全 文 ：浙江大学学报牗农业与生命科学版牘　32牗1牘牶51～ 55牞2006
Journal of Zhejiang University牗Agric. & Life Sci.牘
文章编号牶1008-9209牗2006牘01-0051-05
　　收稿日期牶2004-11-10
基金项目牶浙江省自然科学基金资助项目牗M302668牘牣
作者简介牶杨 旭牗1979—牘牞浙江建德人牞硕士研究生牞主要从事植物资源的保护和利用方面的研究牞现在中国林科院亚热带林
业研究所工作牣Tel牶0571-63100410牷E-mai l牶yx2119@sina牣com牣
通讯作者牶姜维梅牞女牞硕士牞讲师牞从事植物组织培养及转基因的研究牣Tel牶0571-86971373牷E-mai l牶wmjiang@zju牣edu牣cn牣
菊薯牗Smallanthus sonchif olius牘脱毒快繁的研究
杨 旭1牞姜维梅1牞丁炳扬2
牗1牣浙江大学 生命科学学院牞浙江 杭州 310029牷2牣温州师范学院 生命与环境科学学院牞浙江 温州 325027牘
摘　要牶采用菊薯块茎的腋芽进行生长点的剥离牞通过组织培养得到了再生植株牣经双抗体夹心酶联
牗DAS-ELISA牘法对脱毒植株进行病毒鉴定表明牞脱毒的成功率为 60%牣用无毒苗的茎段牗含节牘、叶片作
为外植体牞筛选了从启动 、增殖与分化直至生根各阶段的最适培养基牞建立了简单良好的再生体系牣茎段
增殖的最适培养基为 M S+BA 1 mg爛L - 1 +NAA 0. 1 mg爛L - 1牞愈伤组织诱导的最适培养基为 MS+BA
0. 2 mg爛L - 1 +TDZ 0. 01 mg爛L - 1 +NAA 0. 05 mg爛L - 1牞最适生根培养基为 1牤2M S+NAA 0. 01 mg爛
L - 1牣平均移栽成活率达 80%以上牣
关　键　词牶菊薯牷黄瓜花叶病毒牷离体快繁牷玻璃化
中图分类号牶Q943. 1　　　文献标识码牶A
YANG Xu1牞JIANG Wei-mei1牞DING Bing-yang2(1. Col lege of L i f e Sciences牞Zhejiang University牞
H angzhou 310029牞China牷2. School of Li fe and Environmental Science牞Wenz hou Normal College牞
Wenzhou牞Zhe jiang 325027牞China)
In vitro propagation of virus-free yacon牗Smallanthus sonchi folius牘牣Journal of Zhejiang Univer sity
牗Agric. & Life Sci.牘牞2006牞32牗1牘牶51-55
Abstract牶The v irus-free y acon w as got by culturing the meristem-tip from ax illar y buds of its tuber. The
cucumber mosaic vir us牗CM V牘w as detected by DAS-ELISA. The results showed tha t 0. 3 mm meristem-
tip culture w as an effectiv e means fo r virus elimination and the r atio o f virus elimination amount to 60%
. A reliable and reproducible me thod fo r plant regenera tion o f yacon was developed w hich utilizes the
stem牗w ith nodes牘 and leaves f rom the virus-f ree plantlet as explants. The optimal prolifera ting shoot
cultures medium f rom stems w as MS supplemented w ith BAP 1 mg爛L - 1 and NAA 0. 1 mg爛L - 1. Highly
r egenerativ e ca llus w as obtained from the leaves following cultiv ation on MS medium supplemented w ith
BA 0. 2 mg爛L - 1牞TDZ 0. 01 mg爛L - 1 and NAA 0. 05 mg爛L - 1. Regener ated shoo ts could produce roo ts in
1牤2MS medium containing NAA 0. 01 mg爛L - 1 and the plantlets were successfully transfe rred to soil牞the
survival rate being up to 80%.
Key words牶Smallanthus sonchi folius牷cucumber mosaic virus牗CMV牘牷in v itro propaga tion牷vitrification
　　菊 薯 牗Smal lanthus sonchi folius syn.
Polymnia sonchi folia牘牞菊科植物牣原产于南美洲
安地斯山脉牞分布于海拔 3200 m左右的山地牞为
当地居民的传统食物牣20世纪 80年代传入欧洲
浙江大学学报牗农业与生命科学版牘
和日本牞受到广泛的关注和应用牣在日本牞其种植
面积达到 100 hm2牣其根茎含有大量的呋喃果聚
糖犤1牞2犦牞热量很低牞适合糖尿病和肥胖人群食
用犤3犦牞能够调整肠道内的微生物的组成和功能牞
并能促进矿物质特别是钙的吸收牞因此是一种良
好的糖类替代品牣它的叶子脱水后可以作为保健
茶牣因此近年来在国外受到广泛的关注牣
在菊薯的繁殖方面仍存在着很多问题牣它
的结实能力很低牞所结的种子经常不育犤4犦牞难以
萌发犤5犦牞因此生产上常以块根进行繁殖牣连续多
代营养繁殖牞容易造成病毒病的积累牞导致产量
和品质下降牣目前已报道侵染菊薯的病毒主要
有黄瓜花叶病毒犤5犦牣此外牞菊薯还因根结线虫病
害造成产量降低牞而使用无病害的种质牞其产量
可以提高 30 %犤6牞7犦牣组织培养牞尤其是利用茎尖
分生组织进行的离体快繁牞可以脱除植物病毒
及其他病原犤8犦牞对种质的复壮有极大的意义牣
对于菊薯的组织培养牞国外学者有过较多
的报道牣如 Hamanda 和 Silv a 对其腋芽增殖的
研究犤9牞10犦牷Santarém 对叶片诱导体细胞胚胎的
研究犤11犦等牣我国的相关报道较少牞仅见曾慎对
其离体快繁做了粗略的研究犤12犦牣本文选用菊薯
的茎尖进行脱毒牞再以无病毒苗的茎段和叶片
作为外植体牞对其启动 、诱导 、生根 、移栽过程进
行了系统的研究牞建立了快速高效的离体快繁
体系牞以适应工厂化生产的需要牣
1　材料与方法
1. 1　材　料
菊薯块茎由日本同行赠送牣
1. 2　茎尖生长点的剥离
将块茎置于细沙中在人工气候室牗25 ±
2牘℃中催芽培养 7 ～ 10 d牣待培育的芽长至 1 ～
2 cm 时牞选用腋芽作为外植体牣流水冲洗 30
min 后牞用 70%的酒精浸泡 30 s牞再用 0. 1%的
升汞牗内加2 ～ 3滴吐温 T-20牘消毒 8 min牞无菌
水冲洗 3 ～ 5次后用于茎尖生长点的剥离牣
1. 3　茎尖生长点愈伤的诱导和芽的再生
将 0. 3 mm 大小的茎尖分生组织接种到
MS 培养基上牞附加 BA 2 mg爛L - 1 +NAA 0. 1
mg爛L -1牣
1. 4　再生植株叶片病毒的检测
采用双抗体夹心酶联免疫吸附牗DAS-
ELISA牘法进行检测牣反应结果用连续波长生物
测读仪于405 nm 处读取OD值牣阳性对照采用
确定含 CMV 烟草新鲜叶组织牷阴性对照采用
健康烟草牣样品 OD405值牤阴性对照 OD405值明
显≥2牞判为阳性牞样品 OD405 值牤阴性对照
OD405值明显<2牞判为阴性牣各样品的 OD4 05值
用 SPSS 数据处理系统进行分析牣
1. 5　脱毒苗茎段的增殖培养
茎段接种到添加有 0. 1 ～ 2 mg爛L - 1 BA +
0. 01 ～ 0. 2 mg爛L - 1 NAA的 MS培养基上牣
1. 6　脱毒苗叶片愈伤的诱导和芽的再生
嫩叶切成 5 mm ×5 mm 切块后接种到培
养基上牣以 MS 作为基本培养基牞附加不同浓度
BA 、NAA 、TDZ 等牣
1. 7　生　根
当植株生长到 3 ～ 4 cm 高时牞将其转移到
生根培养基上牞生根培养基为 MS 或离子浓度
减半的 MS牞添加不同浓度的 BA 和 NAA牣
上述培养基除生根加入 2%蔗糖外牞其余
均加入 3 %蔗糖牞0. 56%的琼脂牞pH5. 8牣培养
条件牶温度牗25±2牘℃牞光强 35 μmol爛m - 2爛s- 1牞
光照 16 h爛d- 1的温室中培养牣
2　结果与分析
2. 1　茎尖分生组织的增殖
由于块茎数量较少牞因此培养茎尖分生组
织时未作培养基的筛选牞参考一般草本植物常
使用的激素种类与水平牣经过 50 d的培养牞茎
尖分生组织形成少量的愈伤组织和较多的从生
芽牗4 ～ 7个牘牣茎尖分生组织接种的成活率达到
71. 42%牗10牤14牘牞其死亡的主要原因可能是分
生组织剥离太小或材料受到解剖针的烫伤牣
2. 2　再生植株叶片病毒的检测
双抗体夹心酶联的酶标板经酶标仪扫描得
到 OD405值牞用 SPSS 数据处理系统进行分析的
数据见表 1牣
2. 3　脱毒苗茎段的增殖
为了迅速扩大无毒苗的数量牞我们分别以
脱毒苗茎段 、叶片作为外植体进行了扩大培养牞
52 第 3 2卷　
杨旭牞等牶菊薯牗Smal lanthus sonchi fol ius牘脱毒快繁的研究
表 1　脱毒处理的各样品酶联反应的 OD405值
T ab le 1　Th e OD 405 of DAS-ELISA af ter eliminat ing vi rus
阳性对照 阴性对照 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
OD 405
2. 346±
0. 219
0. 113±
0. 002
0. 255±
0. 0213
0. 594±
0. 025
0. 109±
0. 008
0. 129±
0. 028
0. 147±
0. 030
0. 138±
0. 014
0. 264±
0. 009
0. 273±
0. 021
0. 118±
0. 013
0. 110±
0. 008
样品OD 405牤阴性 OD405 2. 25 5. 25 0. 96 1. 14 1. 30 1. 22 2. 34 2. 42 1. 04 0. 97
　　经 OD值比对及颜色反应牞结果样品 1、2 、7、8未脱除黄瓜花叶病毒牞3、4 、5 、6 、9 、10已脱除黄瓜花叶病毒牞脱毒的成功率为 60%牣
并研究了植物激素的种类 、浓度及组合对外植
体增殖的影响牣
菊薯的茎段在增殖培养基上生长 5 d 后牞芽
开始出现牣大约两周后牞在茎段基部就会形成丛
生芽牗图 1A牘牣当培养基中 NAA浓度为 0. 01 mg
爛L - 1时牞BA的浓度从0. 1 mg爛L - 1到2 mg爛L - 1牞
菊薯茎段腋芽的增殖差异不显著牣当 NAA浓度
为0. 1 mg爛L -1时牞BA的浓度从 0. 1 mg爛L -1升
至2 mg爛L -1时牞茎段腋芽的增殖差异显著牞但
BA浓度为 2 mg爛L -1时牞尽管可以形成较多的丛
生芽牗平均 7. 25个牘牞但形成的芽容易发生玻璃
化牗18. 1%牘牣当 NAA 浓度升至 0. 2 mg爛L -1时牞
BA浓度为 2 mg爛L -1时可以形成较多的丛生芽牞
玻璃化苗的比例也较高牗23. 6%牘牣因此经 3次实
验重复比较得知茎段腋芽增殖的培养基以 MS
+BA 1 mg爛L - 1 +NAA 0. 1 mg爛L - 1生长最为
健壮牞既可以达到高的增殖倍数牞又能保证试管
苗的健壮牗表 2牘牣
表 2　不同浓度 BA和 NAA对茎段腋芽增殖的
影响牗培养 14 d牘
Table 2　Ef fect of dif feren t combinations of BA and NAA on
axillary buds prolif erat ion牗14 days cul tu re牘
处理牤牗mg爛L - 1牘 增殖倍数 玻璃化苗的百分率
BA0. 1+NAA0. 01 1. 87±0. 23 c 0. 00 e
BA1+NAA0. 01 2. 75±0. 45 bc 3. 41 d
BA2+NAA0牣01 2. 85±0. 34 bc 10. 29 b
BA0. 1+NAA0. 1 2. 00±0. 38 c 1. 42 d
BA1+NAA0. 1 4. 61±0. 52 b 3. 16 d
BA2+NAA0. 1 7. 25±0. 81 a 18. 16 ab
BA0. 1+NAA0. 2 3. 25±0. 45 c 6. 02 c
BA1+NAA0. 2 3. 81±0. 83 bc 7. 96 c
BA2+NAA0. 2 7. 00±0. 44 a 23. 68 a
2. 4　叶片愈伤组织的诱导和芽的再生
叶片接种到培养基上大约 1周后牞开始形成
白色或淡黄色的愈伤组织牞尤其是从叶片的切口
边缘首先出现牞并逐步扩大到整个叶片的表面牣
黄白色的愈伤组织能在各种培养基上成功诱导牞
愈伤的诱导率接近 100%牞各培养基对愈伤组织
的形成无差异牣当愈伤组织在培养基上生长一个
月后牞陆续有丛生芽从愈伤组织上分化形成牗图
1B牘牣其中在添加 BA 0. 2 mg爛L -1 +TDZ 0. 01
mg爛L - 1 +NAA 0.05 mg爛L - 1的培养基上愈伤组
织的芽分化率最高牞达到 85. 4%牞每块愈伤组织
上芽的数目最多达到了 14. 33个牷其次在培养基
中添加BA 0. 2 mg爛L - 1 +TDZ 0. 01 mg爛L -1牞愈
伤组织的芽分化率达到 78.1%牞每块愈伤组织
上芽的数目达到了 11. 71个牞二者之间差异不显
著牣由此可见低浓度的 BA 和 TDZ 对愈伤组织
分化和芽的诱导具有一定的累加和协同效应牞而
在培养基中添加 NAA对愈伤组织的分化影响
不大牣当培养基中添加较高浓度的 BA牗2 mg爛
L
-1牘或较高浓度的 TDZ牗0. 1 mg爛L - 1牘时牞愈伤
组织芽的分化率降低牞达到 40%左右牣每块愈伤
组织上芽的数目平均为 5. 98个牞并且不定芽出
了现不同程度的玻璃化现象牗表 3牘牣
表 3　不同浓度的 BA、TDZ和 NAA 对叶愈伤诱导和芽
再生的影响牗培养 30 d牘
T ab le 3 　Ef fect of dif ferent com bination s of BA牞TDZ and
NAA on buds regeneration f rom leaves牗30 day s
cu lture牘
处理牤牗mg爛L- 1牘　　 愈伤组织百分率
愈伤组织
分化率
不定芽
的数目
BA2+NAA0. 05 94. 3 a 46. 5 bc 3. 50±0. 38 c
BA2+NAA0. 5 87. 9 a 38. 6 c 4. 13±0. 71 c
TDZ0. 1+NAA0. 05 96. 1 a 53. 8 b 7. 29±1. 56 b
TDZ0. 1+NAA0. 5 92. 7 a 41. 4 c 9. 00±1. 30 b
BA0. 2+TDZ0. 01 89. 5 a 78. 1 a 11. 71±0. 74 a
BA0. 2+TDZ0. 1 91. 2 a 56. 7 b 8. 00±1. 20 b
BA0. 2+TDZ0. 01+NAA0. 05 93. 8 a 85. 4 a 14. 33±1. 26 a
2. 5　生根及移栽
将长约 1. 5 cm 的植株转移到生根培养基
53　第 1期
浙江大学学报牗农业与生命科学版牘
上牞研究了离子浓度牗MS牞1牤2MS牘、NAA 浓度以
及NAA与 BA组合对植株生根的影响牣结果发
现在所设计的各种培养基上牞菊薯都较容易生根
牗图1C牘牣通过比较根长与苗的生长状况可以看
出1牤2MS 的效果优于 MS牞较适宜的生根培养基
为 1牤2MS +NAA0.01 mg爛L - 1牞它不但能使生根
的时间提前牞提高生根率牞并且能使根健壮牣在培
养基中添加 BA 与 NAA 是为了实现一步成苗牞
结果可能是由于 BA的浓度过高而 NAA的浓度
太低牞故导致生根率降低牗表 4牘牣
表 4　不同浓度的 BA和 NAA对植株生根的影响
Table 4　Effect of medium牞BA and NAA concent rations on rooting of regenerated shoots
培养基牤牗mg爛L- 1牘　　 生根率牤% 根长牤cm 苗高牤cm
MS 0. 75±0. 07 ab 3. 60±0. 45 b 2. 95±0. 18 ab
MS+NAA0. 01 0. 79±0. 04 a 3. 81±0. 17 ab 2. 66±0. 22 ab
MS+BA0. 1+NAA0. 01 0. 68±0. 09 b 3. 86±0. 29 ab 2. 24±0. 12 b
1牤2MS 0. 80±0. 07 a 4. 43±0. 17 ab 2. 87±0. 11 ab
1牤2MS+NAA0. 01 1. 00±0. 00 a 5. 41±0. 19 a 3. 37±0. 16 a
1牤2MS+BA0. 1+NAA0. 01 0. 82±0. 08 a 4. 98±0. 20 a 3. 67±0. 20 a
2.6　驯化与移栽
采用常规炼苗法牞将已长根的试管苗移入
人工气候室牞在自然光下炼苗 7 ～ 10 d后牞打开
容器皿盖牞让小苗逐渐适应自然条件牣3 d 后牞
用清水仔细洗去组培苗根部的培养基牞然后将
苗定植于灭过菌的栽培基质中牗泥炭土∶蛭石
∶珍珠岩 =3∶1∶1牘牣注意遮荫保湿牞尤其是
在移栽后10 d内要做到全天遮荫牞晴天时注意
喷水牣约 1个月后植株成活牞移栽成活率可达
80%牗图1D牘牣
A-茎段腋芽的增殖牷B-愈伤组织的增殖和芽的再生牷C-生根的试管苗牷
D-移栽成活并生长两个月的小植株牣Bar = 1 cm牣
图 1　菊薯的离体培养
Fig. 1　 Propagation system of yacon
54 第 3 2卷　
杨旭牞等牶菊薯牗Smal lanthus sonchi fol ius牘脱毒快繁的研究
3　讨　论
　　菊薯的脱毒快繁还未见报告牞但该种植物的
组培报告较多牣Hamanda以 Polimnia sonchi folia
的节作为外殖体牞只研究了 2种 BA 浓度牗0. 1
mg爛L - 1牞1 mg爛L -1牘对其腋芽增殖的影响犤9犦牣结
果认为在MS 培养基添加 0. 1 mg爛L -1 BA 对节
部腋芽的增殖优于无激素处理的牣生根培养基中
添加 0.1 mg爛L - 1的 IBA对提高生根率有较大的
帮 助牣Santarém 报 告 了 以 Smallanthus
sonchi folius叶片作为外植体诱导体细胞胚胎的
发生牞认为较适宜的诱导体细胞胚胎发生的培养
基是在 MS 培养基中添加 0. 1 mg爛L - 1 BA +1
mg爛L - 1 2牞4-D或 1 mg爛L - 1 2牞4-D +1 mg爛L - 1
cinetin犤11犦牣在我们的研究中牞以节作为外植体牞1
mg爛L - 1 BA 与 0. 1 mg爛L -1NAA 组合对节部腋
芽的增殖效果较好牣以叶切块牗0. 5 cm×0. 5 cm牘
作为外植体牞在低浓度的 BA牗0. 2 mg爛L -1牘与
TDZ牗0. 01 mg爛L -1牘的 MS培养基中可以诱导叶
片愈伤组织的形成和芽的高频再生牣TDZ 作为
一种非嘌呤细胞分裂素类似物显示出比传统细
胞分裂素更强的作用牞其对腋芽繁殖和不定芽的
器官发生都有效牣我们在快繁中避免使用 2牞4-
D牞以防止植株变异的发生牣Silva在实验中发现
使用植株茎段上的腋芽作为外植体优于块茎上
的芽牞因为后者污染率较高犤10犦牣我们在实验中牞
将菊薯的块茎先用 50%多菌灵液稀释 500倍浸
泡30 min牞然后放在经阳光曝晒的沙中催芽牞这
样的处理使我们很容易得到了无菌的外植体牣在
实验中我们还发现牞菊薯继代培养过程中非常容
易发生玻璃化牞这与 Mogor在 yacon的离体快繁
中的报道一致牣因此如何控制玻璃化是本实验的
关键性问题牣我们发现降低培养基中离子浓度牞
例如使用离子浓度减半的 MS 培养基以及培养
基中不添加肌醇牞甚至选用离子浓度更低的
WPM 培养基都可以有效地控制玻璃化牣降低培
养基中的细胞分裂素的浓度牞继代培养时 BA使
用浓度降至 0. 2 ～ 0. 5 mg爛L - 1牞甚至不使用细胞
分裂素牞培养时提高容器中的透气性等措施均可
有效控制玻璃化苗的出现牣
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55　第 1期