全 文 ：收稿日期:2015-04-27
基金项目:深圳市基础研究项目-中药丹参质量的化学模式识别研究资助项目(JYCJ20130402144215891)
作者简介:胡伟慧(1991-) ，女(汉族) ，山东菏泽人，硕士研究生，E-mail 1142212683@ 99． com;* 通讯作者:王铁杰
(1965-) ，女(汉族) ，辽宁铁岭人，教授，博士，主要从事药品质量控制，中药质量评价及疗效物质基础的研究，Tel．
0775-26031728，E-mail wangtj88@ 163． com。
文章编号:1006-2858(2016)02-0140-04 DOI:10． 14066 / j． cnki． cn21-1349 /r． 2016． 02． 009
甘西鼠尾草对缺氧 /复氧 H9c2 大鼠
心肌细胞的保护作用
胡伟慧1，金一宝2，3，韩东岐2，3，江 坤2，3，郭兴杰1，王铁杰1，2，3*
(1. 沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016;2. 深圳市药品检验所，广东 深圳 518057;
3. 深圳药品质量标准研究重点实验室，广东 深圳 518057)
摘要:目的 探究甘西鼠尾草对培养 H9c2 大鼠心肌细胞缺氧 /复氧损伤的保护作用及机制。方法
采用体外细胞培养方法培养乳鼠心肌细胞，建立缺氧 /复氧损伤心肌细胞模型，用甘西鼠尾草进行
细胞给药，干预细胞生长过程。将培养的 H9c2 大鼠心肌细胞随机分为 6 组，分别为缺氧 /复氧模
型组(hypoxia / reoxygenation，H/Ｒ组) ;正常对照组(control，C组) ;缺氧 /复氧模型 +维拉帕米(ver-
apamil)阳性对照组(H/Ｒ + V 组) ;缺氧 /复氧模型 +甘西鼠尾草低、中和高剂量(0. 01、0. 1 和 1. 0
mg·L －1)干预组(H/Ｒ + L、M、H组)。使用噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium，MTT)法测定细胞存活
率;收集所培养的细胞上清液测定丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量和乳酸脱氢酶(lactate de-
hydrogenase，LDH)的活性;使用荧光酶标仪，测定能够反映细胞内活性氧(reactive oxygen species，
ＲOS)水平高低的荧光吸光度值。结果 甘西鼠尾草可明显提高心肌细胞存活率，有效减少细胞内
LDH漏出量和胞浆内 MDA的含量，并降低细胞内 ＲOS水平。结论 甘西鼠尾草对缺氧 /复氧损伤
心肌细胞具有显著的保护作用，其作用机制可能与其增强细胞清除氧自由基能力、减少脂质过氧
化物的产生有关。
关键词:甘西鼠尾草;H9c2 大鼠心肌细胞;缺氧 /复氧
中图分类号:Ｒ 917 文献标志码:A
甘西鼠尾草 Salvia przewalskii 为唇形科鼠尾
草属植物，主要产自我国甘肃、四川、云南和西藏
等地，又名紫丹参、秦红、甘肃丹参或大紫丹参。
甘西鼠尾草作为我国传统常用中药丹参 Salvia
miltiorrhiza Bunge 的同属植物，已成为区域性药
材，在我国西北、西南等地区其作为丹参的优选替
代品广泛使用，药用历史久远。甘西鼠尾草中含
有与丹参相同的丹参酮 I、丹参酮 IIA、隐丹参酮、
迷迭香酸和紫草酸等多种酚酸类和丹参酮类活性
成分，具有抗人类免疫缺陷病毒(human immunod-
eficiency virus，HIV)活性、抗氧化、抑制超氧自由
基、抗炎和保护心肌缺血及心肌缺血再灌注损伤
等多种药理作用［1 － 3］。近年来对丹参具有保护大
鼠缺血再灌注损伤药理作用的研究报道较
多［4 － 7］，但对其同科同属植物甘西鼠尾草的抗心
肌缺血再灌注损伤药理作用的研究报道却较少。
作者采用 H9c2 大鼠心肌细胞建立大鼠缺氧 /复
氧损伤模型，模拟临床心肌缺血再灌注损伤，并用
甘西鼠尾草直接给药细胞，旨在探究甘西鼠尾草
对缺氧 /复氧损伤心肌细胞的保护作用及其作用
机制。
1 仪器与材料
BPN-150CＲH CO2 培养箱(苏州市贝茵医疗
器械有限公司) ，荧光倒置显微镜(日本 Olympus
公司) ，iMark酶标仪(美国 BIO-ＲAD 公司) ，Flex-
Station 3 荧光酶标仪(美国分子仪器公司) ，微孔
板离心机(美国 Thecmo Fisher Scientific 公司) ，
32Ｒ离心机(德国 Hettlch 公司) ，微量振荡器(德
国 Kylin-Bell Lab Instument公司)。
Gibco高糖培养基(dulbecco s modified eagle
medium，DMEM)、Gibco 无糖培养基、Gibco 胎牛
血清(fatal bovine serun，FBS)、MTT、胰蛋白酶、
PBS、LDH 细胞毒性检测试剂盒、ＲOS 检测试剂
第 33 卷 第 2 期
2 0 1 6 年 2 月
沈 阳 药 科 大 学 学 报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol. 33 No. 2
Feb． 2016 p. 140
盒、Ca2 +检测试剂盒和脂质氧化检测试剂盒(碧
云天生物技术研究所) ，其余试剂均为市售
分析纯。
H9c2 大鼠心肌细胞，购自中国科学院
细胞库。
2 方法与结果
2. 1 大鼠心肌细胞的培养
于 CO2 培养箱内常规培养 H9c2 大鼠心肌细
胞一定时间后，将其接种至不同培养板中，用含体
积分数 10% FBS 的高糖 DMEM 培养基培养，使
所培养的 H9c2 大鼠心肌细胞完全贴壁。
2. 2 缺氧 /复氧损伤模型的建立
待 H9c2 大鼠心肌细胞完全贴壁后，弃去其
细胞培养液，每孔加入 100 μL 的缺氧液(不含
FBS的无糖 DMEM 培养基) ，再将细胞培养板转
移至自制密闭缺氧盒中，持续通氮气 10 min 以除
尽盒中残余的氧气，夹紧进气管和出气管，再将缺
氧后装有细胞培养板的密闭缺氧盒放置于 CO2
培养箱中培养 3 h，此培养过程即为 H9c2 大鼠心
肌细胞的缺氧过程。缺氧培养 3 h 结束后，除去
细胞缺氧液，每孔加入 100 μL 含有体积分数
10% FBS的高糖 DMEM 培养基，将细胞培养板置
于 CO2 培养箱中继续培养，培养过程为 H9c2 大
鼠心肌细胞的复氧过程。
2. 3 分组与给药
将 H9c2 大鼠心肌细胞分成 6 组，分别为缺
氧 /复氧模型组(H/Ｒ组)、正常对照组(C 组)、缺
氧 /复氧模型 +维拉帕米(verapamil)阳性药物对
照组(H/Ｒ + V组)、缺氧 /复氧模型 +甘西鼠尾草
甘西鼠尾草低、中和高剂量 (0. 01、0. 1 和
1. 0 mg·L －1)药物干预组(H/Ｒ + L、M、H 组)［8］。
首先用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶
解药物，并用含体积分数 10% FBS的高糖 DMEM
培养基进行稀释，制成质量浓度分别为 0. 01、0. 1
和 1. 0 mg·L －1含甘西鼠尾草给药溶液的培养基，
即不同质量浓度的含药培养基。培养模型组细
胞所用培养基不含甘西鼠尾草药物，仅加入同
等剂量的 DMSO。给药组细胞与模型组细胞都
进行缺氧复氧损伤处理，给药组细胞在复氧过
程中使用含有不同质量浓度的西鼠尾草给药
溶液的培养基培养 48 h，使药物发挥药效作
用，对照组细胞不进行缺氧复氧损伤处理，仅
使用含体积分数 10% FBS 的高糖 DMEM 培养
基培养细胞，各组 H9c2 大鼠心肌细胞均置于
CO2 培养箱培养
［9］。
2. 3 观察指标及检测方法
2. 3. 1 H9c2 大鼠心肌细胞存活率测定
将 H9c2 大鼠心肌细胞种于 96 孔板中，接种
密度约为每孔 8 × 103个，经缺氧复氧及不同质量
浓度的甘西鼠尾草提取液干预后，每孔加入适量
质量分数为 0. 5% 的噻唑蓝溶液，继续培养 4 h。
弃去细胞培养基，每孔加入二甲基亚砜 100 μL，
置于微量振荡器，振荡 10 min，使所产生的结晶物
充分溶解。使用酶联免疫检测仪，于 490 nm波长
处测定各孔光吸收值(A) ，计算细胞存活率。细
胞存活率 = A试验组 /A对照组 × 100%。
2. 3. 2 H9c2 大鼠心肌细胞内乳酸脱氢酶活性
测定
除正常对照组细胞外，其余各组细胞均进行
缺氧 /复氧损伤处理，于 CO2 培养箱培养 48 h 后，
吸取细胞培养液，按照乳酸脱氢酶(lactate dehy-
drogenase，LDH)细胞毒性检测试剂盒说明书进行
操作、检测。
2. 3. 3 H9c2 大鼠心肌细胞内丙二醛含量测定
除正常对照组细胞外，其余各组细胞均进行
缺氧 /复氧损伤处理，于 CO2 培养箱培养 48 h 后，
吸取细胞培养液，采用硫代巴比妥酸法测定(ma-
londia ldehyde，MDA)含量，按照脂质氧化检测试
剂盒说明书进行操作、检测。
2. 3. 4 H9c2 大鼠心肌细胞内 ＲOS水平测定
除正常对照组细胞外，其余各组细胞均进行
缺氧 /复氧损伤处理，于 CO2 培养箱培养 48 h 后，
吸取细胞培养液，按照活性氧检测试剂盒说明书
进行操作、检测。
2. 4 结果
2. 4. 1 不同质量浓度的甘西鼠尾草对缺氧 /复氧
损伤 H9c2 大鼠心肌细胞活力的影响
与正常对照组相比较，经缺氧 /复氧处理后的
模型组心肌细胞存活率显著降低(P ＜ 0. 01) ，而
缺氧 /复氧处理后的各给药组心肌细胞存活率明
显高于模型组(P ＜ 0. 01)。说明甘西鼠尾草可有
效保护缺氧 /复氧对 H9c2 大鼠心肌细胞的损伤，
并呈现质量浓度依赖性，随着给药质量浓度的升
高，其保护作用更加显著结果见表 1。
2. 4. 2 不同质量浓度的甘西鼠尾草对缺氧/复氧损
伤 H9c2大鼠心肌细胞内乳酸脱氢酶活性的影响
与正常对照组相比较，经缺氧 /复氧处理后的
141第 2 期 胡伟慧等:甘西鼠尾草对缺氧 /复氧 H9c2 大鼠心肌细胞的保护作用
Table 1 The effect of Salvia przewalskii on the activity of
the myocardial cells injured by hypoxia /reoxygenation
(珔x ± s，n =6)
表 1 甘西鼠尾草对缺氧 /复氧损伤 H9c2 大鼠心肌细胞
活性的影响(珔x ± s，n =6)
Group Dose /(mg·L －1) Cell survival rate /%
Control — 100. 00 ± 0. 00
H /Ｒ — 39. 23 ± 7. 82a
H /Ｒ + L 0. 01 75. 60 ± 4. 12b
H /Ｒ + M 0. 1 86. 62 ± 3. 93c
H /Ｒ + H 1 91. 25 ± 3. 76c
H /Ｒ + V 1. 8 84. 69 ± 3. 76c
a—P ＜ 0. 01 vs control;b—P ＜ 0. 05;c—P ＜ 0. 01 vs
H /Ｒ
模型组心肌细胞内 LDH 活性显著升高(P ＜
0. 01) ，而缺氧 /复氧处理后各给药组细胞培养介
质中的 LDH水平明显低于模型组(P ＜ 0. 01) ，说
明甘西鼠尾草对缺氧 /复氧引起的 H9c2 大鼠心
肌细胞的损伤具有显著保护作用，且呈现浓度依
赖性，随着给药质量浓度的升高，保护作用更加明
显，结果见表 2。
Table 2 The effect of Salvia przewalskii on the activity of
LDH in the myocardial cells injured by hypoxia /reoxy-
genation(珔x ± s，n =6)
表 2 甘西鼠尾草对缺氧 /复氧损伤 H9c2 大鼠心肌细胞
内乳酸脱氢酶活性的影响(珔x ± s，n =6)
Group Dose /(mg·L －1) LDH/(U·L －1)
Control — 514. 81 ± 25. 64
H /Ｒ — 1078. 53 ± 19. 68a
H /Ｒ + L 0. 01 896. 26 ± 18. 23b
H /Ｒ + M 0. 1 706. 44 ± 20. 42c
H /Ｒ + H 1 596. 43 ± 21. 29c
H /Ｒ + V 1. 8 622. 31 ± 26. 83c
a—P ＜ 0. 01 vs control;b—P ＜ 0. 05;c—P ＜ 0. 01 vs
H /Ｒ
2. 4. 3 不同质量浓度的甘西鼠尾草对缺氧 /复氧
损伤 H9c2 大鼠心肌细胞内丙二醛含量的影响
与正常对照组相比较，经缺氧 /复氧处理后的
模型组心肌细胞内 MDA 含量显著升高(P ＜
0. 01) ，而缺氧 /复氧处理后的各给药组心肌细胞
内 MDA的含量明显低于模型组(P ＜ 0. 01) ，说明
甘西鼠尾草对缺氧 /复氧引起的 H9c2 心肌细胞
的氧化损伤具有显著保护作用，且呈现浓度依赖
性，随着给药质量浓度的升高，保护作用更加明显
结果见表 3。
Table 3 The effect of Salvia przewalskii on the content of
MDA in the myocardial cells injured by hypoxia /reoxy-
genation(珔x ± s，n =6)
表 3 甘西鼠尾草对缺氧 /复氧损伤 H9c2 大鼠心肌细胞
内丙二醛含量的影响(珔x ± s，n =6)
Group Dose /(mg·L －1) MDA/(mmol·g －1)
Control — 2. 77 ± 0. 12
H /Ｒ — 6. 91 ± 0. 09a
H /Ｒ + L 0. 01 6. 09 ± 0. 11b
H /Ｒ + M 0. 1 4. 53 ± 0. 18c
H /Ｒ + H 1 3. 46 ± 0. 15c
H /Ｒ + V 1. 8 4. 47 ± 0. 13c
a—P ＜ 0. 01 vs control;b—P ＜ 0. 05;c—P ＜ 0. 01 vs
H /Ｒ
2. 4. 4 不同质量浓度的甘西鼠尾草对缺氧 /复氧
损伤 H9c2 大鼠心肌细胞内 ＲOS水平的影响
吸光度(Absorbance，A)的大小可以反映细胞
内活性氧(reactive oxygen species，ＲOS)水平的高
低。与正常对照组相比，经缺氧 /复氧处理后的模
型组细胞内的 ＲOS水平显著升高(P ＜ 0. 01) ，而
缺氧 /复氧处理后各给药组心肌细胞内 ＲOS 水平
明显低于模型组(P ＜ 0. 01) ，说明甘西鼠尾草对
缺氧 /复氧引起的 H9c2 心肌细胞的氧化损伤具
有显著保护作用，且具有一定的质量浓度依赖性，
随着给药质量浓度的升高，保护作用更加明显结
果见表 4。
Table 4 The effect of Salvia przewalskii onthe content of
ＲOS in the myocardial cells injured by hypoxia /reoxy-
genation(珔x ± s，n =6)
表 4 甘西鼠尾草对缺氧 /复氧损伤 H9c2 大鼠心肌细胞
内活性氧含量的影响(珔x ± s，n =6)
Group Dose /(mg·L －1) A
Control — 20. 39 ± 3. 98
H /Ｒ — 48. 85 ± 4. 76a
H /Ｒ + L 0. 01 42. 56 ± 3. 43b
H /Ｒ + M 0. 1 30. 78 ± 4. 01c
H /Ｒ + H 1 23. 94 ± 4. 35c
H /Ｒ + V 1. 8 29. 31 ± 4. 27c
a—P ＜ 0. 01 vs control;b—P ＜ 0. 05;c—P ＜ 0. 01 vs
H /Ｒ
3 讨论
a．心脏作为需氧器官，在机体充分供氧情况
下，主要通过有氧氧化途径，氧化多种能源物质，
产生大量高能磷酸化合物三磷酸腺苷(adenosine
triphosphate，ATP) ，为机体的正常生命活动提供
241 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 33 卷
所需能量。但当心肌缺血缺氧时，机体代谢活动
紊乱、线粒体功能异常、心脏供应能量匮乏，且其
收缩和舒张功能明显降低，形态结构发生异常变
化，甚至心肌细胞突变坏死。
b．本试验作者选用原代培养的 H9c2 大鼠心
肌细胞为研究对象，首次直接从细胞水平建立缺
氧 /复氧模型，模拟在体心肌缺血 /再灌注(ische-
mia / reperfusion，I /Ｒ)损伤，从而对甘西鼠尾草抗
I /Ｒ的保护作用及其作用机制进行研究。实验结
果显示，与正常对照组比较，模型组心肌细胞经缺
氧 /复氧处理后，细胞存活率显著降低，培养基质
中 LDH活性增强，胞浆内 MDA含量增高、ＲOS水
平升高，说明经缺氧 /复氧处理后，所培养的心肌
细胞可受到严重损伤;而加入含药培养基的心肌
细胞，培养一段时间后，与模型组细胞相比，细胞
存活率升高，LDH活性减弱，MDA 含量降低，ＲOS
水平也显著降低。结果表明甘西鼠尾草可以减轻
缺氧 /复氧所引起的心肌细胞凋亡，对缺氧 /复氧
损伤心肌细胞具有显著保护作用。
c．心肌细胞缺氧后引起机体能量代谢障碍、
心肌细胞膜破裂、膜通透性增加细胞和膜外钙离
子流向细胞内造成细胞内钙离子超载，而细胞内
LDH漏出量增加且活性升高［10 － 11］。在正常情况
下，机体可经单电子还原所吸入的部分氧，生成适
量的、但对机体无任何影响的超氧阴离子自由基
(O2 －)、羟自由基(OH －)等活性氧;而在缺氧再
复氧过程中，爆发性产生并急剧堆积的氧自由基可
引起细胞损伤，与生物膜不饱和酸反应，造成细胞膜
脂质过氧化，且生成脂质过氧化产物MDA，所以培养
基质中MDA含量的高低又可反应心肌细胞受自由
基攻击损伤的严重程度［12］。
d．噻唑蓝是一种活性染料，其在活细胞内，可
被还原为蓝紫色的结晶物甲瓒，而死细胞则无此
功能，所以试验测得 OD 值的高低可反应所培养
的心肌细胞存活率的高低，即心肌细胞能够为机
体提供直接能源物质 ATP 能力的大小。本试验
结果显示，甘西鼠尾草可显著减轻缺氧 /复氧所造
成的心肌细胞损伤，降低细胞膜通透性和 LDH活
性，减少脂质过氧化反应进而降低细胞内 MDA
的含量，由此推测，甘西鼠尾草可能通过保护细胞
膜完整性，减少基质中 LDH 漏出量和降低 LDH
活性，减少细胞内氧自由基堆积并增强机体对氧
自由基的清除能力，进而减轻细胞膜脂质过氧化损
伤，从而发挥对心肌细胞H/Ｒ损伤的保护作用。
4 结论
本研究作者首次以 H9c2 大鼠心肌细胞为对
象，进一步证实甘西鼠尾草对心肌细胞缺氧 /复氧
损伤具有明显的保护作用，可以提高缺氧 /复氧损
伤心肌细胞的存活率，减少心肌细胞凋亡，减轻细
胞膜的损伤和脂质过氧化程度，上述结果为甘西鼠
尾草的临床应用及推广提供了进一步的实验依据，
且对其药物作用机制的探讨也具有一定参考作用。
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(下转至第 164 页)
341第 2 期 胡伟慧等:甘西鼠尾草对缺氧 /复氧 H9c2 大鼠心肌细胞的保护作用
Then the gene lywA was knocked out by homologous recombination and the result was verified by
fermentation． Ｒesults Compounds 1 and 2 were identified as two precursors of ornithine lipids，N-α-
3-hydroxy palmitoyl ornithine and N-α-3-hydroxy heptadecanealkanoyl ornithine respectively，and they were
not found in the fermentation broth of the lywA deletion mutants． Conclusions The gene lywA is required for
ornithine lipids biosynthesis in Streptomyces parvus．
Key words:Streptomyces parvus;ornithine lipids;structure identification;

gene
(上接第 143 页)
Protective effects of Salvia przewalskii on the H9c2
cardiomyocytes injured by hypoxia / reoxygenation
HU Wei-hui1，JIN Yi-bao2，3，HAN Dong-qi2，3，JIANG Kun2，3，GUO Xing-jie1，WANG Tie-
jie1，2，3*
(1． School of Pharmacy，Shengyang Pharmaceutical University，Shengyang 110016，China;2． Shenzhen Insti-
tute for Drug Control，Shenzhen 518057，China;3． Shenzhen Key Laboratory of Drug Quality Standard Ｒe-
search，Shenzhen 518057，China)
Abstract:Objective To study the protective effects and the mechanism of Salvia przewalskii on cultured
H9c2 rat cardiomyocytes treated by hypoxia / reoxygenation． Methods the hypoxia / reoxygen(H/Ｒ)injury
cardiomyocytes model was established in H9c2 cell strain with or without Salvia przewalskii treated． Cultured
H9c2 rat cardiomyocytes were randomly divided into six groups:control group(C group) ;H/Ｒ group;
H/Ｒ + Verapamil(H/Ｒ + V 组)group;H/Ｒ + Salvia przewalskii low concentration group(0. 01 mg·L －1) ，
H/Ｒ + Salvia przewalskii middle concentration group(0. 1 mg·L －1) ，H/Ｒ + Salvia przewalskii high concen-
tration group(1. 0 mg·L －1)． Cell survival rate was determined using the 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-
diphenyltetrazolium bromide(MTT)assay． The activity of lactate dehydrogenase(LDH)and the content of
Malondialdehyde(MDA)was measured respectively in cellular supemate． The fluorescence absorbance
values reflecting the level of intracellular reactive oxygen species(ＲOS)was measured by using Fluorescence
microplate reader． Ｒesults The groups being treated with Salvia przewalskii could effectively increase the cell
survival rate and decrease the release of LDH． Moreover，they could decrease the production of MDA and the
level of ＲOS． Conclusions It is suggested that Salvia przewalskii has a protective effect on H9c2 rat
cardiomyocyte treated by H /Ｒ injury． The mechanisms of the protective effects of Salvia przewalskii are
related to enhance the capability of the cell clearing the oxygen free radical and to decrease the production of
lipid peroxidation
Key words:Salvia przewalskii;H9c2 rat cardiomyocytes;hypoxia / reoxygenation
461 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 33 卷