡＧＴＣＧＴＴＧＧＴＴＧＧＡＣＡＴＧ　 ２Ｅ／２２５
Ｑ２７－Ｔ１ ＳＭ２Ｅ＿４ ＡＴＧＣＴＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＧ　 ＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＴＡＣＣＡＴＧＡＴＣＧ　 ２Ｅ／１２５
Ｑ２７－Ｔ２ ＳＭ２Ｅ＿５ ＡＴＧＣＴＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＧ　 ＣＡＡＡＣＧＡＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＡＣ　 ２Ｅ／１９５
Ｑ５５－Ｔ１ ＳＭ３Ｅ＿１ ＣＡＣＡＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＡＡＣＴＣＡＡＧ　 ＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣＣＧＴＣＧＡＴＣＡＧＡ　 ３Ｅ／１９５
Ｑ５５－Ｔ２ ＳＭ３Ｅ＿２ ＧＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＡＣＡＣＴＴＧＴＡ　 ＴＧＧＣＡＡＡＡＧＴＡＴＴＣＴＧＡＡＣＣＧＴ　 ３Ｅ／１７０
Ｑ４７－Ｔ１ ＳＭ４Ｅ＿１ ＡＴＴＣＣＴＡＡＴＧＧＴＣＣＴＡＣＡＧＣ　 ＡＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＡＣＡＡＧＴＣ　 ４Ｅ／５８０
Ｑ４５－Ｔ１ ＳＭ５Ｅ＿１ ＣＡＣＧＧＣＴＡＣＧＣＧＧＡＴＧＡＡＣ　 ＧＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＧＴＴＧＴＡＧＡ　 ５Ｅ／２３５
Ｑ３２－Ｔ１ ＳＭ５Ｅ＿２ ＴＡＣＧＴＣＧＴＣＡＴＧＣＧＧＧＴＴＡＴ　 ＡＧＧＧＴＧＡＣＡＡＣＣＴＧＴＡＧＣＣＡ　 ５Ｅ／２０５
Ｑ３２－Ｔ２ ＳＭ５Ｅ＿３ ＧＣＴＧＡＣＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＣＴ　 ＡＣＡＡＣＣＴＧＴＡＧＣＣＡＧＡＴＣＡＣＧ　 ５Ｅ／２４５
Ｑ２２－Ｔ１ ＳＭ５Ｅ＿４ ＡＡＡＧＡＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＣＧＡＡＴ　 ＧＣＡＴＡＴＴＴＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＡＡＣＡ　 ５Ｅ／２６０
Ｑ４７－Ｔ２ ＳＭ６Ｅ＿１ ＡＣＴＡＴＴＴＡＧＴＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＡＴＧ　 ＴＧＧＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣＡＧＡ　 ６Ｅ／３６５
Ｑ４１－Ｔ１ ＳＭ７Ｅ＿１ ＴＴＡＧＡＡＧＴＡＴＡＧＣＴＡＣＣＴＧＣ　 ＴＣＣＣＴＡＧＴＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＣ　 ７Ｅ／１８５
Ｑ３２－Ｔ３ ＳＭ７Ｅ＿２ ＣＧＣＣＣＴＧＴＡＴＡＧＡＣＴＧＣＡＴＴＧ　 ＧＡＧＣＣＡＣＧＴＴＡＴＣＧＴＣＣＡＣＴＡ　 ７Ｅ／３５０
Ｑ３２－Ｔ４ ＳＭ７Ｅ＿３ ＴＣＴＣＧＣＴＡＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＡＴ　 ＡＣＡＴＧＣＡＴＡＣＴＣＴＴＴＧＴＣＣＡＣＡ　 ７Ｅ／２９５
Ｑ１６－Ｔ２ ＳＭ１－７Ｅ＿１ ＣＧＡＣＧＡＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＣＴ　 ＣＧＡＧＧＡＣＡＧＴＴＣＡＧＴＧＣＴ　 Ａｌ／４５５
Ｑ１６－Ｔ３ ＳＭ１－７Ｅ＿２ ＣＡＡＧＴＧＣＧＧＡＣＧＡＣＧＧＡＣ　 ＣＧＡＧＧＡＣＡＧＴＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＣ　 Ａｌ／４３５
Ｑ５４－Ｔ１ ＳＭ１－７Ｅ＿３ ＡＡＡＡＣＡＡＴＡＡＧＧＴＴＧＣＧＴＣＣＡＴＣ　 ＧＴＡＧＴＡＡＡＡＧＣＡＡＡＣＴＧＡＴＣＧＣＡ　 Ａｌ／１４５
　　原始扩增条带由引物组合Ｑ１～Ｑ５６（组合序号）＋Ｔｎ（片段序号）组成；标记名称由ＳＭ （特异标记）＋ｎＥ（Ｅ染色体序号）＋相同染
色体不同标记序号构成
Ｔｈｅ　ｎａｍｅ　ｏｆ　ｏｒｉｇｉｎａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｉｓ　ｃｏｍｐｏｓｅｄ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｐｌｕｓ　ｓｅｒｉｅｓ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ；Ｔｈｅ　ｍａｒｋｅｒ
ｎａｍｅ　ｉｓ　ｃｏｍｐｏｓｅｄ　ｏｆ“ＳＭ”ｆｏｒ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍａｒｋｅｒ，“ｎＥ”ｆｏｒ　ｅａｃｈ　Ｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｏｆ　Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ，ａｎｄ　ｐｌｕｓ　ｔｈｅ　ｓｅｒｉｅｓ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｍａｒｋｅｒｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ
·８９５１· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３４卷
　　Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１～７：附加系ＤＡ１Ｅ～ＤＡ７Ｅ；８：中国
春；９：长穗偃麦草（２Ｘ）
Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１～７：Ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ＤＡ１Ｅｔｏ
ＤＡ７Ｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；８：Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ（ＣＳ）；９：Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ
（２Ｘ）；Ａ：ＳＭ１Ｅ＿２；Ｂ：ＳＭ２Ｅ＿１；Ｃ：ＳＭ３Ｅ＿１；Ｄ：ＳＭ４Ｅ＿１；Ｅ：
ＳＭ５Ｅ＿１；Ｆ：ＳＭ６Ｅ＿１；Ｇ：ＳＭ７Ｅ＿１；Ｈ：ＳＭ１－７Ｅ＿１
图２　长穗偃麦草基因组和染色体特异ＳＣＡＲ标记
Ｆｉｇ．２　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ａｎｄ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＳＣＡＲ
ｍａｒｋｅｒｓ　ｏｆ　Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ
　　另外，利用重新设计的引物扩增时，有９对引
物在两条Ｅ染色体上扩增了相同大小的条带，即
ＳＣＡＲ标记。如依据１Ｅ染色体片段测序结果重
新设计的引物除了在１Ｅ出现扩增外，在４Ｅ也出
现相同扩增；同样，来自６Ｅ染色体的引物在２Ｅ
也出现相同扩增；来自４Ｅ染色体的引物在５Ｅ也
出现相同扩增；来自７Ｅ染色体的引物在６Ｅ也出
现相同扩增 （图片未提供）。结果表明在１３８对
引物中，共获３０个特异ＳＣＡＲ标记，其中单一Ｅ
染色体ＳＣＡＲ标记１８个，两条Ｅ染色体ＳＣＡＲ
标记９个，全基因组ＳＣＡＲ标记３个，发展效率
为２１．７％ （３０／１３８）。以开始引物组合数计算，发
展效率为５３．６％（３０／５６）。
２．３　长穗偃麦草染色体ＳＣＡＲ标记的特异性和
稳定性
部分ＳＣＡＲ标记扩增的特异性和稳定性结
果如图３所示。来自１Ｅ染色体的ＳＭ１Ｅ＿２和２Ｅ
染色体ＳＭ２Ｅ＿１引物在长穗偃麦草和对应染色
　　Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；Ａ：ＳＭ１Ｅ＿２、ＳＭ２Ｅ＿１标记在附加系、代换系的扩增（１～７：附加系ＤＡ１Ｅ～ＤＡ７Ｅ；８：中国春；９：二倍体长穗偃
麦草；１０～１６：代换系ＤＳ１Ｅ／１Ｄ～ＤＳ７Ｅ／７Ｄ）；Ｂ：ＳＭ１Ｅ＿２标记在所有代换系的扩增（１～３：１Ｅ染色体代换系；４～１９：其他Ｅ染色体代换
系；２０：中国春；２１：二倍体长穗偃麦草）；Ｃ：ＳＭ１Ｅ＿２标记在Ｆ２的扩增（１～１８：１Ｅ／１Ａ代换系与扬麦１５８杂交Ｆ２代单株；１９：扬麦１５８；
２０：１Ｅ／１Ａ代换系）
Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；Ａ：Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＭ１Ｅ＿２ａｎｄ　ＳＭ２Ｅ＿１ｍａｒｋｅｒｓ　ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｌｉｎｅｓ［１～７：Ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅｓ　ｆｒｏｍ
ＤＡ１Ｅｔｏ　ＤＡ７Ｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；８：Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ；９：Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ（２Ｘ）；１０～１６：Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｌｉｎｅｓ　ＤＳ１Ｅ／１Ｄ，ＤＳ２Ｅ／２Ｄ，ＤＳ３Ｅ／３Ｄ，ＤＳ４Ｅ／
４Ｄ，ＤＳ５Ｅ／５Ｄ，ＤＳ６Ｅ／６Ｄ，ＤＳ７Ｅ／７Ｄ］；Ｂ：Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＭ１Ｅ＿２ｉｎ　ａｌ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｌｉｎｅｓ［１～３：１Ｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｌｉｎｅｓ
ＤＳ１Ｅ／１Ａ，ＤＳ１Ｅ／１Ｂ，ＤＳ１Ｅ／１Ｄ；４～１９：Ｏｔｈｅｒ　Ｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｌｉｎｅｓ；２０：Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ；２１：Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ（２Ｘ）］；Ｃ：Ａｍｐｌｉｆｉ－
ｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＭ１Ｅ＿２ｉｎ　Ｆ２ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ［１～１８：Ｆ２ｐｌａｎｔｓ　ｆｒｏｍ　ＤＳ１Ｅ／１Ａ×Ｙａｎｇｍａｉ　１５８；１９：Ｙａｎｇｍａｉ　１５８；２０：ＤＳ１Ｅ／１Ａｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｓｕｂ－
ｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｌｉｎｅｓ］
图３　 长穗偃麦草Ｅ染色体ＳＣＡＲ标记特异扩增
Ｆｉｇ．３　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｗｉｔｈ　ＳＣＡＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｏ　Ｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ
·９９５１·第１２期 秦树文等：基于ＴＲＡＰ的长穗偃麦草ＳＣＡＲ标记的开发及应用
体附加系、代换系中有特异扩增条带，而在中国春
中没有，表明该扩增条带为１Ｅ、２Ｅ染色体特异
ＳＣＡＲ标记（图３Ａ）。１Ｅ染色体特异ＳＣＡＲ标记
在所有中国春－长穗偃麦草的代换系中只有１Ｅ代
换系能够扩增（图３Ｂ），以及１Ｅ代换系与扬麦
１５８杂交的Ｆ２代出现１Ｅ染色体扩增单株与无１Ｅ
染色体扩增单株的分离（图３Ｃ），表现了所发展的
分子标记在不同材料和不同世代中扩增染色体的
特异性和稳定性。
２．４　附加Ｅ染色体单株的标记鉴定
以硬粒小麦 Ｌａｎｇｄｏｎ和异源六倍体小麦
８８０１杂交的不同Ｆ１（２ｎ＝ＡＡＢＢＥ＝３５）单株自交
产生的Ｆ２群体为鉴定材料，以中国春（ＣＳ）、长穗
偃麦草（２Ｘ）为对照。每株Ｆ１ 选取２０粒Ｆ２种子
发芽生长，其中Ｆ１－１存活６株，Ｆ１－７存活１３株，
Ｆ１－１０存活１０株，Ｆ１－１１存活９株，共３８株并提
取ＤＮＡ。以本研究开发的长穗偃麦草的特异
ＳＣＡＲ标记（表２中斜体字标记）进行检测，首先
用基因组特异标记ＳＭ１－７Ｅ＿１对３８株小麦进行
扩增，结果２７个单株有特异扩增条带（图４Ａ）。
然后用染色体特异标记对筛选出的２７个植株进
行ＰＣＲ扩增，结果显示含１Ｅ染色体１株（６泳
道），３Ｅ１株（３８泳道），４Ｅ３株（１３、２３、３７泳道），
５Ｅ１株（９泳道），６Ｅ１株（１９泳道），７Ｅ２株（５、
２０泳道）（图４Ｂ），这些植株仅一条Ｅ染色体特异
扩增，表明附加了一条或者两条相同Ｅ染色体，
ＰＣＲ结果没有２Ｅ染色体的单独附加，但出现多
株２Ｅ染色体与其他Ｅ染色体同时附加的单株。
　　Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；Ａ：ＳＭ１－７Ｅ＿１对Ｆ２单株的ＰＣＲ扩增（１～３８：不同Ｆ２单株；３９：硬粒小麦；４０：８８０１）；Ｂ：染色体特异标记对２７
个植株的ＰＣＲ扩增（１～３８：来自Ａ中含长穗偃麦草染色体的单株；３９：硬粒小麦；４０：８８０１）
Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；Ａ：ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＭ１－７Ｅ＿１ｆｏｒ　Ｆ２ｐｌａｎｔｓ（１－３８：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｆ２ｐｌａｎｔｓ；３９：Ｄｕｒｕｍ；４０：８８０１）；Ｂ：ＰＣＲ　ａｍ－
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍａｒｋｅｒ　ｉｎ　２７Ｆ２ｐｌａｎｔｓ（１～３８：Ｔｈｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｆｒｏｍ　Ａ　ｗｉｔｈ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｏｆ　Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ；３９：Ｄｕｒｕｍ；４０：
８８０１）
图４　Ｆ２代中长穗偃麦草染色体的检测
Ｆｉｇ．４　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｉｎ　Ｆ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
３　讨 论
３．１　ＴＲＡＰ技术发展特异ＳＣＡＲ标记的可行性
目前，借助不同标记技术已经开发了一些长
穗偃麦草的特异分子标记，但总体来看，标记的数
量有限，筛选一种适合于长穗偃麦草特异标记开
发的高效、简单、价廉的途径具有重要意义。
ＴＲＡＰ技术在一次ＰＣＲ扩增中可产生大量的扩
增片段，为筛选特异条带提供了基础。利用此方
法曾进行了小麦 Ａ、Ｂ、Ｄ组染色体特异标记开
·００６１· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３４卷
发［２５］，但没有转化为分辨更简单的ＳＣＡＲ标记。
本研究利用长穗偃麦草的１条ＥＳＴ序列（所在染
色体未知）设计固定引物和已公布的随机引物进
行组合后对供试材料扩增，获得了分布在７条Ｅ
染色体上１６０条特异片段，表明依据随机ＥＳＴ序
列设计固定引物扩增的染色体也是随机的，可以
扩增Ｅ基因组所有染色体。来自不同植物ＥＳＴ
设计的固定引物可用于不同植物间扩增的结
果［１７］，为 ＥＳＴ 序列较少的长穗偃麦草利用
ＴＲＡＰ技术发展标记提供了可能。
本研究利用 １３８ 对引物获得 ３０ 个特异
ＳＣＡＲ标记，其中１８个为染色体特异的ＳＣＡＲ标
记，而大部分引物未能获得扩增片段或者扩增片
段无特异性，不能发展为Ｅ染色体特异标记。由
于目前小麦的全基因组序列在 ＧｅｎＢａｎｋ中不完
全，不能完全确认通过比对获得的序列就是长穗
偃麦草特异序列，从而导致依据疑为长穗偃麦草
序列设计的引物进行ＰＣＲ扩增无染色体特异性。
与 ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ、ＳＳＨ 和 ＳＬＡＦ－ｓｅｑ等方法相
比，ＴＲＡＰ技术开发长穗偃麦草的特异标记效率
比较高，为２１．７％（３０／１３８）或５３．６％（３０／５６）。
另外，从设计引物的ＤＮＡ序列来比较，ＴＲＡＰ技
术是依据具有某种功能的ＥＳＴ序列设计引物，而
依据 ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ、ＳＳＨ、ＳＬＡＦ－ｓｅｑ所获 ＤＮＡ
序列是随机的。当以ＥＳＴ序列设计引物时，其引
物与表现型的相关性和实用性相对较高。因此，
从可操作性、发展效率、性价比和应用前景综合考
虑，ＴＲＡＰ 技术用于开发长穗偃麦草的特异
ＳＣＡＲ标记是可行的。
３．２　长穗偃麦草特异分子标记的应用
利用 ＴＲＡＰ技术获得的长穗偃麦草特异
ＳＣＡＲ标记，表现了在不同材料和不同世代中扩
增的特异性和稳定性，这些标记的扩增结果是单
一条带的有或无，在琼脂糖凝胶上区分明显，使用
中无须区分和统计多条扩增条带，可用于小麦背
景中长穗偃麦草染色体的确定和跟踪。基因组特
异标记可以用来检测小麦背景中的长穗偃麦草染
色体，而染色体特异标记则可以检测单一的染色
体，如创建附加系、代换系可跟踪特定染色体。另
外，如果获得与长穗偃麦草的某种优良性状相关
的特异标记，可用于长穗偃麦草种质杂交后代的
辅助选择。ＳＣＡＲ标记的扩增结果简单而宜于自
动化，从而可用于大量材料的检测而提高育种的
选择效率。
除了单一染色体的ＳＣＡＲ标记外，还出现了
两条染色体的ＳＣＡＲ标记，这些依据同一Ｅ染色
体扩增片段设计的引物，在两条或以上Ｅ染色体
上扩增相同大小条带，其可能原因是该引物在配
对区段的染色体并非唯一性，从而能扩增两条或
以上Ｅ染色体均具有的特异条带。这类标记既
可以和单一染色体的标记联合应用，也可以单独
应用于Ｅ染色体的检测。如在利用长穗偃麦草
优良基因进行小麦遗传改良的过程中，通常知道
基因所在的Ｅ染色体和以该Ｅ染色体代换系为
供体与小麦杂交，在此类杂交组合中仅涉及一条
染色体，所以，这些在两条Ｅ染色体上出现的标
记也可以适用于长穗偃麦草单条染色体的检测与
跟踪。
目前，全套的硬粒小麦－长穗偃麦草附加系还
没有。Ｊａｕｈａｒ等［２８］将二倍体长穗偃麦草的１Ｅ染
色体附加到硬粒小麦Ｌａｎｇｄｏｎ背景中，育成了具
有抗赤霉病特性的硬粒小麦－长穗偃麦草附加
系，前后共花了１０年时间。本研究以硬粒小麦
Ｌａｎｇｄｏｎ与含有Ｅｅ组染色体的种质８８０１进行杂
交，理论上Ｆ１ 产生的Ｆ２中各单株可附加１－１４条
Ｅ染色体，Ｅ染色体可独立附加或相互间自由组
合附加，染色体数目为２ｎ＝２８－４２。首先利用长
穗偃麦草基因组引物ＳＭ１－７Ｅ＿１对３８株Ｆ２小麦
进行ＰＣＲ扩增，筛选出有扩增条带的植株２７株，
这２７株小麦理论上附加了长穗偃麦草的不同Ｅ
染色体，没有条带的植株则没有附加Ｅ染色体。
在此基础上再用染色体特异ＳＣＡＲ标记对２７株
进行ＰＣＲ扩增，结果表明这２７株小麦分别附加
不同Ｅ染色体和不同数目Ｅ染色体，和预期结果
一致。利用基因组和单一染色体特异ＳＣＡＲ标
记结合的方法，可筛选到附加单一Ｅ染色体的单
株，对此单株的后代进行染色体数目检查、ＧＩＳＨ
鉴定，进而从中筛选到硬粒小麦－长穗偃麦草双体
附加系是完全可行的。和传统的附加系创建方法
相比，在早代通过ＰＣＲ扩增就明确附加具体Ｅ
染色体的单株，缩短了培育时间，提高了准确性和
培育效率。
参考文献：
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ｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　ｏｎ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ　ｉｎ　ｗｈｅａｔ［Ｊ］．Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ
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ｇａｔｕｍ（Ｈｏｓｔ）Ａ．Ｌｏｖｅ　ｔｈａｔ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｈｅａｄ　ｓｃａｂ
ｏｆ　ｗｈｅａｔ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（四
川农业大学学报），２００１，１９（３）：２００－２０５（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇ－
ｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）．
［９］Ｓｈｅｎ　Ｘ　Ｒ，Ｏｈｍ　Ｈ．Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｈｅａｄ　ｂｌｉｇｈｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｄｅｒｉｖｅｄ
ｆｒｏｍ　Ｌｏｐｈｏｐｙｒｕｍ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　７Ｅａｎｄ　ｉｔｓ　ａｕｇ－
ｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｆｈｂ１ｉｎ　ｗｈｅａｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００６，
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［１０］Ｃｈｅｎ　Ｓ　Ｑ（陈士强），Ｈｕａｎｇ　Ｚ　Ｆ（黄泽峰），Ｚｈａｎｇ　Ｙ（张 勇），ｅｔ
ａｌ．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＦＨＢ　ｒｅｓｉｓｔ－
ａｎｃｅ　ｏｆ　Ｌｏｐｈｏｐｙｒｕｍ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍ ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｂａｃｋ－
ｇｒｏｕｎｄ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ　Ｃｒｏｐｓ（麦类作物学报），
２０１２，３２（５）：８３９－８４５（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）．
［１１］Ｍａ　Ｊ　Ｘ（马渐新），Ｚｈｏｕ　Ｒ　Ｈ（周荣华），Ｄｏｎｇ　Ｙ　Ｃ（董玉琛），ｅｔ
ａｌ．Ｇｅｎｅ　ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｔｒｉｐｅ　ｒｕｓｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｏｆ　Ｌｏｐｈｏｐｙｒｕｍ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（科
学通报），１９９９，４４（１）：６５－６９（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）．
［１２］ＬüＷ　Ｄ（吕伟东），Ｘｕ　Ｐ　Ｓ（徐鹏彬），Ｐｕ　Ｘ（蒲 训）．Ｓｕｍｍａｒｙ
ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｉｔｕａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ａｐｐｌｙｉｎｇ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ｆｒｏｍＥｌｙｔｒｉｇｉａ
ｉｎ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍｂｒｅｅｄｉｎｇ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｓｉｎｉ－
ｃａ（草业学报），２００７，１６（６）：１３６－１４０（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ
ａｂｓｔｒａｃｔ）．
［１３］Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ　Ｐ，Ｍａｒｔｉｎ　Ａ，Ｄｏｒａｄｏ　Ｇ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ＳＣＡＲｓ
ｂｙ　ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ＲＡＰＤ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ａｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ
ｔｈｅ　ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｍａｒｋｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ［Ｊ］．
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，１９９９，５：２４５－２５３．
［１４］Ｚｈａｏ　Ｊ　Ｓ（赵军胜），Ｃｈｅｎ　Ｙ（陈 莹），Ｇａｏ　Ｍ　Ｗ（高明伟），ｅｔ
ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ＳＣＡＲ　ｍａｒｋｅｒ　ｌｉｎｋｅｄ　ｔｏ　ＨＢ　ｒｅｄ－ｃｏｒｏｌａ
ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｃｏｔｔｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ｊｏｕｒｎａｌ（植物生理学
报），２０１２，４８（６）：５６５－５７０（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂ－
ｓｔｒａｃｔ）．
［１５］Ｌｉ　Ｇ，Ｑｕｉｒｏｓ　Ｃ　Ｆ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒ－
ｐｈｉｓｍ （ＳＲＡＰ），ａ　ｎｅｗ　ｍａｒｋｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ＰＣＲ
ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｍａｐｐｉｎｇ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｔａｇｇｉｎｇ　ｉｎ　Ｂｒａｓ－
ｓｉｃａ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，１０３：４５５－
４６１．
［１６］Ｈｕ　Ｊ　Ｇ，Ｖｉｃｋ　Ｂ　Ａ．Ｔａｒｇｅｔ　ｒｅｇｉｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒ－
ｐｈｉｓｍ：ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍａｒｋｅｒ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｐｌａｎｔ　ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ［Ｊ］．
Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，２００３，２１：２８９－２９４．
［１７］Ｈｕ　Ｊ　Ｇ，Ｏｃｈｏａ　Ｏ　Ｅ，Ｔｒｕｃｏ　Ｍ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ
ＴＲＡＰ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｔｏ　ｌｅｔｔｕｃｅ（Ｌａｃｔｕｃａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ
［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２００５，１４４：２２５－２３５．
［１８］Ｃｈｅｎｇ　Ｄ　Ｄ，Ｚｈａｎｇ　Ｆ　Ｊ，Ｌｉｕ　Ｌ　Ｗ，ｅｔ　ａｌ．ＴＲＡＰ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｇｅｎｅｒ－
ａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｇｅｎｅ　ａｎａｌｏｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ａｐｐｌｉｃａ－
ｔｉｏｎ　ｔｏ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒａｄｉｓｈ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ［Ｊ］．
Ｓｃｉｅｎｔｉａ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，２０１３，１６１：１５３－１５９．
［１９］Ｌｉｕ　Ｚ　Ｈ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｊ　Ａ，Ｈｕ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｗｈｅａｔ　ｉｎｔｅｒｖａｒｉｅｔａｌ　ｇｅ－
ｎｅｔｉｃ　ｌｉｎｋａｇｅ　ｍａｐ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　ａｎｄ　ｔａｒｇｅｔ　ｒｅｇｉｏｎ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｍａｒｋｅｒｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｕｔｉｌｉｔｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｔｒａｉｔ　ｌｏｃｉ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
２００５，１１１（４）：７８２－７９４．
［２０］Ｍｉｋｌａｓ　Ｐ　Ｎ，Ｈｕ　Ｊ，Ｇｒüｎｗａｌｄ　Ｎ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ　ＴＲＡＰ（Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）ｍａｒｋ－
ｅｒｓ　ｆｏｒ　ｍａｐｐｉｎｇ　ａｎｄ　ｔａｇｇｉｎｇ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｒａｉｔｓ　ｉｎ　ｃｏｍ－
ｍｏｎ　ｂｅａｎ［Ｊ］．Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，４６（２）：９１０－９１６．
［２１］Ｍｅｎｚｏ　Ｖ，Ｇｉａｒｃａｓｐｒｏ　Ａ，Ｇｉｏｖｅ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．ＴＲＡＰ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｍａｒｋｅｒｓ　ａｓ　ａ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｐ　ｏｆ　ｄｕ－
ｒｕｍ　ｗｈｅａｔ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２０１３，１９４：１５１－１６０．
［２２］Ｂａｒａｋａｔ　Ｍ　Ｎ，Ａｌ－Ｄｏｓｓ　Ａ　Ａ，Ｅｌｓｈａｆｅｉ　Ａ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ
ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｍｏｎｇ　ｗｈｅａｔ　ｄｏｕｂｌｅｄ　ｈａｐｌｏｉｄ　ｐｌａｎｔｓ　ｕ－
ｓｉｎｇ　ＴＲＡＰ　ｍａｒｋｅｒｓ　ａｎｄ　ｍｏｒｐｈｏ－ａｇｒｏｎｏｍｉｃ　ｔｒａｉｔｓ［Ｊ］．Ａｕｓ－
ｔｒａｌｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，７（１）：１０４－１１１．
［２３］Ｆｅｎｇ　Ｊ　Ｙ，Ｃｈｅｎ　Ｇ　Ｙ，Ｗｅｉ　Ｙ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｅ－
ｎｅｔｉｃ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｓｔｒｉｐｅ　ｒｕｓｔ
ｉｎ　ｗｈｅａｔ　ｌｉｎｅ　ＬＭ１６８－１［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２０１４，３３：
６０１－６０９．
［２４］Ｓａｌｃｈ　Ｍ　Ｓ，Ａｌ－Ｄｏｓｓ　Ａ　Ａ，Ｅｌｓｈａｆｅｉ　Ａ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｎｅｗ　ＴＲＡＰ　ｍａｒｋｅｒ　ｌｉｎｋｅｄ　ｔｏ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌ　ｃｏｎｔｅｎｔ，ｌｅａｆ　ｓｅｎｅｓ－
ｃｅｎｃｅ，ａｎｄ　ｃｅｌ　ｍｅｍｂｒａｎｃｅ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ｗａｔｅｒ－ｓｔｒｅｓｓｅｄ　ｗｈｅａｔ
［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，２０１４，５８（１）：６４－７０．
［２５］Ｌｉ　Ｌ，Ｋｌｉｎｄｗｏｒｔｈ　Ｄ　Ｌ，Ｓｈｉｒｅｅｎ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ－
ｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＲＡＰ　ｍａｒｋｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｆｏｒ　Ｌａｎｇｄｏｎ　ｄｕｒｕｍ　Ｄ－ｇｅｎｏｍｅ　ｄｉｓｏｍｉｃ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｌｉｎｅｓ［Ｊ］．
Ｇｅｎｏｍｅ，２００６，４９：１５４５－１５５４．
［２６］Ｍｕｌａｎ　Ｄ　Ｊ，Ｐｌａｔｔｅｔｅｒ　Ａ，Ｔｅａｋｌｅ　Ｎ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．ＥＳＴ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ＳＳＲ
ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｒｏｍ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｈｅａｔ　ｇｅｎｏｍｅ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉ－
ｆｙ　Ｌｏｐｈｏｐｙｒｕｍ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｌｏｃｉ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ，２００５，
４８：８１１－８２２．
［２７］Ｗａｎｇ　Ｊ　Ｘ（王景雪），Ｓｕｎ　Ｙ（孙 毅），Ｇａｏ　Ｗ　Ｊ（高武军）．Ａ
ｓｉｍｐｌｅ　ｏｆ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｐｌａｎｔ　ｔｏｔａｌ　ＤＮＡ
［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｈａｎｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎａｔｕｒｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ
（山西大学学报：自然科学版），２０００，２３（３）：２７１－２７２（ｉｎ　Ｃｈｉ－
ｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）．
［２８］Ｊａｕｈａｒ　Ｐ　Ｐ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　Ｔ　Ｓ，Ｘｕ　Ｓ　Ｓ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｄｕｒｕｍ　ａｌｉｅｎ　ｄｉｓｏｍｉｃ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｌｉｎｅ　ｗｉｔｈ
ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｈｅａｄ　ｂｌｉｇｈｔ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ，
２００９，５２（５）：４６７－４８３．
·２０６１· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３４卷