全 文 ：比色法测定通光藤的 C21甾体糖苷成分含量
沈　帆 , 陈道峰＊
(复旦大学 药学院 ,上海 200032)
[ 摘要] 　目的:建立通光藤中 C21甾体糖苷成分的含量测定方法 , 为通光藤药材的质量控制提供依据。方法:
样品用甲醇提取 ,经 ADS-7 大孔吸附树脂纯化 , 以通光藤苷-H 为对照品 , 浓硫酸-甲醇(4∶1)显色 ,在 325 nm 处测定
通光藤中C21甾体糖苷含量。结果:在 10.6 ～ 148.4μg 吸光度与含量成良好线性关系 , r=0.999 9(n =6), 3 个含量
的加样回收率分别为 95.4%, 97.7%, 96.9%, RSD<2.4%(n=5)。结论:本法操作简便 、快速 、灵敏 、重复性好 ,可以
作为通光藤药材质量评价的定量分析方法。
[ 关键词] 　通光藤;C21甾体糖苷;通光藤苷-H;比色法
[ 中图分类号] R 283　[ 文献标识码] A　[ 文章编号] 1001-5302(2005)22-1745-04
[ 收稿日期] 　2005-01-15
[通讯作者] 　＊陈道峰 , Tel:(021)54237453 , E-mail:dfchen@
shmu.edu.cn
　　通光藤系萝 科 Asclepiadaceae 牛奶菜属植物
通光藤 Marsdenia tenacissima (Roxb.)Wight et Arn.
的干燥茎。主要分布于云南 、贵州 、广西等地 ,在民
间被用于治疗多种癌症 ,具有平喘 、降压及抑制肺炎
球菌和流感杆菌等药理作用[ 1 ,2] 。通光藤富含 C21
甾体衍生物(主要是 C21甾体的糖苷)和多糖 ,还含有
少量生物碱及树脂等 ,其中C21甾体糖苷是通光藤抗
炎 、抗肿瘤及抗生育活性的物质基础[ 3 ,4] 。
文献曾报道有关通光藤苷-J的高效毛细管电泳
分析和通关藤注射液酚酸类成分指纹图谱的 HPLC
测定[ 5 ,6] ,但关于通光藤中 C21甾体糖苷成分的含量
测定方法文献尚未见报道 ,作者通过对样品提取分
离及纯化条件的考察 ,采用比色法 ,建立了通光藤中
C21甾体糖苷成分的含量测定方法 ,并测定了不同产
地通光藤药材中 C21甾体糖苷成分的含量 ,为通光藤
的质量控制提供了可靠的分析方法和依据。
1 　仪器与试药
756MC紫外可见分光光度计(上海第三分析仪
器厂),YCQ-300超声波器(上海凯波超声设备有限
公司),ZX-91旋转蒸发仪(中国科学院上海有机化
学研究所),电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)。
对照品通光藤苷-H(本课题组自制 ,经 IR ,MS ,
1HNMR , 13CMNR 确定其化学结构 , 纯度经 HPLC-
ELSD法测定 ,归一化法计算纯度大于 98%)。大孔
吸附树脂 ADS-7(天津南开和成科技有限公司),浓
硫酸 、甲醇均为分析纯 。
通光藤药材购于云南等地 ,经陈道峰教授鉴定。
2 　方法与结果
2.1　溶液制备
2.1.1 　对照品溶液
精密称定通光藤苷-H 对照品适量 , 用甲醇溶
解 ,制成 1.06 mg·mL-1的溶液。
2.1.2 　供试品溶液
精密称定通光藤药粉末(过 40目筛)0.5 g 左
右 ,准确加入甲醇 20 mL ,称重 ,超声提取 20 min ,
用甲醇补足减失重量 ,摇匀 ,过滤。精密吸取续滤
液 1 mL ,蒸去溶剂 ,精密加入 10 mL 水溶解 ,过滤 ,
精密吸取续滤液 1 mL ,加于已处理好的大孔树脂
柱 (玻璃柱 , 内径 9 mm , 大孔树脂 1.5 g ,湿法装
柱 ,用水 10 mL 预洗 ),先用 10 mL 水洗至还原糖
反应呈阴性 ,弃去水洗液 ,甲醇溶液 15 mL 洗脱至
苷类的浓硫酸显色反应呈阴性 ,收集甲醇洗脱液 ,
浓缩至干 ,加甲醇溶解 ,定容至 5 mL ,摇匀 ,作为供
试样品溶液 。
2.2 　方法学考察
2.2.1 　测定波长的选择
取对照品溶液 0.5 mL ,挥干溶剂 ,加新配制的
浓硫酸-甲醇(4∶1)5 mL 后于 60 ℃水浴中加热 60
min后取出 ,立即以冰水冷却 5 min ,摇匀 ,在冰水中
静置 10 min , 以浓硫酸-甲醇(4∶1)为空白对照 ,在
200～ 400 nm 扫描 ,测定结果显示最大吸收波长为
·1745·
第 30卷第 22期
2005年 11月 　　　　　　　　　　　　 中 国 中 药 杂 志China Journal of Chinese Materia Medica　　　　　　　
Vol.30, Issue　22
November , 2005
325 nm 。取样品溶液 ,同法操作 ,显示最大吸收波长
为325 nm 。
结果表明对照品和待测样品最大吸收波长一
致 ,选定 325 nm 作为测定波长。
2.2.2　显色条件的考察
2.2.2.1　显色温度的考察　精密吸取对照品溶液
40 μL ,挥干溶剂 ,加入新配制的浓硫酸-甲醇(4∶1)5
mL ,置于不同温度(20 , 40 , 50 , 60 , 70 , 80 ℃)的水浴
中加热60 min后取出 ,立即用冰水冷却 5min ,摇匀 ,
在冰水中静置 10 min ,在 325 nm 处测定吸光度值
(同时设各温度下的空白对照 , 平行 3 份),结果表
明 ,温度 60 ℃时吸光度值最大(60 ,70 , 80 ℃的吸光
度平均值为 0.306 ,RSD 0.33%)。确定60 ℃为显色
温度 。
2.2.2.2　显色时间的考察　精密吸取对照品溶液
40 μL ,挥干溶剂 ,加入新配制的浓硫酸-甲醇(4:1)5
mL ,置于 60 ℃水浴中加热不同时间(10 , 20 ,30 , 40 ,
60 ,70 ,80 ,90 min)后 ,同上操作 ,在 325nm 处测定吸
光度值(同时设各时间下的空白对照 ,平行 3份),结
果反应时间 60 min 时吸光度值最大(60 , 70 , 80 , 90
min的吸光度平均值为 0.309 ,RSD0.26%)。确定 60
min为显色反应时间。
2.2.2.3 　显色剂中浓硫酸浓度的考察　精密吸取
对照品溶液40 μL ,挥干溶剂 ,加入新配制的浓硫酸-
甲醇(1∶1 ,2∶1 ,3∶1 ,4∶1 , 5∶1 ,6∶1 ,7∶1)5 mL ,置于 60
℃水浴中加热 60 min 后 ,同上操作 ,在 325 nm 处测
定吸光度值(同时设各含量下的空白对照 ,平行 3
份)结果表明 ,浓硫酸-甲醇比为 4∶1时吸光度值最
高。确定显色剂为浓硫酸-甲醇(4∶1)。
2.2.2.4　显色稳定性的考察　取通光藤样品溶液 ,
挥干溶剂 ,加新配制的浓硫酸-甲醇(4∶1)5 mL ,置于
60 ℃水溶加热 60 min后取出 ,同上操作 ,以浓硫酸-
甲醇(4∶1)为空白溶液 ,在 325 nm 处每间隔 20 min
测定吸光度(测定完立即放回冰水中)。结果表明 ,
样品在冰水中放置稳定性较好(至少在 2 h内稳定 ,
吸光度平均值为 0.434 , RSD 1.5%),但在常温下操
作吸光度值变化较大(RSD 7.4%)。
2.2.3 　标准曲线绘制
精密吸取对照品溶液 10 , 20 ,40 , 60 , 80 ,100 ,120
μL ,挥干溶剂 ,按 2.2.2.4项下操作 ,在 325 nm 处测
定吸光度 。以对照品质量(μg)为横坐标 ,以吸光度
为纵坐标 , 绘制标准曲线。求得回归方程 Y =
5.232×10-3 X +0.158 3 , r =0.999 9 , 线性范围
10.6 ～ 148.4 μg 。
2.2.4 　样品溶液制备方法考察
2.2.4.1　提取方法 　提取溶剂:用不同的提取溶
剂[甲醇 、甲醇-氯仿(1∶1)、氯仿] ,同 2.1.2项下操
作 ,制备 9 份供试品溶液 ,挥干溶剂后按 2.2.2.4
项下操作 ,在 325 nm 处测定吸光度值 ,计算含量 ,
结果以甲醇为提取溶剂时总皂苷溶出量最多 ,且
含量相对稳定(RSD 2.3 %),所以选择甲醇作为提
取溶剂。
提取方式和时间:用不同提取方式(超声 ,加热
回流 ,索氏提取)处理不同时间 ,同 2.1.2项下操作 ,
制备21份供试品溶液 ,挥干溶剂后按 2.2.2.4项下
操作 ,测定吸光度值 ,计算含量。结果见表 1。
表 1　不同提取方式和时间处理通光藤药材
所得 C21甾类成分含量(n=3 , x±s)
提取方式 提取时间/min 含量/mg·g -1
超声　　 20 31.10±2.42
40 31.23±1.28
60 30.67±1.50
回流　　 30 26.86±3.34
60 27.78±2.26
90 28.69±2.43
索氏提取 29.05±4.41
　　结果表明 ,采用超声提取所测得的含量较回流
和索氏提取量高 ,且超声提取时间对提取量影响不
显著 ,所以决定采用超声提取 20 min 制备样品溶
液 。
提取溶剂用量:加入不同量甲醇(10 ,20 , 30 , 40
mL),同 2.1.2项下操作 ,制备 12份供试品溶液 ,挥
干溶剂后按 2.2.2.4项下操作 ,测定吸光度值 ,计算
含量。不同甲醇用量对 C21甾体糖苷成分含量进行
单因素方差分析 ,发现用 10 mL 甲醇提取与用 20 ,
30 ,40 mL提取有显著差异(P <0.01), 20 mL 与 30 ,
40 mL提取无显著性差异(平均含量为 31.61 , RSD
2.1%),所以确定提取溶剂用量为 20 mL ,即提取溶
剂用量为样品量的 40倍。
2.2.4.2　纯化方法的考察 　精密称定同一通光藤
药材粉末(过 40目筛)0.5 g 左右共 9份 ,分为 3组 ,
每组 3份 ,按 2.2.4.1项下处理后 ,其中一组用水饱
和的正丁醇 5 mL 萃取 4次 ,提取液用正丁醇饱和过
的水 10 mL洗涤后 ,合并正丁醇溶液 ,减压回收正丁
醇至干;一组同 2.1.2项下操作 ,挥干溶剂;一组经
·1746·
第 30卷第 22期
2005年 11月 　　　　　　　　　　　　 中 国 中 药 杂 志China Journal of Chinese Materia Medica　　　　　　　
Vol.30, Issue　22
November , 2005
甲醇超声后 ,精密吸取续滤液 100 μL ,蒸干溶剂 。9
份样品按 2.2.2.4项下操作 ,测定吸光度值 ,计算含
量 ,结果正丁醇萃取(26.20±1.76)mg·g-1 、大孔树
脂纯化为(31.21 ±0.78)mg·g-1 、甲醇超声为
(36.77±14.15)mg·g-1 。采用甲醇超声提取所测得
的含量虽较高 ,但极不稳定(RSD 38%),说明其他杂
质较多 ,而经正丁醇萃取和大孔树脂纯化后所测得
的含量相对稳定 ,大孔树脂所得的含量较高。所以
确定样品的纯化方法为大孔树脂洗脱 。洗脱时 ,流
速控制在 10 ～ 15 滴/min ,避免造成 C21甾体糖苷成
分损失使测定结果偏低。大孔树吸附树脂用量经反
复试验得出 ,其净化回收率达 99%以上 , RSD 小于
2%(n=5)。
2.2.5 　精密度试验
精密吸取对照品溶液 40μL ,按 2.2.2.4项下操
作 ,分别测定样品吸光度值 ,求得 RSD 2.5%(n =
6)。
2.2.6　重复性试验
按2.1.2项下平行制备 6份样品溶液 ,挥干溶
剂后按 2.2.2.4项下操作 ,分别测定样品吸光度值 ,
求得 RSD 2.3%(n=6)。
2.2.7　加样回收率试验
精密称定通光藤药材粉末(过 40 目筛)0.25 g
左右 ,分别加入对照品溶液(1.06 mg·mL-1)100 ,
200 , 300 μL , 按 2.1.2 项下操作 , 挥干溶剂后按
2.2.2.4项下操作 ,测定其吸光度值 ,计算含量 ,求得
加样回收率 ,见表 2。
2.3 　含量测定
取供试品溶液 5 mL , 按 2.2.2.4项下操作 ,在
325 nm测定其吸光度值 ,根据标准曲线 A=5.232×
10-3W +0.158 3 计算得到 C21甾体糖苷的进样量
W ,W×200/(W×1 000)得到生药中 C21甾体糖苷的
含量(mg·g-1)(W 为通光藤药材粉末的质量 ,精密
称定 5 g 左右)。结果见表 3。
3　讨论
3.1　含量测定方法
比色法[ 7]测定植物中甾体化合物具有显色灵敏
度高 、重复性好 ,且操作简便 、快速等优点 ,因此在甾
类成分测定中仍占有较为重要的地位。本实验选择
近年来文献常用的浓硫酸-甲醇法[ 7] ,与香兰素-高
氯酸-冰醋酸法[ 8]相比有显色稳定 、空白吸收小 、重
复性好的优点。
表 2　通光藤药材中通光藤苷-H 的加样回收率
称样量
/ g
样品含量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/ %
平均值
/ %
RSD
/ %
0.251 2 23.8 10.6 33.0 96.0 95.8 2.2
0.251 0 24.0 10.6 32.8 97.8
0.253 6 24.2 10.6 33.2 96.5
0.252 5 24.4 10.6 33.2 94.9
0.256 1 24.6 10.6 33.8 96.0
0.250 7 23.6 21.2 44.0 98.0 97.1 2.4
0.251 9 23.8 21.2 44.1 94.1
0.251 4 24.0 21.2 44.0 97.2
0.253 6 24.8 21.2 44.2 98.3
0.251 6 23.6 21.2 44.5 99.3
0.252 1 23.8 31.8 53.8 96.9 97.0 2.4
0.252 6 24.0 31.8 54.0 98.6
0.254 1 24.2 31.8 54.2 96.9
0.252 6 24.0 31.8 54.2 97.2
0.252 4 24.2 31.8 54.4 94.2
表 3　不同产地通光藤药材中的 C21甾体糖苷成分含量(n=3)
收集地点 收集日期 含量/mg·g -1 RSD/ %
云南丽江 2004-02 40.1 1.5
云南保山 2004-02 37.6 1.4
云南罗平 1 2004-02 42.0 2.2
云南罗平 2 2002-02 26.4 1.0
云南寻甸 2004-02 27.7 1.9
云南澜沧 2004-02 25.8 1.7
云南富源 2004-02 35.9 2.4
云南会泽 2004-02 40.3 1.2
云南崇明 2004-02 33.7 2.3
云南宜良 2004-02 36.5 1.4
云南宣威 2004-02 27.2 1.1
云南马龙 2004-02 29.4 2.5
云南师宗 2004-02 35.6 5.6
云南陆良 2004-02 36.4 1.0
云南临沧 2004-02 32.0 1.7
贵州盘县 1 2002-02 30.9 2.9
贵州盘县 2 2002-02 34.5 1.1
广西百色 2002-02 27.4 2.2
　　在比较不同加热时间和不同加热温度时发现 ,
当温度低于 60 ℃、时间小于 60 min时 ,加热温度越
高 、时间越长其吸光度值越高 ,但加热温度超过 90
℃,尤其是在沸水浴中加热 1 h以上 ,溶液出现部分
炭化而引起吸收峰形变差。
对通光藤同属多种植物的研究结果显示 ,它的
次生代谢产物C21甾体的糖苷是其抗肿瘤或抗生育
活性的物质基础[ 4 ,5] ,且分布具有特异性 ,所以以通
光藤中的 C21甾体苷作为其指征性成分 ,选择其中含
量较高的通光藤苷-H作为对照品进行含量测定 。
3.2 　供试品中 C21甾体糖苷成分纯化方法学考察
·1747·
第 30卷第 22期
2005年 11月 　　　　　　　　　　　　 中 国 中 药 杂 志China Journal of Chinese Materia Medica　　　　　　　
Vol.30, Issue　22
November , 2005
通光藤中除了 C21甾体糖苷外 ,还含有少量多
糖 、生物碱及树脂 ,其中多糖为含量测定的主要干扰
成分[ 4 ,5] 。C21甾体糖苷具有甾体皂苷的性质 ,经浓
硫酸加热处理后 ,其可见光吸收一部分来源于糖基
的糠醛生成反应 ,一部分来源于苷元 ,所以样品中的
游离糖基及 C21甾体糖苷以外的糖苷对测定结果有
很大影响。样品经超声处理后通过大孔吸附树脂 ,
用水洗脱可将游离多糖除去 ,用甲醇洗脱可保留通
光藤中 C21甾体糖苷成分而除去少量在可见光区有
吸收的其他杂质 ,避免对测定的干扰。
3.3　通光藤药材的品质
含量测定结果发现 ,不同产地的通光藤药材中
C21甾体糖苷成分的含量差别较大 ,其中云南丽江 、
会泽和罗平的含量最高(40.09 ～ 41.99 mg·g-1),云
南保山 、富源 、崇明 、宜良 、师宗 、陆良和临沧的含量
较高(37.57 ～ 32.02 mg·g-1),云南寻甸 、澜沧 、宣威
和马龙的含量较低(25.79 ～ 29.36 mg·g-1),贵州的
(30.89 , 34.50 mg·g-1)较广西的(27.36 mg·g-1)含
量高;同一地区的不同批次药材中 C21甾体糖苷成分
的含量差别也较大。
综上所述 ,从 C21甾体糖苷成分的含量来看 ,通
光藤商品药材的质量不稳定 ,对通光藤药材建立含
量测定是很有必要的。
[致谢] 　本教研室邓君博士提供通光藤苷-H 对照品 ,
云南省建坤肿瘤药物研究所李建坤副研究员提供通光藤药
材。
[参考文献]
[ 1] 　中国药科大学.中药辞海.第二卷.北京:北京医药科技出版
社 , 1996.2360.
[ 2] 　张民庆.抗癌中药的临床研究.北京:人民卫生出版社 ,
1998.100.
[ 3] 　全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编.第二版.北京:人
民卫生出版社 , 1996.
[ 4] 　陈纪军 ,张壮鑫 ,张润珍 ,等.裂冠牛奶菜的化学成分.云南植
物研究 , 1990 , 12(1):93.
[ 5] 　刘峰群 ,曹　红 ,靳守东 ,等.通关藤注射液酚酸类成分指纹图
谱的 HPLC测定.中成药 , 2003 ,3(25):175.
[ 6] 　邢旺兴 ,程荣珍 ,林培英 ,等.中药通光藤中通光藤苷-J的高效
毛细管电泳分析.第二军医大学学报.2004 , 24(12):1338.
[ 7] 　王　琴,张　虹 ,王洪泉.黄精及玉竹中甾体皂甙成分的测定.
中华临床医药 , 2003 ,4(2):75.
[ 8] 　张　新 ,王志伟.娑罗子中总皂甙的比色测定.天然产物研究
与开发 , 2000 , 1(12):28.
Deter mination of C21 steroidal glycosides in Marsdenia
tenacissima by colorimetric method
SHEN Fan , CHEN Dao-feng
(School of Pharmacy , Fudan University , Shanghai 200032 , China)
[ Abstract] 　Objective:To establish a quantitative method to deter mine C21 steroidal glycosides in Marsdenia tenacissima.Method:
Methanol was used as the extraction solvent and the samples were purified by macroporous resin ADS-7.A mixture of sulfuric acid-methanol
(4∶1)was used as color-producing reagent.The absorbance was measured at 325 nm.Result:There is a good linearity(r=0.999 9 , n=6)
within the range of 10.6-148.4μg.The average recoveries of tenacissoside-H at different concentrations were 95.8% to 97.1%with RSD less
than 2.4%(n=5).Conclusion:This method is reliable as a quantitative analytical method for the quality assessment of M.tenacissima.
[ Key words] 　Marsdenia tenacissima;C21 steroidal glycosides;tenacissoside-H;colorimetric method
[ 责任编辑　刘　 ]
《中国中药杂志》荣获中华人民共和国新闻出版署
组织的第三届国家期刊奖百种重点期刊
·1748·
第 30卷第 22期
2005年 11月 　　　　　　　　　　　　 中 国 中 药 杂 志China Journal of Chinese Materia Medica　　　　　　　
Vol.30, Issue　22
November , 2005