全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(3): 520−525 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10A104); 国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2004CB117200)
作者简介: 王凯(1980−), 男, 在读博士生。
*
通讯作者(Corresponding author): 张增艳(1963−), 博士, 研究员, 博士生导师, 主要从事小麦抗病分子生物学与分子育种研究。Tel:
010-68918781; E-mail:zyzh-68@163.com
Received(收稿日期): 2007-06-05; Accepted(接受日期): 2007-09-18.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00520
中间偃麦草 SGT1 基因的克隆及其抗病功能的分析
王 凯 1 杜丽璞 1 张增艳 1,* 廖 勇 1 徐惠君 1 姚乌兰 1 杨 昆 1,2 邵艳军 2
辛志勇 1
(1 中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部作物遗传育种重点开放实验室, 北京 100081;
2 河北农业大学生命科学学院, 河北保定 071001)
摘 要: 为了探索中间偃麦草 SGT1基因在小麦抗病反应中的应用潜力, 采用 RT-PCR和 RACE方法克隆出中间偃麦
草 SGT1基因, 命名为 TiSGT1。该基因编码蛋白具有 SGT1蛋白典型的功能域结构, 与大麦 SGT1序列高度同源。通
过基因重组技术构建了 TiSGT1 的高效组成型表达载体, 通过基因枪法将该载体转化到小麦品种扬麦 12 基因组中。
对转基因植株 PCR、Southern杂交与 RT-PCR分析表明, TiSGT1基因可在 T0、T1和 T2代转基因小麦中遗传和表达。
黄矮病、白粉病抗性鉴定结果表明, SGT1的超量表达可以提高小麦对黄矮病、白粉病的抗性, TiSGT1可以作为小麦
广谱抗病性改良的潜在基因资源。
关键词: 中间偃麦草; 白粉病; SGT1; 基因克隆; 小麦; 抗病性鉴定
Isolation and Preliminarily Functional Analysis of SGT1 Gene of Thino-
pyrum intermedium
WANG Kai1, DU Li-Pu1, ZHANG Zeng-Yan1,*, LIAO Yong1, XU Hui-Jun1, YAO Wu-Lan1, YANG Kun1,2,
SHAO Yan-Jun2, and XIN Zhi-Yong1
(1 National Key Facility of Crop Genetic Resources and Gene Improvement / Key Laboratory of Crop Genetic and Breeding, Ministry of Agriculture /
Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2 College of Life Sciences, Hebei Agricultural University,
Baoding 071001, Hebei, China)
Abstract: To understand the role of SGT1 gene in wheat (Triticum aestivum L.) diseases resistance, we used RT-PCR and RACE
methods to isolate SGT1 genes from Thinopyrum intermedium. The SGT1 was named TiSGT1. The deduced TiSGT1 protein pos-
sesses the typical domains of known SGT1 proteins and shows highly homology with barley SGT1 protein. A highly efficiency
expression vector of TiSGT1 was constructed by genetic recombination, and transformed into the wheat cultivar ‘Yangmai 12’ by
biolistic particle method. Transformation plants were analyzed by PCR, Southern hybridization, and RT-PCR methods. The results
showed that the TiSGT1 gene could be inherited from T0 to T2 generations, and could be expressed. The results of disease resis-
tance test indicated that the over-expression of SGT1 in the transgenic wheat enhanced resistance to barley yellow dwarf virus and
powdery mildew, and TiSGT1 could be used as a potential gene resource for improving broad spectrum resistance of wheat.
Keywords: Thinopyrum intermedium; Powdery mildew; SGT1; Gene cloning; Wheat; Disease resistance test
小麦生长过程中受到许多不同病害的威胁, 如小麦
白粉病、赤霉病、条锈病和黄矮病等, 往往给小麦生产带
来巨大损失, 威胁粮食生产安全。选育和推广抗病小麦新
品种是保证小麦稳产和高产的经济有效途径。由于小麦基
因组庞大, 重复序列多, 使小麦抗病(resistance, R)基因克
隆进展缓慢, 目前仅有 3个被克隆出来[1]。小麦及其野生
近缘植物的多个 R 基因被用于小麦抗病性改良, 然而这
些 R 基因与病原菌致毒基因之间互作方式大多遵循“基因
对基因”假说[2], 存在抗性易“丧失”等潜在危险。因此, 研
究小麦及其近缘物种的抗病反应机制、发掘更多可用于抗
病育种的基因资源非常重要。
对模式植物抗病机制的研究表明, 植物 R 基因产物
第 3期 王 凯等: 中间偃麦草 SGT1基因的克隆及其抗病功能的分析1 521


可以与相应病原致毒基因产物直接或间接作用 , 引发后
续的防御反应[3], 包括局部活性氧积累、细胞程序化死亡
和局部发生超敏反应等[3-4]。这些反应一方面限制了病原
菌在侵染点的生长和进一步扩展 , 同时通过向侵染点附
近组织释放调节防御信号的分子 , 诱发整个植株的防卫
基因表达, 产生系统获得性抗性。近年研究发现了一些对
R基因介导的抗病反应至关重要的基因, SGT1 (suppressor
of the G2 allele of skp1)就是其中之一。SGT1最早是在酵
母中发现的, 是与发育相关的重要基因[5]。通过基因沉默
试验证明 , 多种植物的不同抗病反应都需要 SGT1 参
与[6-11], 推测 SGT1 可能位于不同 R 基因介导抗病信号途
径的集中点上[12]。植物 SGT1蛋白具有 5个结构域, 包括
位于 N端重复结构(TPR)、可变区(VR1和 VR2)、CS区和
位于 C端 SGS区[6], 其中 TPR、CS区和 SGS区对于 SGT1
蛋白发挥功能非常重要。SGT1蛋白以多种方式参与调控
植物抗病反应, 如调节 R 蛋白复合体的积累水平[8], 调控
植物的病原侵染点的超敏反应 , 还与非宿主抗性密切相
关[14]。目前推测 SGT1蛋白参与调控植物抗病反应的分子
机制: 一是在植株无病原诱导情况下, 与 RAR1和 HSP90
共同调节 R蛋白识别复合体(R protein recognition complex)
的结构, 使 R 蛋白识别复合体在植株体内保持一定的积
累水平[8], 一些基因沉默试验结果证明了这一推测; 二是
在 R 蛋白识别复合体识别病原无毒 (Avr)因子后 , 同
HSP90或 RAR1一起调节 R蛋白复合体的构象, 可能由此
激发抗病反应信号; 三是降解植物防御反应的负向调节
因子, 促进植物防御反应的进行[12]。
中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)是多年生小麦
野生近缘植物, 具小麦改良的许多重要有益性状, 包括免
疫或高抗小麦白粉病、条锈病、叶锈病、秆锈病、黄矮病、
赤霉病等 , 其中一些抗病基因已被广泛应用于小麦抗病
性改良。但有关中间偃麦草 SGT1基因分离及其在抗病反
应中的作用至今未见报道。本研究旨在从中间偃麦草中克
隆出 SGT1基因全长开放阅读框(open reading frame, ORF)
序列, 创造和鉴定 SGT1 基因超量表达的转基因小麦植株,
并对这些转基因小麦进行抗病性鉴定, 研究在小麦中超量
表达的 SGT1 基因对小麦黄矮病、白粉病抗性的影响, 探索
中间偃麦草 SGT1基因在小麦抗病分子育种中的应用潜力。
1 材料与方法
1.1 试验材料
中间偃麦草 Z1146 由中国农业科学院作物科学研究
所李立会研究员惠赠, 由本组保存。小麦品种扬麦 12 由
江苏里下河地区农科所提供。带 BYDV-GAV 病毒株系的
蚜虫由中国农业科学院植物保护研究所病毒组提供。小麦
白粉病菌(Blumeria graminis f. sp. tritici)15号生理小种由
中国农业科学院作物科学研究所朱振东研究员提供 , 小
麦白粉病菌混合菌株采自本组温室感病小麦叶片。单子叶
高效组成性表达载体 pAHC25由本实验室保存。
1.2 中间偃麦草 SGT1基因的克隆
根据其他植物已克隆 SGT1 基因的保守域设计引物
(sgtF: 5′-GACCTCGACGCAGACATG-3′, sgtR: 5′-CTC
(A/C)AGCTTATCCCAGTC-3′)。采用 Trizol 试剂(天为时
代公司)提取接种白粉病 48 h的中间偃麦草叶片 RNA, 利
用 TaKaRa 公司的反转录试剂盒将纯化的 RNA 反转录合
成第一链 cDNA, 以该 cDNA为模板, 用 sgtF与 sgtR扩增
出中间偃麦草 SGT1基因片段, 然后以此片段设计 3′RACE
和 5′RACE引物, 按照 Invitrogen公司 3′RACE和 5′RACE
试剂盒的方法分离该基因两端序列 , 将这些序列进行拼
接, 再设计引物从 cDNA中扩增中间偃麦草 SGT1基因全
长 ORF序列。
同时采用另一种策略克隆中间偃麦草 SGT1基因, 即
搜索 NCBI 与 GRINGENE 数据库中 SGT1 基因同源的小
麦表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)序列, 电子
拼接这些 ESTs得到包括完整 ORF的 SGT1序列, 设计引物
从上述 cDNA中扩增中间偃麦草 SGT1基因全长 ORF序列。
1.3 植物表达载体的构建
利用 PCR方法在中间偃麦草 SGT1基因 ORF序列 5′
端加上 Sma I、3′端加上 Sac I酶切位点, 连接到 pMD18-T
载体上构建中间载体 pTSGT1。用 Sma I和 Sac I双酶切
pTSGT1 和 pAHC25, 然后用 T4 连接酶将中间偃麦草
SGT1 的 ORF 连接到双酶切后的 pAHC25 载体上, 即将
pAHC25中 GUS基因替换为中间偃麦草 SGT1基因的全长
ORF序列, 建成中间偃麦草 SGT1 转基因载体 pUSGT1。
对 pUSGT1进行 Sma I和 Sac I双酶切, 并进行测序分析,
鉴定其正确性。该载体中间偃麦草 SGT1 基因表达受
Ubiqutin启动子控制, 该载体具有 1个受 Ubiqutin启动子
控制的 Bar 基因表达盒, 可为后续 Bialaphos 筛选转化再
生植株提供抗性。载体结构如图 1。
1.4 基因枪介导法转化小麦和筛选、分化与植株再生
以扬麦 12 授粉 14 d 左右的幼胚为外植体, 接种于
SD2培养基, 26℃暗培养诱导愈伤组织。采用基因枪轰击
的愈伤组织[15-17], 经恢复培养及 2~3 次分化生长和 Bia-
laphos筛选, 将再生植株转移到壮苗培养基(1/2 MS＋0. 2
mg L−1 NAA＋0.5 mg L−1 MET)上壮苗, 把苗高 7~8 cm且
根系发达的转化苗移栽到花盆 , 在可控温室生长至三叶
期提取基因组 DNA。
1.5 转基因植株的分子检测
1.5.1 基因组 DNA PCR 检测 用改良的 SDS法[18]提取
基因组 DNA。根据 pAHC25 载体携带的 Bar 基因序列设
计一对检测 Bar 基因的特异引物(barF: 5′-AAGCACGG
TCAACTTCCGTA-3′, barR: 5′-GAAGTCCAGCTGCCA
GAAAC-3′), 扩增产物片段大小为 412 bp, 扩增程序为 94
℃预变性 5 min; 94℃ 1 min, 57℃ 1 min, 72℃ 1 min, 40
个循环; 72℃延伸 10 min。扩增产物在 1%琼脂糖胶上进
行检测。
522 作 物 学 报 第 34卷


图 1 载体 pAHC25、pTSGT1和 pUSGT1示意图
Fig. 1 Scheme of pAHC25, pTSGT1, and pUSGT1

1.5.2 Southern 杂交检测 用限制性内切酶 EcoR V消
化基因组 DNA (25~30 µg), 在 0.8%琼脂糖胶上电泳分离,
随后采用碱变性法将消化的 DNA转移至尼龙膜上。采用
TaKaRa公司的 Random Primer Labeling Kit 2.0试剂盒标
记探针, 预杂交、杂交方法参照文献[19]。
1.5.3 半定量 RT-PCR 分析 采用 Trizol试剂提取植株
叶片 RNA, 利用 TaKaRa公司的反转录试剂盒将 RNA反转
录合成第一链 cDNA, 以此为模板, 首先以 Actin 基因特
异引物 (ActF: 5′-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3′,
ActR: 5′-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3′)对各样本进行
扩增, 以使模版 cDNA 均一化, 然后用引物 sgtF 和 sgtR
进行半定量 RT-PCR表达分析。
1.6 抗病性鉴定
通过接种带 BYDV-GAV 株系的蚜虫接种 BYDV, 接
种 3 d后杀死蚜虫, 接种 30、45和 60 d调查黄矮病抗性。
采用活体摩擦结合抖落孢子的方法接种。接种 2 周
后进行苗期抗病性调查, 并于成株期调查成株期抗病性。
成株期的抗病分级按照国际小麦玉米改良中心和国家标
准 GB/T 1798.22-2000“农药田间药效试验标准(一)杀菌剂
防治禾谷类白粉病”分为 9级。
2 结果与分析
2.1 TiSGT1基因的克隆
从中间偃麦草叶片 cDNA中克隆出 SGT1基因的全长
ORF 序列, 且两种策略克隆出的 SGT1 基因全长 ORF 序
列一致。中间偃麦草 SGT1基因命名为 TiSGT1(NCBI注册
登录号为 EF534375)。TiSGT1基因推导产物为由 371个氨
基酸组成的蛋白 TiSGT1, 具有已克隆 SGT1 蛋白的典型
结构, 包括 TPR区、CS区、SGS区和两个 VR区(图 2)。
用 MEGA3.1软件分析 TiSGT1、大麦 SGT1(AAL33610)、

图 2 推导中间偃麦草 SGT1蛋白与大麦 SGT1蛋白同源性比较
Fig. 2 Alignment of deduced TiSGT1 protein sequence and HvSGT1 protein sequence
第 3期 王 凯等: 中间偃麦草 SGT1基因的克隆及其抗病功能的分析1 523



图 3 TiSGT1、HvSGT1、OsSGT1、NbSGT1、AtSGT1a和 AtSGT1b
氨基酸进化树分析
Fig. 3 Phylogentic tree analysis of amino acids of TiSGT1,
HvSGT1, OsSGT1, NbSGT1, AtSGT1a, and AtSGT1b
Hv: barley; Os: rice; Nb: tobacco; At: Arabidopsis

水稻 SGT1(AAF18438)、烟草 SGT1(AAW82048)、拟南芥
SGT1a (AAL33611)和 SGT1b(AAL33612)之间的同源性
(括号中为蛋白序列 NCBI登录号)。结果表明, TiSGT1与
HvSGT1同源性最高, 为 97.32%。
2.2 表达载体的构建
用 SmaI和 SacI两个限制性内切酶酶切、回收含酶切
位点的目的载体片段和 TiSGT1 基因片段、用 T4DNA 连
接酶连接, 将 TiSGT1全长 ORF序列替换 pAHC25中 GUS
基因。经测序分析后, 选出构建正确的 TiSGT1 单子叶表
达载体, 命名为 pUSGT1, 用于下一步基因枪转化。
2.3 转 TiSGT1基因植株的获得与分子检测
用包裹 pUSGT1载体的金粉微粒子弹轰击扬麦 12的
幼胚约 4 000个, 获得 T0代再生植株 201株, 利用 Bar基
因引物进行 PCR检测、筛选, 获得 PCR检测阳性(图 4-a)
的转基因植株 24株, 转化率为 0.60%。
对转基因 T1代 13个株系 93个单株进行 Bar基因的
PCR 分析, 检测到阳性植株 70 株(图 4-b), 证明 TiSGT1
基因已经从 T0代传递到 T1代, 在 T1代中转基因的分离比
符合 3∶1( χc2=0.0036<χ0.052)。对 T2代转基因植株进行 Bar
基因的 PCR检测结果表明, T1代转基因纯合株系的 T2代
植株中均检测到 Bar基因, T1代杂合株系的 T2代转基因植
株中 Bar基因检测的阳性与阴性比基本符合 3∶1 (图 4-c),
证明 TiSGT1 基因已经从 T1代传递到 T2代,可能以单拷贝
形式存在。
选取不同 T1 代株系中 PCR 检测阳性单株, 进行
TiSGT1 基因的 Southern 杂交分析。由于小麦基因组中含
有与 TiSGT1高度同源的 SGT1基因, 而Bar基因和 TiSGT1
基因共同存在于同一表达载体 pUSGT1上, 所以采用 Bar
基因片段作为 Southern 杂交探针。由于 Bar 基因探针序

图 4 转 TiSGT1基因小麦 T0 (a)、T1 (b)和 T2 (c)植株的 PCR检测及 T1植株的 Southern杂交
Fig. 4 PCR test of TiSGT1 transgenic T0 (a), T1 (b), and T2 (c), and Southern analysis of T1 plants (d) in wheat

列内部不含 EcoRV 酶切位点, 因此 Southern 杂交结果中
杂交带数可以表示外源 TiSGT1在转基因小麦植株基因组
中的拷贝数。Southern杂交结果表明, TiSGT1在 3个阳性
株系中的整合位点相似, 均以单拷贝存在(图 4-d), 与遗
传分析结果吻合。
半定量 RT-PCR 分析 T2代中 PCR 检测阳性的单株
SGT1基因表达情况。结果表明, 转基因阳性植株中 SGT1
转录水平明显高于未转基因的对照植株 (图 5)。
2.4 转基因植株的抗病性鉴定
PCR检测阳性的转 TiSGT1基因 T1代植株(13个株系
共 93 个单株)和未转基因植株, 同时接种携带 BYDV-GAV
株系的蚜虫和小麦白粉病菌 15号小种, 进行抗病性鉴定。
结果表明, 14 株转 TiSGT1 基因 T1代植株在全生育期免
疫、高抗黄矮病、白粉病, 而阴性对照扬麦 12 则感黄矮
病、白粉病。

图 5 转基因 T2代阳性植株的转录表达半定量分析
Fig. 5 Semi-quantitative RT-PCR result on expression level of
transgenic T2 plants
PT-PCR的特异引物为 SGT1和 Actin。1: 扬麦 12; 2~7: T2代转基因单株,
其中泳道 7为图 4-d中泳道 4所用材料的后代。
The specific primers for RT-PCR are SGT1 and Actin. 1: Yangmai 12; 2–7:
T2 individuals of transgenic plant, and the material in lane 7 is the progeny
of that in Fig. 4-d.
524 作 物 学 报 第 34卷

对 PCR检测阳性的转 TiSGT1基因 T2代植株接种病
毒 BYDV-GAV株系。结果表明, 其中有 96株高抗黄矮病,
阴性对照扬麦 12 感黄矮病; 接种小麦白粉病菌混合小种
鉴定的结果表明, 113 株转基因植株苗期抗白粉病、成株
期中抗(平均感病指数为 3级), 阴性对照扬麦 12苗期和成
株期均高感白粉病(成株期达 9级)。结合 RT-PCR分析结
果发现, 转 TiSGT1基因 T2代植株中 SGT1转录表达量高
的株系均表现出对黄矮病、白粉病抗性的提高 , 说明
SGT1超量表达的转基因小麦株系提高了对黄矮病、白粉
病的抗性。
3 讨论
近年来, 新的 RT-PCR、RACE、电子克隆技术和小
麦 EST 序列的快速发展, 为小麦及其近缘植物基因全长
cDNA 序列的分离克隆提供了便利条件。我们利用小麦
EST序列、采用 RT-PCR、RACE 与电子克隆技术两种策
略所克隆的 TiSGT1基因 ORF的序列一致, 说明在中间偃
麦草中 SGT1 是比较保守的。另外, TiSGT1 与小麦 SGT1
的 ORF相似性为 96.47%, 编码蛋白相似性为 96.29%, 二
者同源性较高, 所以小麦的 ESTs 可以用于设计、克隆中
间偃麦草中同源的信号调控基因 , 有利于进一步发掘中
间偃麦草中的有益基因资源。序列分析还发现, SGT1 蛋
白序列中各结构域之间的同源性存在较大差异 , 其中
SGS、TPR、CS结构域的同源性较高, 而可变区的同源性
最低, 这种同源性差异可能与它们对于 SGT1功能的重要
性有关。
本研究中采用 TiSGT1 同时存在于一个转基因载体
上的 bar基因进行转基因小麦中目标基因的分子检测, 其
主要原因, 一是小麦基因组中也有 SGT1 基因, 并且以三
拷贝形式存在[21], 小麦 SGT1基因的核酸序列与目标基因
(TiSGT1)核酸序列相似性高达 98%, 难以直接用 TiSGT1
的序列进行分子检测的结果准确判断 TiSGT1的转化和整
合到小麦基因组中的情况; 二是 TiSGT1、Bar基因同时存
在于一个转基因载体上, 二者相距仅 1.9 kb, 遗传分离可
能性极小 , 它们通过基因枪同时转入小麦的概率也非常
高, 所以可以用 Bar基因通过 PCR、Southern分析的结果
检测转基因的阳性率和在小麦基因组中整合情况 , 可靠
性应该比较高。
大量研究结果表明, 多种植物对真菌型、细菌型和病
毒型病原的不同抗病反应都需要 SGT1 参与。推测 SGT1
可能位于不同 R 基因介导抗病信号途径的集中点上, 对
调节植物抗病反应具有“广谱作用”。研究表明, SGT1基
因是多个大麦抗白粉病基因 MLA 介导的抗白粉病途径中
的重要信号开关之一, 但不同的MLA基因对 SGT1表达的
需求量有所不同。MLA6 介导大麦对白粉病抗性, MLA6
对 SGT1的需求量高于 MLA1对 SGT1的需求量[7-8,20], 说
明 SGT1表达水平必须达到某一阈值时, 才能使植株 R蛋
白介导抗性表达, 所以推测在植物体内增加 SGT1的表达
量可能会增加植株抗病能力。李为民等 [22]将海岛棉
GbSGT1基因在烟草中超量表达, 使烟草对赤星病抗性得
到增强。这一结果证实了上述推测的可能性。VIGS试验
证明, SGT1是小麦 Lr21介导的条锈病抗性反应所必要的
元件[10]。本研究表明, TiSGT1基因超量表达的转基因株系
提高了小麦对黄矮病、白粉病的抗性, 增加了小麦抗病广
谱性。暗示 SGT1可能是中间偃麦草和小麦一些抗病基因
介导的抗病途径中的重要信号元件。
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