全 文 ：植物遗传资源学报 2010, 11(4):483-486, 490JournalofPlantGeneticResources
鼠尾草属部分物种 AFLP指纹图谱构建及
遗传多样性分析
邓科君1 ,张　勇 1 ,鄢　丹2 ,彭金华 1 ,张　硕 1 ,任正隆1
(1电子科技大学生命科学与技术学院 ,成都 610054;2中国人民解放军第三 O二医院全军中药研究所 ,北京 100039)
　　摘要:为了建立适用于鼠尾草属植物的 AFLP技术体系 , 并对鼠尾草属部分物种遗传多样性进行分析。作者经筛选得到
24对有效 AFLP引物组合 , 共检测 1616个有效扩增位点;其中 22对 AFLP引物组合针对不同材料可检测到特异性扩增位点 ,
每对引物检测强度从 1到 16个位点不等;依据 AFLP数据计算的 22个鼠尾草属植物材料间 231个配对遗传相似系数介于
0.5677 ～ 0.9898,显示了丰富的遗传多样性;系统树显示 AFLP分析可以将 11个鼠尾草属植物准确区分 , 其中种内不同居群
的材料可有效聚为亚组 ,说明本文所构建的 AFLP技术体系能够有效应用于鼠尾草属植物种间及种内鉴定 、遗传多样性分析
及系统发育研究中。
关键词:鼠尾草属;遗传多样性;AFLP
ConstructionofAFLPFingerprintandGeneticDiversityAnalysis
oftheGenusSalvia
DENGKe-jun1 , ZHANGYong1 , YANDan2 , PENGJin-hua1 , ZHANGShuo1 , RENZheng-long1
(1SchoolofLifeSciencesandTechnology, UniversityofElectronicScienceandTechnologyofChina, Chengdu610054;
2 InstituteofTraditionalChineseMedicine, 302 MilitaryHospitalofChina, Beijing100039)
　　Abstract:ToestablishtheAFLPfingerprintingsystemofgoodreproducibilityandhighdistinguishability.The
geneticdiversityintheplantsfromthegenusSalviawasanalyzedbyusingAFLP.The24 selectedamplification
primercombinationsproducedatotalof1616 amplifiedfragmentsand1 to16 specialamplifiedfragmentswere
obtained, accordingtodiferentprimercombinationsused.Thecoeficientofgenesimilarityrangedfrom0.5677 to
0.9898 betweenspecies.ThiswidedistributionindicatedthatthegeneticdiversityofSalviawasplentiful.Theclus-
termapincludingalsampleswasobtainedbyUPGMAmethod.BasedontheresultsofAFLP, alsamplescouldbe
classifiedinto11 clusters, whichwereconsistentwiththeSalviastaxonomy, andeachsamplecouldbecorrectlyi-
dentified.TheresultsindicatedthattheAFLPfingerprintinganalysissystemcouldbeusedefectivelytoidentifythe
species, analysethegeneticdiversityandsystemevolutionofthegenusSalvia.
Keywords:Salvia;Geneticdiversity;AFLP
收稿日期:2009-04-21　　　　修回日期:2010-03-10
基金项目:国家自然科学基金(30670211, 30701087);国家博士后科学基金(20070411158);电子科技大学青年基金
作者简介:邓科君 ,博士研究生 ,讲师 ,从事药用植物分子遗传学研究。 E-mail:dengkj@uestc.edu.cn
通讯作者:张勇 , E-mail:zhangyong916@uestc.edu.cn;任正隆 ,教授 ,博导 , E-mail:renzl@uestc.edu.cn
鼠尾草属植物(Salvia)全世界约存 1000余种 ,
广泛分布于热带和温带地 ,我国有 83种 ,分布于全
国各地 ,西南为最多 [ 1] 。该属植物花色鲜艳丰富 ,
富含挥发油类 、二萜类和酚酸类成分 ,是重要的绿化
植物资源 、芳香植物资源 、食物添加剂和传统药用
植物。
国内外对鼠尾草属植物的研究历年来均集中在
形态分类 、化学成分以及药理药效等方面 [ 2-4] 。近
年来 ,针对鼠尾草属植物丹参 ,研究者应用不同的分
子标记体系开展了遗传多样性分析及种质分类鉴定
等研究工作[ 5-10] 。但对于鼠尾草属内的分子系统研
究 ,则多限于通过对叶绿体基因组 psbA、trnL-F序
DOI :10.13430/j.cnki.jpg r.2010.04.023
植　物　遗　传　资　源　学　报 11卷
列 [ 11] 、核基因组 rDNAITS序列[ 5]进行测序 ,进而依
据序列信息进行分子系统学分析。但此类研究实质
上是以检测位点的序列多样性代替了物种多样性 ,
由于测定序列的分子进化速率可能与物种水平上的
进化速率存在一定差异 ,因此 ,基于全基因组水平多
态位点检测的结果更具代表性 。
本文以引自美国植物种质资源中心及我国的鼠
尾草属部分物种材料为代表 ,建立了适用于鼠尾草属
植物基因组多态性位点检测的稳定且高效的 AFLP
分析体系 ,并构建了高分辨率指纹图谱 ,在此基础上
对实验材料遗传多样性进行了分析 ,从全基因组水平
比较鼠尾草属植物基因组组成及遗传结构差异 ,为更
好开发利用鼠尾草属植物资源奠定研究基础。
1　材料与方法
1.1　材料
以鼠尾草属 11个物种为实验材料 ,其中S.azurea
var.grandiflor源自美国 3个不同地理居群 , S.sclarea
源自欧洲 2个不同地理居群 , S.tesquicola源自俄罗斯
和前苏联 2个不同地理居群 , S.scapiformia源自我国
四川峨嵋 2个不同居群 , S.miltiorrhiza源自我国四川
中江 7个不同地理居群 ,其余样本均由独立居群构
成。凭证标本存于电子科技大学生命科学与技术学
院分子细胞研究室 ,具体信息详见表 1。
表 1　用于 AFLP分析的鼠尾草属植物
Table1　DescriptionofspeciesfromthegenusSalviausedinAFLPanalysis
序号
Code
物种
Species
来源
Origin
序号
Code
物种
Species
来源地
Origin
1 S.azureavar.grandiflora-1 美国密苏里州 12 S.substolonifer 中国四川
2 S.azureavar.grandiflora-2 美国堪萨斯州 13 S.splendens 中国四川
3 S.azureavar.grandiflora-3 美国爱德华州 14 S.scapiformia-1 中国四川
4 S.sclarea-1 南斯拉夫 15 S.scapiformia-2 中国四川
5 S.sclarea-2 阿富汗 16 S.miltiorrhiza-1 中国四川
6 Stesquicola-1 前苏联 17 S.miltiorrhiza-2 中国四川
7 S.tesquicola-2 俄罗斯 18 S.miltiorrhiza-3 中国四川
8 S.verbenaca 西班牙 19 S.miltiorrhiza-4 中国四川
9 S.viridis 南斯拉夫 20 S.miltiorrhiza-5 中国四川
10 S.oficinalis 意大利巴西利卡塔 21 S.miltiorrhiza-6 中国四川
11 S.cavalerici 中国四川 22 S.miltiorrhiza-7 中国四川
S.azureavar.grandiflora后简写为S.azurea;相同字母代码后不同数字表示来源于不同地区的居群
1.2　DNA提取
取样本的新鲜幼嫩叶片 0.5g用于 DNA提取 ,
提取方法参考 Muray等 [ 12] 的方法并做修改 ,详见
前文报道[ 6] 。 DNA的纯度和浓度用 0.8%琼脂糖凝
胶和 BioSpec-mini分光光度仪 (Shimadzu, Japan)检
测 。最后将 DNA稀释至约 200ng/μl, -20℃保存备
用 。
1.3　AFLP分析
EcoRI、MseⅠ接头及引物序列以 Vos等[ 7]序列
为参照 , 接头序列:EcoRⅠ -adaptors-F:5′-CTCG-
TAGACTGCGTACC-3′;EcoRⅠ -adaptors-R:5′-AATT-
GGTACGCAGTC-3′;MseⅠ -adaptors-F:5′-GACGAT-
GAGTCCTGAG-3′;MseⅠ -adaptors-R:5′-TACTCAG-
GACTCAT-3′;预扩引物序列:EcoRⅠ-A:5′-GACTGCG-
TACCAATTCA-3′;MseⅠ-C:5′-GACGATGAGTCCTGAG-
TAAC-3′。所有序列由 Invitrogen公司(Invitrogen, A-
merica)合成。AFLP分析流程基本参照 Vos等[ 7]的
方法并经修改 ,详见前文报道 [ 6] 。
1.4　数据分析
AFLP带为显性标记 ,按照扩增条带的有无分
别记为 1和 0,只选用 150 ～ 500 bp间且在两次重复
中均出现的清晰条带进行记分 。其结果为一个 0、1
二元矩阵 , 将其输入 NTSYSpc2.1处理分析 , 以
SIMQUAL子程序计算样本间的 Jaccard相似系数。
之后 ,基于遗传相似系数矩阵 ,依据 UPGMA算法并
以 SHAN子程序进行聚类分析。
2　结果与分析
2.1　AFLP指纹图谱构建
在 AFLP指纹图谱构建过程中 ,基因组 DNA
484
　4期 邓科君等:鼠尾草属部分物种 AFLP指纹图谱构建及遗传多样性分析
完整性及纯度 、酶切程度 、连接效率及预扩增效
率均关系到后续的选择性扩增能否获得理想的
结果 。本文采用 CTAB法 ,获得了鼠尾草属植物
高质量基因组 DNA, OD值均在 1.70 ～ 1.90;酶
切后用 1%的琼脂糖电泳检测 ,呈均匀明亮带 ,证
明酶切成功 ;预扩增产物形成连续的弥散带 , 稀
释 25倍后用作选择性扩增反应的模板;筛选了
24对 AFLP引物 ,均可产生清晰可辨的 AFLP指
纹图谱(图 1)。 24对引物总共扩增得到 1616条
清晰条带 ,分子量在 150 ～ 500 bp之间 。不同引
物组合扩增出的谱带数存在明显差异 ,谱带最多
的引物组合为 E-AAC+M-CAC, 共扩增出 84条
带 ,最少的引物组合为 E-ACG+M-CAT, 共扩增
出 34条带 。
图 1　鼠尾草属植物 AFLP指纹图谱
Fig.1TheAFLPfingerprintofSalviassp.entries
(1 ～ 22:检测材料 ,编号同表 1)
(1-22:thenumbersforeachlanecorespondwithtable1)
2.2　鼠尾草属植物遗传多样性分析
鼠尾草植物 AFLP分析中所扩增的条带多态位
点比率(PPB)为 99.94%。其中 ,特异性条带共 89
条 ,只有 1条单态性条带。依据 AFLP在丹参及其
同属植物的扩增结果 ,统计扩增位点并转化为 0、1
二元矩阵 ,以 NTSYSpc2.1计算供试材料间的 Jac-
card相似性系数 ,得到的相似性系数介于 0.5677 ～
0.9898间 ,均值为 0.7518。其中相似性系数最大的
是 S.azureavar.grandiflora中来自 Missouri和 Kan-
sas两个不同居群之间 , 为 0.9898;最小的是
S.azureavar.grandiflora与 S.miltiorhiza-6之间 ,为
0.5698。这些数据表明各物种间遗传多样性比较丰
富 ,不同物种间含有独特的基因资源 。
2.3　鼠尾草属植物聚类分析
依据 Jaccard相似性系数 ,以 UPGMA算法对所
有供试材料进行聚类分析 ,构建供试材料的系统发
育树(图 2),以 0.81为阈值可将 11种鼠尾草植物
在物种水平进行准确区分。在物种水平之下 ,包括
不同数量居群的 S.azurea、S.sclarea、S.tesquicola、S.
scapiformia、S.miltiorhiza材料同样在聚类分析中依
照居群关系相聚成簇。进一步分析种内居群间的起
源关系发现由 2个居群样本构成的 S.scapiformia以
及由 7个居群样本构成的 S.miltiorrhiza显示了相对
较近的起源关系 , 而包括 S.azurea、S.sclarea、S.
tesquicola在内的 3个物种居群间则表现了较大的遗
传歧化度 。
3　讨论
AFLP的技术关键在于高质量的基因组的提
取 ,酶切连接反应 ,扩增反应体系和银染方法的优
化。本文所建立的方法成功在鼠尾草属多种植物中
得以实现 ,获得了条带清晰 、稳定性好 、多态性较丰
富高质量的 AFLP指纹图谱 (图 1),能将实验所用
的 11种鼠尾草属植物完全区分开。王冰等 [ 6]利用
AFLP技术能将鼠尾草属中国传统药用植物丹参 S.
miltiorhiza27个居群的材料正确识别的 ,这说明植
物 AFLP指纹图谱在鼠尾草鼠资源材料识别和区分
上表现出高分辨率 ,完全可以用于鼠尾草属植物遗
传多样性 、分类 、演化及与地理分布间关系的研究 。
本研究通过对 11种鼠尾草属植物进行 AFLP分
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植　物　遗　传　资　源　学　报 11卷
图 2　基于鼠尾草属植物 AFLP分析的
UPGMA聚类图
Fig.2 UPGMAdendrogramforgeneticrelationshipsof
SalviabasedontheAFLPanalysis
析 , 24对 AFLP引物组合共得到了 1616条带 ,多态
性条带为 99.94%,说明本文研究材料间遗传距离
较大 ,种间蕴藏丰富的遗传多样性。 Bruna等[ 8]以 7
个随机引物进行 RAPD分析 ,共得到 143条多态性
条带 ,可将对 17种鼠尾草属植物进行个体鉴定 。王
迎等[ 5]通过对 27种鼠尾草属药用植物及其近缘种
的 ITS序列分析得知 ,各亚属间差异明显 ,且原产我
国的该属植物与欧美引进种明显具有不同起源 。但
同时指出 , ITS系统树对于亚属和组的处理较为合
理 ,而对组下的划分则表现出了信息量不足 ,需要其
他相关证据的支持。而本文的研究结果表明 , AFLP
分子标记技术在鼠尾草属种间及种内水平上的遗传
多样性分析中具有明显优势 ,能够准确进行基源
鉴定。
在种内遗传多样性的研究上 , Echeverrigaray
等 [ 9]运用 RAPD技术对来自巴西野生和栽培品种
S.oficinalis进行了遗传多样性分析 , 18个随机引物
扩增了 195条带 ,多态性位点为 59.3%,聚类分析
表明巴西南部的部分品种是来源于欧洲 ,在栽培类
型中存在着较低的变异 。郭宝林等[ 10]用 RAPD技
术对中国 9个居群的丹参遗传多样性进行了研究 ,
11个 RAPD引物共得到 129条扩增带 ,全部为多态
性带 ,即所有样本没有共有带 ,丹参种内多态位点比
率为 100%。王冰等[ 6]用 AFLP技术对中国 27个丹
参居群遗传多样性进行了研究 , 10对 AFLP引物组
合共得到 528条带 ,多态位点比率为 90.15%。本
文的实验结果也表明 ,鼠尾草属植物中种内也存在
着丰富的遗传多样性。依据 AFLP的扩增模式进行
聚类分析 ,在鼠尾草属植物种间及种内不同水平上
均可进行有效区分 ,体现了鼠尾草属物种不同程度
的遗传分化及多样性分布(图 2)。然而 ,由于本文
所用材料相关物种测试数目有限 ,所检测到的种间
及种内居群间的遗传变异还不够全面 ,有待于增加
测试材料和使用引物的数目 ,以加深对鼠尾草属植
物遗传多样性的理解。
参考文献
[ 1] 　 中国科学院北京植物研究所 ,中国高等植物图鉴(第三册)
[ M] .北京:科学出版社 , 1985:667-675
[ 2] 　 肖小河 ,方清茂 ,夏文娟, 等.药用鼠尾草属数值分类与丹参
药材道地性 [ J] .植物资源与环境 , 1997, 6(2):17-21
[ 3] 　 屈英薇 ,李拮 ,王淑月.鼠尾草属植物的化学成分及药理活性
[ J] .河北医科大学学报 , 2005, 26(6):701-702
[ 4] 　 AntonioR, DiegoR, JoseAntonioP, etal.NumericalTaxonomy
StudyofSalviasect.Salvia(Labiatae)[ J] .BotanicalJournalof
theLinneanSociety, 2004, 145(3):353-371
(下转第 490页)
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植　物　遗　传　资　源　学　报 11卷
带到船上 ,船到岸以后 ,船员便把它们丢在海边 ,其
中极少数在海边生根 。由于商船由绿玉树原产地非
洲等地至华南沿海之间的往返是重复进行的 ,因此
绿玉树枝条也有可能被重复带至。由于绿玉树在原
产地主要为种子繁殖 ,具有丰富的遗传多样性 。来
自同一地区的绿玉树其原产地可能不同 ,可能存在
较大的遗传差异 ,而来自不同地区的绿玉树其原产
地可能相同 ,遗传差异较小 。如上海植物园的绿玉
树引自华南 ,具有与华南绿玉树相同的遗传多样性
特点。
参考文献
[ 1] 　 蒋丽娟.引进植物绿玉树(EuphorbiatirucaliL.)的繁殖技术
及提高抗寒性的研究 [ D] .长沙:湖南农业大学 , 2002
[ 2] 　 MaughTH.Thepetroleumplant:Perhapswecangrowgasoline
[J] .Science, 1976, 194:46
[ 3] 　 CalvinM.Hydrocarbonsfromplants:Analyticalmethodsand
observations[ J] .Naturwisenschaften, 1980, 67:525-533
[ 4] 　 SowD, OllivierB, ViaundP, etal.Mesophilicandthermophilic
methanefermentationofEuphorbiatirucali[ J].MIRCENJour-
nal, 1989, 5:547-550
[ 5] 　 KalitaD.Hydrocarbonplant———Newsourceofenergyforfuture
[ J] .RenewableandSustainableEnergyReviews, 2008, 12:
455-471
[ 6] 　 李凌 ,李政.绿玉树分布状况的调查研究 [ J] .西南农业大学
学报(自然科学版), 2005, 27(5):644-647
[ 7] 　 刘万勃, 宋明 ,刘富中 , 等.RAPD和 ISSR标记对甜瓜种质遗
传多样性的研究 [ J] .农业生物技术学报 , 2002, 10(3):
231-236
[ 8] 　 杨庆文 ,张万霞 ,时津霞 ,等.广东高州普通野生稻 Oryzarufi-
pogonGrif.的遗传多样性和居群遗传分化研究 [ J].植物遗
传资源学报 , 2004, 5(4):315-319
[ 9] 　 程春明 ,石云素 ,宋燕春 , 等.ISSR分子标记技术在分析玉米
自交系遗传关系研究中的适用性 [ J].植物遗传资源学报 ,
2005, 6(2):172-177
[ 10] 　马艳明 ,李斯深 ,范玉顶 ,等.黄淮麦区小麦品种(系)的 ISSR
位点遗传多样性分析 [ J] .植物遗传资源学报 , 2006, 7(1):
13-17
[ 11] 　赵丽娟 ,张宗文 ,黎裕 ,等.苦荞种质资源遗传多样性的 ISSR
分析 [ J] .植物遗传资源学报 , 2006, 7(2):159-164
[ 12] 　孙群 ,佟汉文 ,吴波 ,等.不同种源乌拉尔甘草形态和 ISSR遗
传多样性研究 [ J].植物遗传资源学报 , 2007, 8(1):56-63
[ 13] 　高山 ,许端祥 ,林碧英 ,等.38份瓠瓜种质资源遗传多样性的
ISSR分析 [ J] .植物遗传资源学报 , 2007, 8(4):396-400
[ 14] 　杜黎明 ,毛伟海 , 包崇来 , 等.茄子基因组 DNA提取及 ISSR-
PCR反应体系优化 [ J] .农业生物技术学报 , 2007, 15(4):
723-724
[ 15] 　赵杨 ,陈晓阳 ,王秀荣 ,等.二色胡枝子遗传多样性 ISSR分析
[ J] .植物遗传资源学报 , 2007, 8(2):195-199
[ 16] 　黄玮 ,孙平 ,张文生 ,等.北京东灵山地区不同海拔柴胡居群
的遗传多样性 [ J].植物遗传资源学报 , 2008, 9(4):453-457
[ 17] 　刘本英 ,王丽鸳 ,周健 ,等.云南大叶种茶树种质资源 ISSR指
纹图谱构建及遗传多样性分析 [ J] .植物遗传资源学报 ,
2008, 9(4):458-464
[ 18] 　孙芳 ,杨敏生 ,张军 ,等.刺槐不同居群遗传多样性的 ISSR分
析 [ J] .植物遗传资源学报 , 2009, 10(1):91-96
(上接第 486页)
[ 5] 　 王迎 ,李大辉 ,张英涛.鼠尾草属药用植物及其近缘种的 ITS
序列分析 [ J] .药学学报 , 2007, 42(12):1309-1313
[ 6] 　 王冰 ,张勇 ,陈成彬 ,等.中国不同地理居群丹参遗传多样性分
析 [ J] .中国中药杂志.2007, 32(19):2000-2003
[ 7] 　 VosP, HogersR, BleekerM.AFLP:anewtechniqueforDNAfin-
gerprinting[ J] .NucleicAcidsResearch, 1995, 23 (5):
4407-4414
[ 8] 　 BrunaS, GiovanniniA, DeBenedettiL, etal.Molecularanalysisof
Salviaofspp.throughRAPDmarkers[ C] .InternationalSymposi-
umontheLabiatae, Italy, 2006
[ 9] 　 EcheverrigarayS, AgostiniG.Geneticrelationshipsbetweencom-
mercialcultivarsandBrazilianaccessionsofSalviaofficinalisL.
basedonRAPDmarkers[ J] .Revistabrasileirademedicina,
2006, 8:13-17
[ 10] 　郭宝林 ,林生 ,冯毓秀 ,等.丹参主要居群的遗传关系及药材道
地性的初步研究 [ J] .中草药 , 2003, 33(12):1113-1116
[ 11] 　WalkerJB, SytsmaKJ.StaminalevolutioninthegenusSalvia
(Lamiaceae):Molecularphylogeneticevidenceformultipleorigins
oftheStaminalLeve[ J] .AnnalsofBotany, 2007, 100:375-391
[ 12] 　MurayMG, ThompsonW F.Rapidisolationofhighmolecular
weightplantDNA [ J] .NucleicAcidsResearch, 1980, 8:
4321-4325
490