全 文 ： [收稿日期] 2009-11-13;2010-05-07修回
[作者简介] 覃 成(1982-),男 ,研究实习员 ,在读博士 ,研究方向:中草药与主要农作物培育。 E-m ail:qincheng1001@163.com
[ 文章编号] 1001-3601(2010)05-0323-0199-03
苦苣菜总黄酮提取工艺及 HPLC法测定芦丁的含量
覃 成1 ,2 , 高 健2 , 罗希榕1
(1.贵州省遵义市农业科学研究所 , 贵州遵义 563102;2.四川农业大学玉米研究所教育部作物基因资源与遗传改
良重点试验室 , 四川 雅安 625014)
[摘 要] 采用正交试验方法考察乙醇体积分数 、提取温度 、提取时间 、料液比对苦苣菜总黄酮提取效果
的影响 ,寻求苦苣菜总黄酮提取最佳工艺 ,并进一步建立总黄酮中芦丁含量的高效液相色谱(HPLC)法测定方法 。结果表明 ,料液比对总黄酮提取量有显著影响 ,总黄酮提取量也受到提取温度和乙醇浓度的影响 。最
佳提取工艺:30%乙醇作为溶剂 ,提取温度 80℃,料液比 1∶20 ,提取时间 2 h , 此条件下总黄酮提取量达
6.065mg/mL。HPLC法测定黄酮中芦丁含量结果表明 ,在 0.025 ～ 0.075mg/mL 范围内线性关系良好(R=0.999 , n=5),平均回收率为 97.98%, RSD 为 2.53%。HPLC法简便快捷 、灵敏 ,结果准确 ,重现性好 ,可用于苦苣菜中芦丁含量的检测 。[关键词] 苦苣菜;总黄酮;芦丁;提取工艺;高效液相色谱法[中图分类号] S567.9 [文献标识码] A
Extraction Technology of Total Flavonoids from Sonchus oleraceus and
Determination of Rutin Content by HPLC
QIN Cheng
1 , 2 , GAO Jian2 , LUO Xi-rong 1
(1.Zunyi Institute of Agricultural Sciences , Zunyi , Guizhou 563102;2.Maize Research Institute , Sichuan
Agricultural University Key Laborator y of Crop Genetic Resources and Improvement , Ministry of
Education, Ya an , Sichuan 625014 , China)
Abstract:The orthogonal design w as used to study the effect o f ethano l concentrat ion , ex t ract
temperature , time and so lid/ liquid ratio on to tal f lav onoids ex t ract f rom Sonchus oleraceus.and establish a
dete rmination method of rutin content in to tal f lavonoids by HPLC.The results show ed that the solid/
liquid rat io had the signif icant ef fect on to tal f lavonoids quanti ty and the total f lavonoids quant ity w as
af fected by ex t ract ion temperature and ethanol concentration also.6.065 mg/mL total flavonoids can be
ext racted under the optimum ex tract techno logical condi tions of 30% ethano l , 1∶20 solid/ liquid ratio , at
80℃ for 2 h.The results of dete rm ining rutin content in total f lav onoids by HPLC showed that there w as
a good linear relationship betw een peak area and rutin content w ith 0.025 ～ 0.075 mg/mL and its mean
recovery and RSD were 97.98% and 2.53%, which indicates that HPLC w ith simplici ty , sensitivi ty ,
accuracy and good repetition can be used in dete rmination of rut in content in Sonchus oleraceus.
Key words:Sonchus oleraceus;total f lavonoids;rutin;ex t raction technolog y;HPLC
苦苣菜(Sonchusoleraceus L.)为菊科苦苣属的草
本植物 ,味苦 、性寒 ,具有清热解毒 ,凉血止血等作
用[ 1] 。苦苣菜总黄酮对试验性肝损伤具有明显的保
护作用 ,其酸性提取物具有抗肿瘤的功效[ 2] 。苦苣菜
含有木犀草素 、芹菜素及其苷类等黄酮类化合物[ 3] ,
既是良好的的中药材又是营养丰富的优良野菜 ,资源
丰富。对苦苣菜中总黄酮的提取工艺及高效液相色
谱(HPLC)法测定其中芦丁含量的研究未见系统报
道。为了更合理地利用苦苣菜资源 ,本研究采用正交
试验方法考察了乙醇体积分数 、提取温度 、提取时间 、
料液比对苦苣菜总黄酮提取效果的影响 ,并建立了
HPLC法测定苦苣菜总黄酮中芦丁的方法 ,为进一步
开发利用这一植物资源提供科学依据 。
1 材料与方法
1.1 材料
苦苣菜于 2009年 2月采自甘肃省天水山区 ,由
贵州大学教育部西南药用生物资源工程研究中心进
行鉴定 ,采用统一的干燥方法加工制样 ,避免背景干
扰 。所用试剂 NaNO 2 、Al(NO 3)3 、NaOH 、乙醇
(95%)等均为分析纯 ,甲醇为色谱纯 ,水为超纯水。
对照品芦丁为美国 Sigma 公司产品 , 纯度大于
98%。试验仪器:Ag ilent 1100高效液相色谱仪(美
国安杰伦), 752 型紫外可见分光光度计(上海普
析),Bio fuge 台式高速离心机(德国 Thermo), RE-
52旋转蒸发仪(上海亚荣), DS-1高速组织捣碎机
(上海精科), PHSJ-3F 精密酸度计(上海雷磁),电
子天平(德国赛利多斯)。
1.2 方法
1.2.1 苦苣菜总黄酮的测定方法
1)标准溶液的制备。精密称取 120℃干燥至
恒重的芦丁 20.00mg ,置 100mL 量瓶中 ,加乙醇适
量 ,置水浴上微热使其溶解 、冷却 ,加乙醇至刻度 ,摇
匀 ,量取上述试液 10.0mL ,置 100mL 量瓶中 ,用蒸
贵州农业科学 2010 , 38(5):199～ 201 Guizhou Ag ricultural Science s
馏水稀释至刻度 ,摇匀即得标准溶液。每 1mL 含芦
丁 0.02mg 。
2)标准曲线的制备。精密量取上述标准溶液
0.10mL 、0.20mL 、0.30mL 、0.40mL 、0.50mL 、
0.60mL ,分置 25mL 量瓶中 ,各加水至 6mL ;分别
加 5%N aNO 2溶液 1mL ,摇匀 ,放置 6min;分别加
10%Al(NO 3)3溶液 1mL ,摇匀 ,放置 6min;然后分
别加 4%NaOH 溶液 10mL ,并分别加水至刻度 ,摇
匀 ,静置 15min ,在 510 nm 测定吸收度 ,以浓度(C)
(mg/mL)对吸光度(A)作标准曲线 ,经回归处理得
方程 C=6.430A+0.012 , R=0.998 。
3)样品溶液的制备及含量测定 。将苦苣菜用
高速组织捣碎机充分捣碎 ,过 20目筛 , 120℃干燥至
恒重 ,称取其粉 10.00 g ,以正交试验设计的各个工
艺进行提取 、过滤 ,残渣用蒸馏水冲洗 3 次 ,合并滤
液 ,置 3 500 r/min离心 20min ,调节 pH =6 ,分别加
入聚酰胺直至上清液无黄酮反应为止 ,过滤 ,烘干吸
附黄酮的聚酰胺 , 用 60%甲醇索氏提取 12 次(约
4h),提取液用 60%甲醇定容至 100mL ,取 1mL 按
标准曲线法测定 ,由回归方程计算出样品中总黄酮
类化合物的总含量。
1.2.2 苦苣菜总黄酮的提取工艺
1)单因素试验确定各因素的适宜范围。对乙
醇体积分数 、提取温度 、提取时间 、料液比进行单因
素试验 ,检测各因素对苦苣菜总黄酮提取效果 ,为正
交试验因素及水平确立提供依据。
2)正交试验建立最佳工艺 。通过单因素试验结
果 ,选择正交试验因素及水平 ,建立苦苣菜总黄酮提
取的最佳工艺。
1.2.3 HPLC 法测定苦苣菜中芦丁的含量
1)色谱条件。色谱柱 C18(4.6mm×200mm ,
5μm);柱温:室温;流动相:甲醇∶水∶乙酸=42∶
57∶1;流速:1mL/min;检测波长:368 nm;样品进
样量:20μL。
2)供试品溶液的制备 。精密称取本试验提取
的苦苣菜总黄酮 20.00mg ,置 100mL 的量瓶中 ,加
30%的乙醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 , 45μm 的微孔
滤膜过滤即得。
3)对照品溶液的制备 。精密称取 10.00mg 芦
丁标准对照品 ,置 50mL 的量瓶中 ,加 30%的乙醇
溶解并稀释至刻度 ,再量取 1.0mL 置 10mL 的量
瓶中 ,加 30%的乙醇到刻度 ,摇匀 ,作为对照品溶
液 。
4)标准曲线的制备 。取 5.00mg 芦丁标准对
照品溶于 12.5mL 30%的乙醇中 ,得 0.400mg/mL
的标准品应用液。再将质量浓度依次稀释 2倍 ,分
别得到 浓 度为 0.200mg/mL 、 0.100mg/mL 、
0.05mg/mL 、0.025mg/mL 4个对照品应用液。分
别取 2μL 进样 ,重复 3次 。以进样量为横坐标 ,峰
面积为纵坐标 ,制备标准曲线。
2 结果与分析
2.1 苦苣菜总黄酮的提取工艺
根据单因素试验结果 ,确立了正交试验的因素
及水平(表 1),即 4 因素 3 水平。取苦苣菜制粗粉
100.00 g ,按 L9(34)正交设计进行浸提 ,得总黄酮提
取液 ,测定结果见表 2。方差分析结果表明 ,料液比
(D)对总黄酮提取量影响最大 ,其影响程度达极显
著水平(FD =115.849>F0.01);提取温度(B)、乙醇
浓度(A)次之 , 该两因素的影响程度达显著水平
(F B 、FA均大于 F 0.05);提取时间(C)影响最小。影
响因素的大小次序排列为:D>B>A >C 。最优组
合为 A 2 B3 C3D2 , 即最佳提取工艺:乙醇体积分数
30%,提取温度 80℃,提取时间 2 h ,料液比 1∶20。
此条件下 ,苦苣菜总黄酮提取量最高 。
表 1 苦苣菜总黄酮提取正交试验 L9(34)因素及水平
Table 1 The facto rs and levels of the o rthogonal design fo r to tal flavonoids ex tracted from S onchus oleraceus
水平
Level
A 乙醇体积分数/ %
Ethanol concentr ation
B 提取温度/ ℃
Tempe rature
C 提取时间/h
T ime
D料液比
Solid/ liquid r atio
1 15 60 1.0 1∶10
2 30 70 1.5 1∶20
3 45 80 2.0 1∶30
表 2 苦苣菜总黄酮提取正交试验结果
Table 2 The result of the o rthogonal design for to tal
flavonoids ex tracted from Sonchus oleraceus
处理序号
T reatment No.
总黄酮量
To tal f lavonoids
1 2.569
2 2.210
3 5.114
4 5.107
5 1.978
8 6.141
7 4.608
8 2.335
9 1.524
2.2 最佳工艺验证试验结果
取苦苣菜制粗粉 5.00g ,按最优工艺条件 A 2B3
C3D2进行试验验证 ,平行提取 3次并测定 ,其总黄
酮的平均提取量为 6.065mg/mL ,与正交试验方案
中的最高值非常接近 ,说明优化是成功的 ,适合于生
产应用 。
2.3 HPLC 法测定苦苣菜中芦丁的含量
2.3.1 标准曲线 以进样量为横坐标 ,峰面积为
纵坐标 ,制备标准曲线 ,得回归方程 y =102.00+
21 063 x ,R2 =0.999 , 结果表明 , 芦丁在 0.025 ～
0.075mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.3.2 精密度试验与稳定性试验 取对照溶液连
续进样 5 次 , 每次 10μL , 测得峰面积 , RSD =
0.48%,表明 ,本法精密度良好 ,色谱条件合理。另
取供试品溶液分别于 0 h 、4 h 、8 h 、12 h 、24h 测定总
—200— 贵 州 农 业 科 学 2010 , 38卷
黄酮中芦丁峰面积 , RSD 0.52%。表明 ,在 24 h 内
完成测定结果准确。
2.3.3 重现性试验 取苦苣菜总黄酮类样品 6
份 ,精密称定 ,分别制备供试品溶液进样测定 ,计算
总黄酮中芦丁的平均质量分数为 4.91mg/g , RSD
=2.29%。表明 ,重现性良好 。
2.3.4 回收率试验 取已知含量的苦苣菜供试样
品溶液 6份 ,每份分别加入一定量芦丁对照品溶液 ,
按供试样品溶液的制备方法进行含量测定 ,回收率
为 97.98%, RSD =2.53%。说明 , 加样回收率良
好。
2.3.5 样品的含量测定 分别精密吸取对照品溶
液和供试品溶液 10μL ,注入液相色谱仪 ,依上述色
谱条件测定含量 ,记录色谱图 ,按外标法计算 ,测定
芦丁的含量为苦苣菜中总黄酮的 55.44%, 即
2.525mg/mL(图 1 、图 2)。
2.3.6 结果分析 试验测得样品的峰面积是
1260.585/(mAU ·min), 代入回归方程得样品中
含芦丁为 0.055mg/mL , 芦丁标准品的含量为
0.1mg/mL , 则苦苣菜总黄酮中芦丁的含量为
55.00%。图谱中出现的 tR(retentiontime ,保留时
间)差异不大 ,色谱分离的芦丁标准品峰形对称 ,并
与相邻杂质峰能够达到基线分离 ,定量值准确。在
本实验中 ,图 2左侧出现了吸收度更高的杂峰 ,有待
进一步确定该成分并加以应用。
3 小结与讨论
苦苣菜总黄酮的提取方法已有文献报道[ 4-5] ,但
其采用的乙醇浸提法都是参考其他药用植物的提取
工艺 ,未对其中的影响因素进行分析和优化 。不同
药用植物中的药用有效成分和含量差异很大 ,不同
的工艺流程对其提取量有很大的影响 。本试验对苦
苣菜总黄酮的提取工艺进行了优化 ,从试验结果看
出 ,经优化后的提取工艺能显著提高总黄酮的提取
量 ,料液比 、提取温度和乙醇浓度是影响黄酮类化合
物提取率的关键因素。最佳提取工艺:乙醇体积分
数 30%,提取温度 80℃,提取时间 2 h ,料液比 1∶
20 。此条件下 , 苦苣菜总黄酮提取量最高 , 为
6.065mg/mL。
本研究还建立了 HPLC 法测定苦苣菜中芦丁
含量的方法 ,通过大量试验得出最优的色谱条件。
前人关于芦丁的测定方法多采用比色法 ,但存在操
作繁琐 、易受干扰及显色体系不够稳定的缺点。本
法具有样品处理简单 、分析周期短 、重现性好等优
点 ,可为苦苣菜的栽培 、采集与深加工综合利用及开
发提供参考 。
[ 参 考 文 献]
[ 1] 江苏新医学院.中药大辞典上册[ M] .上海:上海科学
技术出版社 , 1986:1286.
[ 2] 蒋 雷 , 王国荣 ,姚庆强.苦苣菜属植物化学成分及药
理活性研究进展[ J] .齐鲁药事 , 2007 , 26(11):670-
672.
[ 3] 徐 燕 ,梁敬钰.苦苣菜的化学成分[ J] .中国药科大
学学报 , 2005 , 36(5):411-413.
[ 4] 周桂芬 , 张 涵 ,吕圭源.苦苣菜中黄酮类化合物的含
量测定[ J] .中华中医药学刊 , 2008 , 26(1):218-220.
[ 5] 董 琳 , 付雪艳 ,张立明.苦苣菜总黄酮含量测定[ J] .
科协论坛(下半月), 2007(8):464.
(责任编辑:姜 萍)
—201— 第 5 期 覃 成 等 苦苣菜总黄酮提取工艺及 HPLC 法测定芦丁的含量