全 文 ：收稿日期:2007-03-29;　修订日期:2007-06-12
基金项目:江西省教育厅资助项目(No.2006-253)
作者简介:张文平 (1969-),男(汉族),江西南城人 ,现任江西赣南医学院
副教授 ,硕士学位 ,主要从事中草药抗感染与免疫研究工作.
千里光水浸液对大肠埃希菌 R质粒的消除作用
张文平 , 曹镐禄 , 张文书 , 黄　真
(赣南医学院 ,江西 赣州　341000)
摘要:目的 探讨千里光对大肠埃希菌 R质粒消除作用。方法 对尿路感染患者尿液中分离的大肠埃希菌 R质粒进行检
测 ,并选用中药千里光水浸液对该质粒进行了体外 、体内消除实验。体外实验:千里光水浸液亚抑菌浓度分别作用大肠埃希
菌 24, 48, 72 h后, 影印培养 ,计数消除子数;体内实验:建立肠道去污染小鼠动物模型后 ,经口感染大肠埃希菌 , 同时给千里
光水浸液, 灌胃给药 ,每只 2mg/d, 分别于给药后 24 , 48, 72 h后处死小鼠, 分离培养细菌, 计数消除子数。消除子经质粒抽
提琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果 体外药物作用 24, 48, 72h后 , R质较消除率分别为:0.2%, 2.2%, 3.8 %;SDS对照组分别为
12.1%, 14.9%, 23.7%,体内药物作用 24, 48, 72 hR质粒消除率分别为 0%, 3.1%, 14.4%, 对照组分别为 0%, 0.1 %,
0.1%。结论 中药千里光水浸液对大肠埃希菌 R质粒于体内 、体外均具有消除作用, 体内消除作用强于体外。
关键词:千里光;　大肠埃希菌;　R质粒;　消除
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2007)12-2929-02
EliminationEfectofSenecioscandensBuch-Ham LiquidExtractsonRPlasmidof
Escherichiacoil
ZHANGWen-ping, CAOGao-lu,ZHANGWen-shu,HUANGZhen
(GannanMedicalColege, Ganzhou, Jiangxi341000 , China)
Abstract:ObjectiveToexploretheeliminationeffectofSenecioscandensBuch-Ham(SSB)LiquidExtractsonRplasmid
(RP)ofEscherichiacoil.MethodsRPofE.coilwereisolatedfromtheurineofurinarytractinfectionpatients, andtheelimina-
tiontestofSSBextractsontheseplasmidswasperformedinvitroandinvivo.Aftersub-bacteriostaticconcentrationofSSBex-
tractstreatedE.coilinvitrofor24h, 48hand72h.Replicaplatingandcountingofcoloniesresistingtoantibioticswerecarried
out.Germ-freemiceinintestinewereorallyinoculatedwithE.coil, thenwaterdecoctagentofSSBwasgivenorallyin2mg/d
permouse, EliminantofE.coilwasidentifiedbyreplicaplatingandcolonycountingafter24 h, 48hand72 h, respectively.RPe-
liminatedbodieswereidentifiedthroughelectrophoresiswithagarosegel.ResultsAfterdrugactedonE.coil24 h, 48hand72h
invitrorespectively, eliminationrateofRPinSSBtestedgroupwere0.2%, 2.2%, 3.8%, whileincontrolSDSgroupwere
12.1%, 14.9%, 23.7%, respectively;24 h, 48h, 72hinvivo, eliminationrateofRPintestgroupwere0, 3.1%, 14.4%,
andincontrolgroupwere0, 0.1%, 0.1%, respectively.ConclusionSSBhasstrongfunctiontoeliminateRPofE.coilinvivo
andinvitro.Theeliminativeeffectisstrongerinvivothaninvitro.
Keywords:SenecioscandensBuch-Ham;　Escherichiacoil;　Rplasmids;　Elimination
　　大肠埃希菌作为条件致病菌是医院内感染最常见病原菌之
一 , 其耐药菌株引起的感染日益增多。细菌的耐药性由染色体或
耐药质粒(R质粒)介导 , 耐药质粒可通过接合 、转化 、转导等方
式在不同菌种之间传递 ,使敏感菌成为耐药株 , 造成了 R质粒的
流行 [ 1] 。影响 R质粒传播的因素主要是由于抗生素的滥用 , 即
抗生素的使用起到了选择作用 ,使含有 R质粒的菌株得以生存 、
扩增。将 R质粒从宿主菌中消除 , 使其恢复对抗生素的敏感性 ,
是临床治疗多重耐药菌感染的新思路 [ 2] 。用人工方法消除 R质
粒国内外曾有报道 [ 3] 。 本实验用中药千里光水浸液作为消除
剂 , 对大肠埃希菌 R质粒进行体内 、体外消除实验 , 观察千里光
对耐药质粒的消除作用 ,探讨其临床应用的可能性。
1　材料
1.1　菌株 大肠埃希菌(E.coil),从赣南医学院第一附属医院尿
路感染患者尿中分离并鉴定为大肠埃希菌。
1.2　药品与试剂 千里光购于江西赣南医学院附属医院中药
房 , 取干燥生药 50 g, 加适量水煮沸 30 min,过滤 ,药渣再加水煮
沸 30 min,过滤 , 合并两次滤液 ,浓缩到 50 ml,即得 1 g/ml千里光
水浸液。营养琼脂为上海医学化验所产品;LB肉汤培养基(每毫
升中含蛋白胨 1 g, 酵母抽提物 5 g, 氯化钠 5 g, 葡萄糖 1 g, pH
7.2);十二烷基硫酸钠(SDS)购于华美生物工程公司;四环素
(TC)、氨苄青霉素(AP)、链霉素(SM)均系国产标准品。
1.3　动物 昆明小鼠 30只 , 6 ～ 8周龄 ,体重 18 ～ 20g,雌雄不限 ,
由赣南医学院实验动物部提供。
2　方法
2.1　实验菌耐药性测定 以平板稀释法 [ 4]测定各抗生素对大肠
埃希菌的最小抑菌浓度(Minimalinhibitoryconcentration, MIC)。
2.2　体外消除实验 按文献 [ 5]方法进行。将大肠埃希菌接种于
LB肉汤培养基中 , 37℃过夜振荡培养 , 调菌液浓度 1.5×109cfu/
ml。取菌液 5 μl分别加入含不同浓度千里光(自 100 mg/ml开
始 , 倍比稀释至第 7管 ,第 8管不加药为空白对照管)的 LB肉汤
培养基中 ,每管 LB培养基总量为 1 ml。 37℃振荡培养 24, 48, 72
h后取出 , 观察细菌生长现象 , 判定亚抑菌浓度。从亚抑菌浓度
管中取 50μl菌液分别划线接种于 10块 4%琼脂平板培养基上 ,
37℃培养 24 h,待长出单个菌落后 , 挑取单个菌落 1 000个 ,以影
印培养法 ,依次转接于含 TC(20μg/ml), SM(40μg/ml)或 AP(20
μg/ml)的药物平板上以及不含药物的 4%营养琼脂平板培养基
上 , 37℃培养 24 h, 观察并记录结果。挑取在无药平板上生长而
在含药物平板不长的菌落 ,即初步确定为 R质粒消除子 , 再经相
同抗菌药物平板复试以后 , 最后确定为 R质粒消除子。 将搜集
到的消除子与原菌液同时按文献 [ 6]快速抽提质粒 DNA, 0.7%琼
脂糖凝胶电泳 ,以检测质粒带的消失情况。另设 SDS阳性对照
组和空白对照组 ,消除实验方法同上。
2.3　体内消除实验
2.3.1　建立大肠埃希菌肠道感染的小鼠模型 [ 7] 将实验用小鼠
均置消毒过的塑料笼内于无菌箱内饲养。第 1天 ,每只小鼠经灌
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2007VOL.18NO.12 时珍国医国药 2007年第 18卷第 12期
胃法给四环素 5 mg, 红霉素 1 mg, 8 h后给利福平 6 mg。另外 ,饲
以经高压灭菌的饮料块和含四环素(0.5 mg/ml), 红霉素(0.01
mg/ml)的无菌饮水。第 2 ～ 3天每只小鼠给利福平 6 mg, 第 4 ～ 5
天每只小鼠给四环素 2 mg, 用大肠埃希菌 (菌液浓度 1.5 ×109
cfu/ml)0.2 ml/只经口感染 ,饮水和饮料同前。
2.3.2　大肠埃希菌R质粒的消除 从第 6天起将模型小鼠隔离 ,
并随机分 6组 , 即 3个实验组及相应对照组 ,每组 5只。 实验组
灌胃给予千里光水浸液(每只 2 mg/d), 对照组不给任何药物。
同时 , 所有小鼠均禁食 , 但给经煮沸消毒的含蔗糖(10%)、氯化
钠(0.8%)、碳酸氢钠(0.10%)的饮水。给药后分别于 24, 48, 72
h后处死小鼠 , 取盲肠内容物接种在 4%营养琼脂平板培养基上 ,
37℃培养 24 h,分离单个菌落 , 每组随机挑取 1 000个菌落影印
培养 , 计数消除子数 , 再经质粒抽提 , 琼脂糖凝胶电泳鉴定 , 步骤
同上。
2.4　统计学分析 各组实验数据釆用 SPSS10.0统计软件处理 ,
进行采用 χ2检验。
3　结果
3.1　大肠埃希菌对抗生素耐药性检测结果 TC, SM, AP对大肠
埃希菌 MIC均 >800 μg/ml, 呈高度耐药 , 千里光对大肠埃希菌
MIC为 12.5 mg/ml。
3.2　体外消除实验 千里光体外作用大肠埃希菌 24 h后 , 其消
除结果与空白对照组比较 ,无明显差异(P>0.05);体外作用 48
h与 72 h后 ,其消除结果与空白对照组比较 , 有极显著性差异(P
<0.01), 表明千里光体外有消除大肠埃希菌 R质粒作用 , 但其
消除作用低于 SDS对照组(P<0.01)。结果见表 1。
表 1　千里光水浸液作用不同时间后对大肠埃希菌R质粒体外消除的影响
组别 消除子(株)
24h 48h 72h
消除率(%)
24h 48h 72h
千里光水浸液 2 22 38 0.2 2.2 3.8
SDS对照 121 149 237 12.1 14.9 23.7
空白对照 0 1 0 0 0.1 0
3.3　体内消除实验 千里光体内作用大肠埃希菌 24h,其消除结
果与对照组经卡方检验 P>0.05,无显著性差异;48 h与 72h消
除结果经卡方检验 P<0.01,有极显著性差异 , 表明千里光体内
对大肠埃希菌 R质粒也有消除作用。结果见表 2。
表 2　千里光水浸液作用不同时间后对大肠埃希菌R质粒体内消除的影响
组别 消除子(株)
24h 48h 72h
消除率(%)
24h 48h 72h
千里光水浸液 0 31 144 0 3.1 14.4
对照 0 1 1 0 0.1 0.1
3.4　消除 R质粒的表型 千里光在小鼠体内 R质粒的消除实验
中 , 试验菌株的耐药性可表现为单一或多重(二耐以上)耐药性
的丢失 , 而体外消除实验和对照组 R质粒的丢失表现为单一耐
药性的丢失。
3.5　消除子的质粒检测结果 原始株与消除子经碱裂解法快速
抽提质粒 DNA, 琼脂糖凝胶电泳观察发现消除子均都丢失 1至
数条质粒带 , 表明在千里光作用下 , 质粒被消除。
4　讨论
质粒编码所产生的细菌耐药性和毒力等问题 ,给人类疾病治
疗带来了很大困难 ,肠道耐药基因库的存在是肠道致病性耐药菌
株流行的潜在危险。消除耐药质粒 , 使耐药菌株恢复敏感性 , 对
于治疗临床上由耐药菌导致的感染和阻断耐药性和毒力的传播
都有非常重要的意义。
质粒具有自然丢失与人工消除的特性 , 但 R质粒自发消除
很缓慢 , 其消除频率为 10-2 ～ 10-8[ 8] 。自 20世纪 60年代以来 ,
人们发现各种理化因素均可消除 R质粒 , 如高温培养 、紫外线照
射 、电穿孔法 、SDS、高温 SDS双重处理 、嗅化乙锭 、丫啶橙等可影
响 R质粒消除 , 抗生素也具有 R质粒消除作用 [ 3] 。 R质粒消除
后细菌的耐药性也随之丧失 , R质粒与染色体突变不同 , R质粒
消除后其耐药性不再恢复 ,除非外源 R质粒再次转入 , 但由于这
些物理化学因素对人体均有较强的毒副作用 , 不便投入临床应
用 [ 3] 。中药属于天然植物药 ,毒副作用小 , 应用安全。 中药的质
粒消除研究始于 20世纪 80年代 , 1983年徐建国等报道用黄连素
消除去污染小鼠体内痢疾杆菌的 R因子;1985年陈小英 [ 2]报道
用大黄素消除金黄色葡萄球菌的耐药质粒 ,此后陆续有相关研究
报道 , 但多为抗菌能力强的清热解毒或清热燥湿类中药。本实验
选用的千里光为对大肠埃希菌具有较强抑制作用的清热解毒类
中药 , MIC为 12.5 mg/ml, 故选其作为消除剂。结果表明:千里光
对大肠埃希菌 R质粒具有消除作用 ,且体内消除作用强于体外 ,
其可能原因是在体内细菌不仅受到药物的作用 ,同时受到机体的
内环境 ,特别是免疫因素影响。 R质粒的消除不仅表现为单一耐
药性的丢失 ,还表现为多重耐药性的丢失;消除 R质粒最佳时间
为体外 48h(P<0.01),体内 72h(P<0.01)。
中药千里光在临床上不但可用于体外 , 也可用于体内 , 其抗
菌能力的强弱与其对细菌质粒消除率的大小之间是否存在相关
性还不清楚 ,因此有关千里光水浸液对 R质粒的消除机制有待
进一步研究。
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