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柱切换高效液相色谱法分析4种鼠尾草属植物的化学成分



全 文 :或组培苗 HPLC特征图谱优选较佳种质资源的原茎
或组培苗。铁皮石斛从组培苗、炼苗到入田不同生
长期周期的 HPLC 特征图谱相关性有待于进一步
研究。
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柱切换高效液相色谱法分析 4 种鼠尾草属植物的化学成分
张林东1, 李 菲1, 曾灵娜1, 向 诚1, 李宝才1* , 李 鹏1,2*
(1. 昆明理工大学 生命科学与技术学院,云南 昆明 650224;2. (澳门大学)中药质量研究国家重点实验
室,澳门 999078)
收稿日期:2011-10-23
基金项目:国家自然科学基金项目 (30960042)
作者简介:张林东 (1986—) ,男,硕士生,研究方向:天然药物化学与中药成分分析。Tel: (0871)5920567,E-mail:zhanglindong861018
@ 163. com
* 通信作者:李 鹏 (1978—) ,男,助理教授,博士,研究方向:中药活性评价及质量控制。Tel: (853)83974874,E-mail:pli1978
@ hotmail. com
李宝才 (1957—) ,男,教授,博士,研究方向:天然产物化学和药物化学。Tel: (0871)5920567,E-mail:baocaili@ hot-
mail. com
摘要:目的 应用柱切换高效液相色谱技术实现鼠尾草属植物中水溶性和脂溶性化学成分在不同色谱柱上的分析,实
现更多成分的分离。方法 在 HPLC基础上利用二位十通切换阀实现水溶性成分和脂溶性成分的切割,以 Megres-C18
色谱柱 (4. 6 mm × 10 mm,5 μm)为预吸附柱,用 Zorbax Sb-Aq色谱柱 (4. 6 mm × 150 mm,5 μm)完成水溶性成分分
析,用 Eclips XDB-C18色谱柱 (4. 6 mm × 150 mm,5 μm)完成脂溶性成分分析。结果 建立了柱切换高效液相色谱技
术分离鼠尾草属植物化学成分的方法,完成其中 7 种成分 (丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、隐丹参酮、丹参
酮 I和丹参酮 IIA)的定性和定量分析。结论 利用柱切换高效液相色谱技术可以很好地实现鼠尾草植物中极性差异
较大化学成分的分离和分析,为复杂中药的质量控制提供了一种方法借鉴。
关键词:柱切换;鼠尾草属;化学成分
中图分类号:R284. 1 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2012)09-1743-05
Analysis of chemical components in four Salvia plants by HPLC with
column switching
ZHANG Lin-dong1, LI Fei1, ZENG Ling-na1, XIANG Cheng1, LI Bao-cai1* , LI Peng1,2*
(1. Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Sinence and Technology,Kunming 650224,China;2. State Key Laboratory of Quality
Research in Chinese Medicine (University of Macau) ,Macau 999078,China)
ABSTRACT:AIM To analyze the hydrophilic and hydrophobic components of Salvia miltiorrhiza,Salvia yun-
nanensis,Salvia przewalskii and Salvia castanea and to achieve the separation of much more components with the
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HPLC with column switching technique. METHODS Adding a two positions ten-pass switching valve to achieve
the cutting of the water soluble and fat-soluble chemical compositions in the use of Megres-C18 column (4. 6 mm ×
10 mm,5 μm)as a pre-column,the hydrophilic constituents and the hydrophobic constituents were separated on a
Zorbax Sb-Aq column (4. 6 mm × 150 mm,5 μm)and an Eclips XDB-C18 column (4. 6 mm × 150 mm,5 μm).
RESULTS An HPLC method coupled with column switching was successfully applied to the analysis of hydrophil-
ic and hydrophobic components in four Salvia plants. Seven active components (danshensu,protocatechuic alde-
hyde,protocatechuic acid,caffeic acid,cryptotanshinone,tanshinone I and tanshinone IIA)in these plants were
qualitatively and quantitatively analyzed. CONCLUSION Data on HPLC with column switching shows that the
separation and analysis of the different polarity components of the Salvia can be achieved.
KEY WORDS:column switching;Salvia;components
柱切换 (column switching)色谱技术又名色谱
-色谱联用技术或多维色谱技术 (multi-dimensional
chromatography)[1],是在普通的 HPLC 装置中接入
一个切换阀 (六通阀或十通阀)实现不同流路之
间的相互切换,而达到所需的分离分析目的。柱切
换技术具有在线净化、浓缩样品、简化样品预处理
等优点,被广泛应用于环境保护、农药残留监测等
领域[2],但在中药化学成分分析及定量分析领域应
用较少,因此把此技术应用于道地中药的质量控制
以及中药材替代品的寻找和质量控制有一定意义。
鼠尾草属 Salvia 是唇形科 Lamiaceae 鼠尾草族
Salvieae 中最大的一个属,全世界约 1 050 种,广布
于热带、亚热带和温带地区,我国大部分地区均有
分布[3]。由于该属植物种类较多、分布广、变异
大,形态特征相近,种间区分困难,造成其系统分
类、品种鉴定及资源利用一直较为混乱[4]。该属
多种植物常作为丹参的替代品使用。丹参含有水溶
性和脂溶性的两大类有效成分。水溶性成分主要为
原儿茶醛、丹参素、丹酚酸等多聚酚酸类成分[5],
具有消除自由基、保护胃黏膜[6]等药理作用。脂
溶性成分为隐丹参酮、丹参酮 IIA 等多种菲醌类物
质[3],药理作用主要体现在抗菌消炎,抗肿瘤和组
织修复等[7-10]上。本实验主要利用双柱切换技
术[11]实现对该属植物水溶性和脂溶性成分分别在
不同色谱柱上进行定性、定量分析,为鼠尾草属植
物中复杂化学成分分析提供一个更好的方法,为鼠
尾草植物资源的科学评价和综合利用提供依据。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱系统:
G1322A脱气机,G1311A 四元泵,G1329A 自动进
样器,G1316A柱温箱,G1315D DAD检测器,预吸
附柱 Megres-C18色谱柱 (4. 6 mm × 10 mm,5 μm) ,
色谱柱 1 为 Agilent Zorbax Sb-Aq 色谱柱 (4. 6
mm ×150 mm,5 μm) ,色谱柱 2 为 Agilent Eclips
XDB-C18色谱柱 (4. 6 mm × 150 mm,5 μm) ,
MXP9960-000 二位十通高压切换阀 (美国 Rheod-
yne) ,0. 25 μm PEEK管,T2000Y型电子天平 (美
国双杰兄弟 (集团)有限公司) ,CP-214 电子分析
天平 (梅特勒-托利多仪器 (上海)有限公司)。
1. 2 试药 正品丹参药材购自云南一心堂中药房,
其他 3 种鼠尾草均采自丽江,4 种药材经云南省中
医中药研究院郭世民研究员鉴定分别为丹参 Salvia
miltiorrhiza,云南鼠尾草 Salvia yunnanensis C. H.
Wright,甘西鼠尾草 Salvia przewalskii Maxim,栗色
鼠尾草 Salvia castanea Diels。丹参素、丹参酮 IIA、
丹参酮 I、隐丹参酮、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡
酸对照品均购自中国药品生物制品检定所。乙腈
(色谱纯,美国 Tedia 公司) ,娃哈哈纯净水,其他
试剂均为分析纯。
2 实验方法与结果
2. 1 样品制备
2. 1. 1 供试样品溶液的制备 将药材充分晒干后,
鼓风干燥 12 h,粉碎,过 60 目筛。取生药粉 1. 0 g,
精密称定,精密加入 20 mL 甲醇,称定质量。超声
提取 30 min,放冷后称定质量,用甲醇补足损失的
质量。摇匀,静置,取上清液,用 0. 45 μm 的微孔
滤膜过滤,滤液作为供试样品溶液。
2. 1. 2 提取工艺加样回收率试验样品制备 精密
移取一定量的各对照品溶液置于烧杯中,挥干,然
后称取 1. 000 g丹参药材置于烧杯中按照 2. 1. 1 项
中供试样品的制备方法,提取药材制备提取工艺加
样回收率试验样品。
2. 1. 3 对照品溶液的制备 精密称取丹参素 6. 0
mg,其他对照品均精密称取 4. 0 mg。丹参素、原
儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸分别加到不同 10 mL量
瓶中甲醇定容。将隐丹参酮、丹参酮 I、丹参酮 IIA
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加入到同一个 10 mL量瓶中,再从上述定容的 4 种
对照品溶液中分别移取 1. 00 mL,甲醇定容制成混
合标准品贮备液。
2. 2 色谱条件 柱温为 25 ℃;体积质量 1. 0
mL /min;0 ~ 15 min 检测波长 (λ)为 210 nm,
15 ~ 70 min为 275 nm (根据不同物质的特征吸收
波长不同选择) ,DAD 检测器在 190 ~ 600 nm 扫描
紫外谱图;流动相为 A (0. 5%磷酸)-B (乙腈) ,
0 ~ 40 min在色谱柱 1 分析,40 ~ 70 min在色谱柱 2
进行分析。柱切换梯度洗脱程序见表 1。
2. 3 样品测定 采用 2. 2 项中色谱条件进行分析,
样品中与对照品对应的色谱峰,通过与对照品色谱
图的保留时间和 DAD 检测器扫描的紫外谱图比对
确定。
2. 3. 1 标准曲线及线性范围 取 2. 1. 3 项方法配
制的混合对照品溶液稀释成丹参素为 0. 3、0. 6、
2. 4、15、60 μg /mL,原儿茶醛和原儿茶酸均为
0. 2、0. 4、1. 6、10、40 μg /mL,咖啡酸为 0. 8、
1. 6、10、20、40 μg /mL,隐丹参酮、丹参酮 I 和
丹参酮 IIA 均为 2、4、16、100、400 μg /mL 的不
同质量浓度的混合对照品溶液,以实验方法中色谱
条件进样,以质量浓度 C为横坐标,以峰面积 A为
表 1 柱切换梯度洗脱程序
Tab. 1 The gradient program of the column switching
HPLC method
色谱柱
时间
/min
A (0. 5%
磷酸) /%
B (乙腈)
/%
检测波长
/nm
预柱 +色谱柱 1 0 92 8 210
Agilent Zorbax Sb-Aq 5 85 15 210
13 85 15 210
18 79 21 275
23 79 21 275
28 75 25 275
33 75 25 275
38 72 28 275
40 72 28 275
预柱 +色谱柱 2 45 55 45 275
Agilent Eclips XDB-C18 50 55 45 275
53 38 62 275
70 15 85 275
纵坐标进行线性回归。结果表明,各成分在一定的
范围内线性关系良好,见表 2。
2. 3. 2 最低检测限 (LOD)和最低定量限
(LQD) 取 2. 1. 3 项配制的混合对照品溶液稀释
成一系列不同质量浓度的对照品溶液,在选定的色
谱条件下,按信噪比 (S /N)为 3 和 10 分别作为
最低检测限和最低定量限,结果见表 2。
表 2 回归方程,相关系数,线性范围,检出限及定量限
Tab. 2 Regressive equation,correlation coefficient,linear range,LOD and LOQ
分析物 回归方程 相关系数 线性范围 C / (μg·mL -1) 检出限 C / (μg·mL -1)定量限 C / (μg·mL -1)
丹参素 A = 41. 382C + 13. 67 0. 999 8 0. 30 ~ 60. 0 0. 05 0. 20
原儿茶醛 A = 71. 391C - 8. 109 8 0. 999 9 0. 20 ~ 40. 0 0. 05 0. 15
原儿茶酸 A = 53. 788C - 7. 417 3 0. 999 9 0. 20 ~ 40. 0 0. 05 0. 15
咖啡酸 A = 19. 468C + 7. 732 1 0. 999 9 0. 80 ~ 40. 0 0. 30 0. 80
隐丹参酮 A = 33. 643C + 9. 292 7 0. 999 9 2. 0 ~ 400 0. 05 0. 20
丹参酮 I A = 11. 612C - 19. 848 0. 999 9 2. 0 ~ 400 0. 80 2. 0
丹参酮 IIA A = 38. 058C + 189. 4 0. 999 9 2. 0 ~ 400 0. 05 0. 20
2. 3. 3 提取工艺回收率实验 取 2. 1. 2 项中制备
的丹参加样提取样品分别按照 2. 2 项中色谱条件进
行分析,3 个添加水平,每个添加水平样品重复进
样 3 次,以 3 次平均值计算回收率,回收率均在
95. 23% ~98. 48%之间,精密度 RSD 均在 0. 5% ~
1. 5%之间,见表 3。
2. 3. 4 精密度和回收率实验 取 2. 1. 3 项中配制
的混合对照品贮备液稀释为丹参素 15. 0 μg /mL,
原儿茶醛、原儿茶酸和咖啡酸均为 10. 0 μg /mL,
隐丹参酮、丹参酮 I 和丹参酮 IIA 均为 100. 0 μg /
mL的对照品溶液做样品日内、日间精密度,回收
率实验。取对照品溶液于同日连续进样 5 次测定日
内精密度,取对照品溶液连续 3 日,每日进样 2
次,共 6 次,测定日间精密度。精密度 RSD 均在
0. 12% ~ 0. 71% 之间,回收率均在 95. 87% ~
102. 31%之间。
2. 3. 5 4 种鼠尾草属植物中 7 种成分的测定 按
照 2. 1. 1 项制备供试样品溶液,用建立的柱切换高
效液相色谱技术能很好地分离和分析 4 种鼠尾草属
植物中的 4 种水溶性成分 (丹参素、原儿茶醛、
原儿茶酸、咖啡酸)和 3 种脂溶性成分 (隐丹参
酮、丹参酮 I、丹参酮 IIA) ,参照 2. 3项确定分析物
质在色谱图中位置,对照品及甘西鼠尾草提取液的
HPLC图谱见图 1,7个指标成分的测定结果见表 4。
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表 3 提取工艺加样回收率实验
Tab. 3 Recoveries of seven components in Savia miltiorrhiza
分析物
含有量 /
(μg·mL -1)
添加水平 /
(μg·mL -1)
测得量 /
(μg·mL -1)
回收率 /
%
RSD/
%
2. 4 19. 35 95. 23
丹参素 17. 06 15 31. 66 97. 33 1. 43
30 46. 45 97. 96
1. 6 3. 27 97. 50
原儿茶醛 1. 71 10 11. 47 97. 56 0. 63
30 30. 64 96. 44
1. 6 6. 92 98. 02
原儿茶酸 5. 35 10 14. 94 95. 86 1. 08
30 34. 40 96. 83
1. 6 3. 21 96. 78
咖啡酸 1. 66 10 11. 37 97. 07 0. 73
30 30. 37 95. 69
16 28. 13 96. 68
隐丹参酮 12. 66 100 110. 22 97. 56 0. 91
300 308. 13 98. 49
16 54. 04 97. 57
丹参酮 I 38. 43 100 133. 77 95. 34 1. 21
300 325. 32 95. 63
16 67. 36 97. 48
丹参酮 IIA 51. 76 100 148. 15 96. 39 0. 70
300 344. 86 97. 70
a. 丹参素 b. 原儿茶醛 c. 原儿茶酸 d. 咖啡酸 e. 隐丹
参酮 f. 丹参酮 I g. 丹参酮 IIA
a. danshensu b. protocatechuic aldehyde c. protocatechuic acid
d. caffeic acid e. cryptotanshinone f. tanshinone I g. tan-
shinoneⅡA
图 1 对照品 (A)及甘西鼠尾草提取液 (B)的
HPLC图
Fig. 1 HPLC chromatograms of referance substances
(A)and methanol extract of Salvia przewalskii
Maxim (B)
表 4 4 种鼠尾草属植物中 7 种化学成分
Tab. 4 Contents of seven components in four plants of Sal-
via
成分
丹参 /
(μg·mL -1)
云南鼠尾草 /
(μg·mL -1)
甘西鼠尾草 /
(μg·mL -1)
栗色鼠尾草 /
(μg·mL -1)
丹参素 17. 06 9. 16 1. 26 0. 7
原儿茶醛 1. 71 1. 55 0. 28 -
原儿茶酸 5. 35 0. 7 0. 47 0. 4
咖啡酸 1. 66 - 4. 67 4. 07
隐丹参酮 12. 66 10. 63 114. 13 98. 8
丹参酮 I 38. 43 108. 85 80. 95 89. 63
丹参酮 IIA 51. 76 51. 48 112. 81 172. 64
-:表示未检测到。
3 讨论
3. 1 柱切换条件的选择 本实验的目的是利用柱
切换技术实现更多化学成分的分离,得到分离度
好,色谱峰多的色谱图,因此,流动相种类、比例
和柱切换时间的选择是重要因素。
3. 1. 1 流动相的选择 为了减弱提取物中酚酸类
物质的的拖尾现象和柱切换时系统峰和基线的影
响,流动相选择了乙腈 - 0. 5%磷酸水溶液体系。
3. 1. 2 柱切换时间的选择 因为柱切换过程中存
在系统死体积,为了使色谱图显现更多的化学成
分,切换时间和切换时流动相比例的选择可以避免
分析过程中成分的损失,最终确定在 40 min,磷酸
水溶液比例为 28%时进行切换。
3. 2 结果分析 通过选定色谱条件对 4 种鼠尾草
属植物中 7 种成分定量结果显示在 4 种植物中 4 种
水溶性成分除咖啡酸外,含有量均为丹参 >云南鼠
尾草 >甘西鼠尾草 >栗色鼠尾草,云南鼠尾草中部
分水溶性成分含有量与丹参药材相当,脂溶性成分
含有量云南鼠尾草除丹参酮 I 高于丹参外,另外两
组分含有量相当,甘西鼠尾草和栗色鼠尾草三组分
均远高于丹参药材,因此得出云南鼠尾草可作为丹
参替代药材使用,甘西鼠尾草和栗色鼠尾草在作为
丹参药材使用时应选择性的与其他中药材配伍使
用。本实验仅对采集样品进行分析。中药材受采集
时间,生长环境等影响,其有效成分会存在差异,
故本实验结果仅供参考。
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生晒参乙醇提取物直接酶法转化及液质分析
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(1. 淮阴工学院 生命科学与化学工程学院 生物中药与生物催化课题组,江苏 淮安 223002;2. 南京大学淮
安高新技术研究院,江苏 淮安 223005)
收稿日期:2011-10-13
基金项目:江苏省自然科学基金 (BK2008194)
作者简介:喻春皓 (1974—) ,男,副教授,博士,主要从事生物中药、中药生物加工及生物催化。Tel: (0517)83591165,E-mail:yuch@
hyit. edu. cn
摘要:目的 比较糖苷酶制剂直接催化水解生晒参乙醇提取物中人参皂苷部位转化制备高活性次生皂苷的能力。方法
利用 7 种糖苷酶制剂直接水解生晒参乙醇提取物中天然皂苷部位,建立 HPLC法评价其转化能力及采用 LC /MS联用分
析对特征峰加以指认。结果 建立的 HPLC方法可同时测定 8 种皂苷成分。糖苷酶制剂对生晒参乙醇提取物中天然皂
苷部位转化能力分别为蜗牛酶 SE07,62. 1%;果胶酶 PE05,62. 1%;果胶酶 PE06,51. 6%;白酒酶 LE04,31. 5%;纤
维素酶 CE02,22. 6%;纤维素酶 CE01,9. 7%。结论 糖苷酶制剂可以直接转化人参皂苷部位成高活性次生皂苷部
位。蜗牛酶与果胶酶可以规模化制备次生皂苷。
关键词:生晒参;人参皂苷;次生皂苷;糖苷酶制剂;CK;液质联用
中图分类号:R284. 1 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2012)09-1747-06
Directly enzymatic conversion of alcohol extracts from sun-dried Panax ginseng
and LC /MS analysis
YU Chun-hao1,2, WU Jie1
(1. Group of Bio TCM and Biocatalysis,Faculty of Life Science & Chemical Engineering,Huaiyin Institute of Technology,Huai an 223002,China;
2. Huaian High-Tech Research Institute of Nanjing University,Huaian 223005,China)
ABSTRACT:AIM To compare the conversion of saponins in alcohol extracts from sun-dried Panax ginseng by
the catalysis of seven glycosidase preparations to the secondary saponin on industrial scale. METHODS Seven
glycosidase preparations were used to directly hydrolyze ginseng saponins in alcohol extracts from sun-dried Panax
ginseng and to produce secondary saponins. HPLC analysis was developed to evaluate the conversion ability of gly-
cosidase and LC /MS method was established to identify the chromatogram peaks. RESULTS HPLC could be
used to simultaneously determine eight ginseng saponins in the extracts. The conversion ability of glycosidase to sec-
ondary saponins in the alcohol extracts was as follows:snail enzyme SE07 reached 62. 1%,pectinase PE05 reached
7471
2012 年 9 月
第 34 卷 第 9 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
September 2012
Vol. 34 No. 9