全 文 ：基金项目：国家自然科学基金项目(No. 31171839)、山西省留学基金项目(No. 2012-102)和山西省国际合作项目(No. 2012081006-2)
收稿日期：2014-04-21 接受日期：2014-05-22
小麦-中间偃麦草抗条锈病渗入系的分子细胞学鉴定
詹海仙 1，2 畅志坚 2 李光蓉 1 贾举庆 3 郭慧娟 2 张晓军 2 李欣 2 乔麟轶 2 杨足君 1*
1电子科技大学生命科学与技术学院，成都 610054；2山西省农业科学院作物科学研究所，太原 030031；3山西农业大学农学院，太谷
030801
*通讯作者，yangzujun@uestc.edu.cn
摘 要 小麦品系CH5383是源于中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)的兼抗多种小麦病害的新种质。
为明确其抗性来源和外源DNA片段的渗入位置，采用基因组原位杂交(GISH)和荧光原位杂交(FISH)对
CH5383进行分析，GISH分析未发现外源信号，FISH结果观察到CH5383的3BL染色体端部与对照小麦
(Triticum aestivum)品种中国春相比有明显的重组信号，初步推断CH5383染色体3BL端部可能有中间偃
麦草DNA片段插入。用135对PLUG(PCR-based landmark unique gene)标记对CH5383、中国春和多个近
缘物种进行扩增分析，发现位于3B染色体长臂端部的引物TNAC1383，能在CH5383和中间偃麦草中扩
增出大约 1 300 bp的特异DNA产物。从而进一步证实，CH5383是一个小麦－中间偃麦草小片段渗入
系，携带抗条锈病基因的外源中间偃麦草DNA渗入片段位于3B染色体端部0.81-1.00区段。CH5383可
以作为优异的小麦抗病育种新种质加以利用。
关键词 小麦，中间偃麦草，渗入系，原位杂交，PLUG标记
Cytogenetic and Molecular Identification of a Wheat(Triticum aestivum)-
Thinopyrum intermedium Introgression Line with Resistance to Stripe Rust
ZHAN Hai-Xian1,2 CHANG Zhi-Jian2 LI Guang-Rong1 JIA Ju-Qing3 GUO Hui-Juan2 ZHANG Xiao-Jun2
LI Xin2 QIAO Lin-Yi2 YANG Zu-Jun1*
1 School of Life Science and Technology, University of Electronic Science and Technology of China, Chengdu 610054, China; 2 Institute of Crop
Science, ShanxiAcademy ofAgricultural Sciences,Taiyuan 030031, China; 3 College of agronomy, ShanxiAgricultural University,Taigu 030801, China
* Corresponding author, yangzujun@uestc.edu.cn
Abstract Wheat(Triticum aestivum)-Thinopyrum intermedium introgression line CH5383 is high resistance to
wheat stripe rust and powdery mildew. It was characterized by genomic in situ hybridization (GISH),
fluorescence in situ hybridization (FISH) and molecular marker analysis. GISH using Th.intermedium DNA as
probe couldnt detect the alien signals. Strong hybridization signal in the distal region of wheat chromosome
3BL was observed when FISH using pHvG38 containing the simple GAA repeat as a probe. A total of 135
PLUG primer pairs were used to test in wheat Chinese Spring (CS), CH5383 and wheat related species. The
results showed that TNAC1383 displayed unique 1 300 bp bands of CH5383 and Th. intermedium.
Experimment also verified that CH5383 was a small wheat- alien introgression line and the alien Th.
intermedium DNA segments were possibly located in wheat bin 3BL- 0.81~1.00 region. Due to its good
diseases resistance, CH5383 can be useful in breeding programs.
Keywords Wheat, Thinopyrum intermedium, Introgression line, FISH, PLUG marker
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2014, 22(7): 841~845
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2014.07.006
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
0 引言
小麦条锈病是小麦生产中的重要病害，培育抗
病品种是防治条锈病的有效方法。由于条锈菌生
理小种具有高度变异性，抗病品种很容易被新出现
的生理小种克服而失去抗性。因此，发掘和鉴定多
抗性新种质对于抗病育种工作尤其重要。
中间偃麦草(Thinopyrum intermedium, 2n=42)属
于小麦的三级基因源，对小麦多种病害表现免疫，
是小麦抗病育种的重要远缘野生亲本。目前国际
上已经命名了多个源于中间偃麦草的抗病基因，包
括Mebrate等(2008)定位的抗叶锈病基因 Lr38，Liu
等(2013b)定位的抗杆锈病基因 Sr44，Luo等(2009)
和He等(2009)分别定位的抗白粉病基因Pm40和
Pm43，Zhang等(2004)报道的抗黄矮病基因 Bdv2，
Liu等(2013a)定位的抗条锈病基因Yr50。但是，大
部分基因的载体品种均是小麦与中间偃麦草大片
段易位系，导入的外源片段较大，不可避免的将偃
麦草的不利性状也导入小麦中。利用回交和自交
选育的小片段渗入系，其遗传背景与受体小麦亲本
基本相同，既可保持小麦亲本本身高产等农艺性
状，又含有外源物种的优异抗性，是小麦抗病育种
工作的主要目标。
PLUG(PCR-based landmark unique gene)标记
是根据内含子区域在不同物种中存在的潜在多态
性而设计开发的功能性标记，该标记重复性较好，
可用于小麦近缘物种间同源关系的分析，从而检测
到小麦背景中的外源染色体 和染色体片段。Hu
等(2011)利用 PLUG引物鉴定了一个中间偃麦草
1st代换小麦１D的代换系。刘成(2010)用 PLUG
引物分析了小麦－簇毛麦附加系的同源群关系。
当前对小片段抗病渗入系的鉴定研究涉及黑
麦和山羊草属等外源物种，但对中间偃麦草小片段
渗入系的分子细胞学分析还鲜有报道 (李欣等,
2012)。CH5383是山西省农科院畅志坚研究员从
中间偃麦草和普通小麦品种杂交和回交高代品系
中选育出的小麦－中间偃麦草DNA渗入系，对小
麦多个病害均表现免疫，具有分蘖力强、半矮秆、株
型紧凑和大穗多花等优良的农艺性状，可作为抗性
材料用于小麦抗病育种工作中。本实验对小麦－
中间偃麦草渗入系CH5383进行了分子细胞学分
析，找到渗入系中含有中间偃麦草外源DNA片段
的证据，为小麦抗病育种及新品种选育提供了基础
材料和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)和长穗偃
麦草(T. ponticm)由山西省农科院作物科学研究所
提供。拟鹅冠草(Pseudoroegneria spicata)、中国春
(Triticum aestivum)和簇毛麦(T. ponticm)均由本实验
室保存。
1.2 方法
1.2.1基因组原位杂交 (GISH)和荧光原位杂交
(FISH)
种子置于 22 ℃培养箱中露白，种子露白后在
4 ℃低温处理24~36 h，之后于22 ℃培养，待根尖长
到 2 cm左右时剪取根尖,冰水浴 22~24 h,卡诺固定
液固定7 d以上压片备用。参考Yang等(2005)SDS
法选取幼嫩叶片提取中间偃麦草和普通小麦品种
中国春的 DNA。按照说明书用 digoxigenin- 11-
dUTP分别标记中间偃麦草DNA和GAA重复序
列。GISH分析用中国春DNA作封阻。
1.2.2 PLUG标记分析
选取分布于小麦 7个同源群的 135对 PLUG
(PCR-based landmark unique gene)引物，其中：第 1
同源群染色体上20对，第2同源群染色体上21对，
第3同源群染色体上22对，第4同源群染色体上14
对，第 5同源群染色体上 17对，第 6同源群染色体
上18对，第7同源群染色体上23对。根据 Ishikawa
等(2009)发表的引物序列，由上海英骏生物技术有
限公司合成。PCR反应在MycycleTMThermalCy-
cler上进行。扩增反应体系包括1×PCR Buffer，1.5
nmol dNTPs，25 ng上下游引物，50 ng模板DNA和
0.75U Taq DNA聚合酶，总体积为 15 μL。扩增程
序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s, 57 ℃退火45
s，72 ℃延伸 2 min，35个循环，72 ℃延伸 10 min，
4 ℃保存备用。扩增产物用 8%非变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳，180 V稳压电泳2 h，银染观察并拍照。
2 结果与分析
2.1 细胞学分析
利用中间偃麦草DNA作探针，中国春DNA作
842
小麦-中间偃麦草抗条锈病渗入系的分子细胞学鉴定
Cytogenetic and Molecular Identification of a Wheat-Thinopyrum intermedium Introgression Line with Resistance to Stripe Rust
封阻，对CH5383进行GISH分析，在结果中未观察
到外源信号(图 1A)。利用小麦条锈病生理小种
CYR32对各材料进行成株期抗病性鉴定，CH5383
的供体亲本中间偃麦草免疫条锈病，系谱中的各小
麦品种对条锈病表现高度感病，说明CH5383对条
锈病的抗性可能来源于中间偃麦草(另文报道)，因
此推测，CH5383的外源片段较小，从而不能被
GISH检测到。Danilova等(2012)以包含GAA串联
重复序列的 pHvG38作探针的 FISH分析，产生的
杂交信号与小麦N带的带型一致，带型能够识别小
麦所有B基因组、2A-7A染色体、1D染色体、2D染
色体和 7D染色体。结果显示，CH5383的 FISH检
测结果与对照中国春相比在3B长臂端部和短臂中
部有明显的不同，CH5383染色体3B长臂端部有明
显的绿色信号，短臂中部与中国春相比也有很强的
杂交信号(图1B,1C)。说明这个CH5383的3B染色
体上的重复序列发生改变，可能有外源片段插入或
者重复序列发生了转座等情况。
2.2 PLUG标记分析
用 135对PLUG引物进一步检测CH5383中的
图 1 CH5383基因组原位杂交和荧光原位杂交分析
Figure 1 GISH and FISH of CH5383
A：GISH结果，探针为中间偃麦草，显示未有杂交信号；B：FISH结果，探针为pHvG38，绿色信号显示相应染色体；C：染色体
3B的zjpHvG38信号差异比较
A: GISH probed by Thinopyrum intermedium genomic DNA, indicating no signal; B: FISH probed by pHvG38 showing the hy-
bridized patterns of individual chromosomes; C: FISH patterns of chromosome 3B compared with CH5385 and Chinese Spring
引物名称
Primer name
TNAC1567
TNAC1782
TNAC1829
TNAC1383
TNAC1183
序列(5~3)
Sequence
F: ATGTTGGCTTTATACCAATGC
R: AGGTGCGGCTTCACTATCTTT
F: TCACTGAACAGCCTAGACATGG
R: ATTCGCAGACCGCATCTATC
F: GCCACTTCCTCCCTCCTC
R: GTCGGTCCTCCAGTATCAGC
F: GCGGTCGATCTTCTTCAAGTC
R: TCAGATGGACTATGGGAGCAC
F: ACGCAGTTCATTTCTCTCCAA
R: GAGGCACACAGAATGACCTCT
Tm/℃
57
57
57
57
57
酶切
Digestion
不切 None
不切 None
Taq1
不切 None
不切 None
染色体区段
Chromosome region
5AL17-0.78-0.87
5BL16-0.79-1.00
5DL5-0.76-1.00
7AS2-0.73-0.83
7BS2-0.27-1.00
7DS4-0.73-1.00
7AL16-0.86-0.90
7BL10-0.78-0.84
7DL2-0.61-0.82
3AL8-0.85-1.00
3BL11-0.81-1.00
3DL3-0.81-1.00
2AS5-0.78-1.00
2BS1-0.53-0.56
2DS5-0.47-1.00
表 1 5对PLUG引物统计
Table 1 The detail information of 5 primer pairs
843
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
外源片段，其中有5对引物TNAC1567、TNAC1782、
TNAC1829、TNAC1383 和 TNAC1183 在 CH5383
和中国春之间有多态性(图2)。进一步用CH5383的
野生亲本中间偃麦草和多个外缘物种进行扩增，发
现位于第三同源群长臂的引物 TNAC1383能在
CH5383和中间偃麦草中扩增出一致带型(图3)。由
于引物TNAC1383在小麦染色体3A、3B、3D和中间
偃麦草中都能扩增出清晰的多态性条带，可以检测
小麦背景材料中外源中间偃麦草DNA片段是否存
在。Ishikawa等(2009)将TNAC1383定位于小麦第
3同源群染色体，具体位置在 3AL-0.85-1.00，3BL-
0.81- 1.00 和 3DL- 0.81- 1.00 区段。由于引物
TNAC1383扩增小麦品种‘中国春’产生 3条 800~
1200 bp左右的条带，其片段从小到大分别代表小麦
A、B和D基因组，对应CH5383和中间偃麦草扩增
出的电泳条带，CH5383中导入的中间偃麦草DNA
片段位于染色体3BL上。结合FISH分析结果，确定
渗入系CH5383在染色体3BL端部有中间偃麦草的
外源DNA片段存在，其外源中间偃麦草抗性片段位
于3B染色体端部0.81~1.00区段。
3 讨论
将外源野生物种的抗性基因导入普通小麦的
过程中，往往导入的目标片段较大，除了有利性状
外，一些不利基因也被导入受体中，例如晚熟、低产
和易倒伏等不良农艺性状均不利于创制的种质在
育种工作中应用。因此，选育含有目标性状的染色
体小片段渗入系显的尤为重要。小片段渗入发生
的原因可能是早代偃麦草染色体较多并呈单价体
时通过部分同源染色体重组而发生染色体片段的
交换，也可能是由于减数分裂时，单价体错分裂形
成的(Shi et al., 2008)。CH5383是畅志坚研究员通
过普通小麦和中间偃麦草八倍体小偃麦杂交和回
交选育成的中间偃麦草小片段DNA渗入系。抗性
鉴定表明CH5383对条锈病的抗性可能来源于中
间偃麦草。
Jiang和Gill(1994)认为基因组原位杂交(GISH)
是检测小麦背景中外源物质的一种直接有效的方
法，但 Lukaszewski等(2005)发现如果外源片段较
小，GISH分析则检测不到DNA小片段渗入的存
在。利用FISH技术可识别小麦染色体、进行染色
体定位、基因组结构和进化研究工作。Pedersen和
Langridge(1997)用pHvg38和pAs1两个探针进行双
色FISH分析，识别了所有的小麦染色体。本实验，
用中间偃麦草DNA做探针对 CH5383进行GISH
分析，未观察到外源信号。进一步用GAA重复序
列做探针进行FISH分析，CH5383的染色体 3B长
臂端部和短臂中间区段、2B染色体长臂与中国春
相比均有与明显的杂交信号，说明本材料在上述区
段可能有外源DNA片段渗入或者发生转座的重复
序列。但是由于 pHvG38探针不能识别小麦染色
体1A、3D、4D、5D和6D，此5条染色体与中国春相
比是否有其他变化，仍需进一步研究确定。本实验
利用PLUG引物TNAC1383将中间偃麦草DNA渗
入片段定位到 3B染色体长臂端部。CH5383细胞
学结构稳定，染色体数目为 42条，对小麦条锈菌
CYR32免疫，可能是一个小麦-中间偃麦草DNA小
片段渗入系，其中间偃麦草DNA渗入片段位于3B
染色体端部 0.81~1.00区段。FISH分析CH5383染
色体3B和2B上均有杂交有信号，而利用TNAC标
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
TNAC1567 TNAC1782 TANC1829 TNAC1383 TANC1183
图 2 5对TNAC引物PCR扩增产物电泳
Figure 2 PCR amplification products of 5 pairs of TNAC
primers
1：CH5383；2：中国春
1: CH5383; 2: Chinese Spring
图 3 引物TNAC1383的PCR扩增产物电泳
Figure 3 PCR amplification patterns of the primer
TNAC1383
M：分子量标准；1：拟鹅冠草；2：十倍体长穗偃麦草；3：二倍
体长穗偃麦草；4：中间偃麦草；5：二倍体簇毛麦；6：四倍体
簇毛麦；7：CH5383；8：中国春；*：特异扩增条带
M: DNA molecular weight; 1: Pseudoroegneria spicata; 2: Thi⁃
nopyrum ponticm; 3: T. elongatum; 4: T. intermedium; 5: Dasy⁃
pyrum breviaristatum; 6: D. breviaristatum; 7: CH5383; 8: Chi-
nese Spring; *: The specific amplification bands
M 1 2 3 4 5 6 7 8
1200
800
bp
D
B
A
844
记只在染色体 3BL端部检测到中间偃麦草外源
DNA片段，CH5383除染色体3BL这一区段有中间
偃麦草DNA渗入片段外，其他染色体区段是否存
在 DNA渗入仍不明确，也不清楚已检测到的
CH5383中所包含的DNA渗入片段具体来自于中
间偃麦草的哪组染色体，这些均需今后继续研究。
4 结论
本研究通过染色体原位杂交技术，结合分子标
记方法，将染色体工程方法创新的小麦新种质
CH5385，进行了深入分析，发现抗病种质CH5383
中不存在中间偃麦草的大片段，但检测到染色质重
复序列和分子标记水平上的新变异，为进一步探索
外源遗传物质导入小麦，开展分子染色体工程育种
提供了基础资料。
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(责任编辑 任立刚)
小麦-中间偃麦草抗条锈病渗入系的分子细胞学鉴定
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