全 文 ：用分子标记定位源于中间偃麦草的
小麦抗黄矮病基因＊
张增艳　辛志勇　马有志　陈　孝　徐琼芳　林志珊
(中国农业科学院作物育种栽培研究所 ,农业部作物遗传育种重点开放实验室 ,北京 100081)
摘要　　利用生物素标记的中间偃麦草基因组总 DNA 作为探针 ,对以 L1为抗源的
抗黄矮病小麦新品系 H960642的有丝分裂中期染色体进行原位杂交 ,结果表明:
H960642是纯合的小麦-中间偃麦草易位系 ,携有抗黄矮病基因的中间偃麦草染色体
片段易位到小麦染色体端部.采用小麦第 7部分同源群上的 8个 RFLP 探针进行
Southern分析 ,结果表明:H960642的小麦 7D染色体长臂末端片段被中间偃麦草染色
体7X长臂末端片段所取代 ,即该染色体为 T7DS·7DL-7XL ,易位断点位于 Xpsr680和
Xpsr965之间 ,距着丝点的遗传距离约90 ～ 99 cM.筛选出了与 7X上抗黄矮病基因紧
密连锁的 RFLP 标记 psr680和 psr687.将该抗黄矮病基因定位于 7XL 端部 、RFLP 遗
传图 Xpsr680与Xpsr687位点附近.Ep-1同工酶分析结果佐证了 RFLP 分析结果.
关键词　　大麦黄矮病毒　中间偃麦草　易位系　基因组原位杂交　RFLP
基因组原位杂交(Genomic in situ hybridization ,GISH)是利用某物种基因组DNA作探针与染
色体杂交 ,直接检测染色体构成的一种分子标记 ,能够准确地显示出外源染色体及其片段的数
目 、大小及其物理位置.RFLP(Restriction fragment length polymorphism)标记是基于限制性片段
长度差异的一种分子标记 ,是构建遗传图谱 、检测遗传变异 、鉴定异源染色体 、定位和标记基因
等研究的有力工具.
小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus ,BYDV)引起的小麦重要病害之一.
迄今 ,小麦属内尚未发现良好的 BYDV抗源 ,而小麦野生近缘植物中的中间偃麦草(Thinopyrum
intermedium (Host)Barkworth and Dewey),至少含有 2个抗 BYDV 基因[ 1 , 2 ,3] .Cauderon将中间偃
麦草的1对 7X染色体转移到普通小麦Vilmorin 27中 ,育成了异附加系 L1(2n=44)[ 1] .辛志
勇等鉴定出 L1高抗黄矮病 ,并以 L1为抗源 ,将携有抗 BYDV 基因的 7X染色体片段导入到小
麦中 ,育成了抗 BYDV小麦-中间偃麦草易位系[ 2] .研究易位系的遗传基础 ,是制定育种策略
的重要依据.对抗 BYDV基因进行标记和定位 ,可为标记辅助育种 、提高育种效率以及分离克
隆该抗 BYDV基因奠定基础.本文利用 GISH 和 RFLP 标记技术 ,准确鉴定了抗 BYDV 小麦-中
间偃麦草易位系 ,定位了该易位系中抗 BYDV基因.
　　　1998-10-28收稿 , 1999-02-08收修改稿
　　＊国家“八六三”高技术基金资助项目和国家自然科学基金资助项目(批准号:39680027)
中 国 科 学 (C　辑)　　　　　　 　
第 29 卷　第 4期 SCIENCE IN CHINA(Series C)　 1999 年 8月
1　材料与方法
1.1　材料
(1)H960642是从“中 8601×4/4/中 7902/3/CSph×2/L1∥CSN5BT5D”组合的 F6 代中 ,选
出的 2n=42的抗 BYDV小麦新品系.
(2)抗病池和感病池:在H960642自交后代(F7)中 ,随机选出对 BYDV-GAV株系具抗性的
单株 10个(R1 ～ R10),分别提取DNA ,等量混合成一个抗病(R)池.F6 代一个感病单株的自交
后代(F7)全部感病 ,从此株行中随机选 10个单株提取 DNA ,等量混合成一个感病(S)池.
(3)RFLP 实验材料除了抗病池和感病池外 ,还以与易位系有关的小麦亲本Vilmorin27 ,中
8601和普通小麦中国春(CS)作感病对照.并对照 CS 标准的限制性酶切片段图谱 ,定位抗
BYDV基因和易位断点的位置.另外 ,二体异附加系 L1和中间偃麦草(Th)作为抗病对照.
1.2　方法
1.2.1　基因组原位杂交(GISH)　　按照马有志等人[ 4]方法进行.采用随机引物法 ,以 Biotin-
16-dUTP标记的中间偃麦草基因组 DNA作为探针.Biotin标记的探针用 FITC-Avidin进行检
测 ,PI复染小麦染色体背景.在蓝色(B)荧光激发光下 ,中间偃麦草染色体呈现黄绿色杂交信
号 ,小麦染色体呈现红色.
1.2.2　RFLP 分析　DNA的提取 、酶解 、电泳 、Southern转移 、探针标记 、杂交 、洗脱 、放射自显
影 ,均采用 Sharp等人[ 5]和Devos等人[ 6]提出的方法.所用的尼龙膜为Hybond-N+(Amersham).
DNA酶解 ,采用 EcoRⅠ , EcoRⅤ , HindⅢ ,Dra Ⅰ等 4种常用的 6 个碱基识别位点的限制性内
切酶 ,限制性内切酶为华美生物工程公司出品.α-32P-dCTP 为中国亚辉生物工程公司产品.
1.2.3　肽链内切酶(Ep)-1等电聚焦电泳分析　　参照 Koebner等人[ 7]方法进行.
1.3　DNA探针
由英国 John Innes Centre 剑桥实验室M.D.Gale和 K.M.Devos惠赠.
2　结果与分析
2.1　基因组原位杂交分析
用生物素(16-dUTP-biotin)标记的中间偃麦草基因组总 DNA 作为探针 ,以 CS 基因组总
DNA作封阻 ,对 H960642根尖体细胞染色体进行原位杂交.有丝分裂中期的 GISH 表明 ,
H960642的42条染色体中有 40条染色体呈红色 ,2条染色体端部呈黄绿色 、其余部位呈红色 ,
即H960642由 20对小麦染色体和 1对小麦-中间偃麦草易位染色体组成 ,中间偃麦草染色体
片段易位到该染色体端部 ,大小约为易位染色体臂长度的 10%(图版 Ⅰ ,附本刊后 ,下同).该
结果直观地表明了H960642为纯合的小麦-中间偃麦草小片段易位系.
2.2　RFLP分析
2.2.1　探针的选择　　根据辛志勇等人[ 2] 报道 ,抗源 L1中抗 BYDV基因位于附加的中间偃
麦草染色体 7X长臂上.根据近缘植物基因组间同源区段排列顺序存在的共线性关系[ 8]和
GISH 结果提供的信息 ,选用位于小麦第 7部分同源群上的 8个探针 ,其中长臂探针 6个和短
臂探针2个(图 1(a)),对抗病池 、感病池及其亲本进行 Southern杂交与分析.
414　 中　　国　　科　　学　　(C　辑) 第 29卷
图 1　使用探针在 7D连锁群分子遗传图谱上
的位置
(a)T7DS·7DL-7XL小麦-中间偃麦草易位染色体 ,(b)
左列数字为遗传距离 , 单位为 cM.(b)中黑色部分表
示 7XL 片段
2.2.2　Southern分析
Southern分析表明:8个探针和 4种限制性内切
酶组成 32个探针/酶组合.其中 6个探针 ,包括短
臂探针 psr119 , psr152 和长臂探针 psr690 , psr129 ,
psr547 ,psr965 ,与 4种限制酶组成 24个组合 ,在抗
病材料和感病材料间未检测到多态性;位于长臂末
端的探针 psr680和psr687 ,分别与 EcoRⅠ和 Hind Ⅲ
酶切DNA片段杂交 ,抗病材料与感病材料间显示出
多态性(图版Ⅰ-B ,C).
探针 psr680与 EcoR Ⅰ酶切 DNA片段 Southern
杂交结果表明(图版 Ⅰ-B),所有抗病材料 ,包括中
间偃麦草 、L1 、抗病池和抗病单株 ,均具有 9.0 kb 左
右的中间偃麦草染色体 7XL 特异带 ,感病池与小麦
品种无此带 ,表明 psr680与抗黄矮病基因紧密连
锁 ,抗病基因位于 7XL 上 、Xpsr680附近.图版 Ⅰ-B
同时表明 ,除 L1外所有抗病材料均缺失约 3.0 kb
的小麦7DL 特异带.说明H960642中 ,包含Xpsr680
位点的小麦染色体 7D L 末端片段 ,被含相应位点
的中间偃麦草染色体 7XL片段取代.
psr687与 Hind Ⅲ酶切 DNA片段的 Southern 杂
交结果表明(图版 Ⅰ-C),所有抗病材料均具有 4.6
kb左右的中间偃麦草染色体7XL 特异带 ,感病材料
没有此带 ,表明 psr687与抗黄矮病基因紧密连锁 ,抗黄矮病基因位于7XL上 、Xpsr687附近.图
版Ⅰ-C同时表明 ,除 L1 外的所有抗病材料缺失普通小麦 14.2 kb 的 7DL 特异带.说明
H960642中包含 Xpsr687位点的 7DL 末端片段 ,被含相应位点的 7XL片段所取代.
psr687与 EcoRⅠ酶切 DNA片段的Southern杂交结果表明 ,抗病池和抗病单株均缺失小麦
8.6 kb的 7DL 特异带 ,具有一条 2.1 kb 左右的 7XL 特异带.进一步说明 , H960642 中包含
Xpsr687位点的7XL片段取代了 7DL 片段 ,psr687与抗 BYDV基因紧密连锁.
上述结果说明:在易位系 H960642 中 ,中间偃麦草染色体 7XL 末端片段取代了小麦染色
体7DL末端片段 ,该易位染色体为 T7DS·7DL-7XL.由于探针 psr965未检测出中间偃麦草染色
体7XL特异带 ,易位断点发生在 RFLP连锁图上 Xpsr965与 Xpsr680位点之间.根据第 7部分
同源群 RFLP连锁图[ 9] 和 Gale 的私人通讯(1998):Xpsr965 距着丝点的遗传距离约 90 cM ,
Xpsr680距着丝点的遗传距离约 99 cM.因此 ,易位断点距着丝点的遗传距离为 90 ～ 99 cM.
BYDV抗性基因位于中间偃麦草染色体 7XL 末端 、RFLP 连锁图上 Xpsr680 ,Xpsr687附近 ,距着
丝点遗传距离大于 90 cM.
2.3　Ep-1同工酶分析
Koebner等[ 7]研究表明:编码小麦 Ep-1同工酶的基因位于第 7部分同源群长臂上 ,小麦品
种中国春(CS)有 2条带:靠近阴极的 7BL 和靠近阳极的 7DL 特征带.根据第 7同源群遗传图
第 4 期 张增艳等:用分子标记定位源于中间偃麦草的小麦抗黄矮病基因 415　
谱[ 9]和Gale 的私人通讯(1998)得知:Ep-1位于 7DL 末端 、距着丝点约 114 cM.
以H960642的抗病单株 、感病单株和亲本作供试材料 ,分析 Ep-1的多态性 ,结果表明(图
版Ⅰ-D):H960642的所有抗病单株均缺失了小麦的 7DL 特征带.说明包含 Ep-1位点的 7DL
片段被替代了 ,易位片段包含距着丝点 114 cM 的染色体部分 ,佐证了 RFLP 分析结果.即距着
丝点 90 ～ 99 cM的易位断点以远的小麦染色体 7DL 片段 ,被携有 BYDV抗性基因的中间偃麦
草染色体 7XL 片段所取代.
RFLP 分析 、EP-1同工酶分析的结果均与GISH结果相吻合.
易位染色体的遗传连锁示意图见图 1(b).
3　讨论
小麦目标基因定位的常用方法 ,是通过建立适当的分离群体 ,分析基因与遗传标记间的连
锁关系和遗传距离加以实现.但是 ,对于引渗的外源基因定位 ,上述方法难以奏效.因为异源
种属与普通小麦的亲缘关系较远 ,外源染色体与小麦相应染色体在一般情况下相互交换和重
组的频率很低[ 10] .因此 ,难以通过建立染色体重组的分离群体来定位外源基因.
本文采用的抗病池和感病池 ,是由易位系高代材料(F7)构建的.它们之间除了 BYDV抗
性基因附近区域不同外 ,遗传背景基本相同 ,可作为抗黄矮病基因的 1对近等基因系 ,用于标
记和定位该抗黄矮病基因.
近年发展起来的 GISH ,已被证明是检测外源染色质的有效方法[ 4 ,11] ,不仅可以直观地显
示外源染色体及其片段的数目与大小 ,而且可为进行 RFLP 分析选择探针提供信息 ,减少
RFLP 分析的工作量和盲目性.然而 ,GISH 难以确定外源染色体的同源群归属 ,不能定位外源
基因.
RFLP 标记是基于限制性内切酶识别位点差异的分子标记.DNA序列任何差异 ,都可能造
成识别位点或限制片段的不同 ,从而显示 RFLP.DNA 序列差异的大小决定了 RFLP 多态性的
高低.普通小麦含有 3个部分同源染色体组 ,80%的 DNA 序列为重复序列 ,因而普通小麦之
间的 RFLP 多态性较低 ,但在普通小麦与其近缘属种间 ,DNA序列差异则较大 、多态性较高.
因此 ,利用 RFLP 标记技术分析含外源遗传物质的鉴定材料及其亲本 ,可有效地鉴定外源染色
体 ,确定外源染色体同源群归属 , 鉴定出易位断点的位置及易位片段大小 , 定位外源基
因[ 5 ,10 , 12] .
GISH 和 RFLP技术相结合 ,是准确 、全面鉴定外源染色体 、解析新种质尤其是小片段易位
系的遗传构成和定位外源基因的有效方法.
本研究首先采用 GISH 确定了易位片段大小及其物理位置 ,为 RFLP 分析选择探针提供了
信息.再对近等基因系进行 RFLP 分析 ,找到了与抗黄矮病基因连锁的 RFLP 标记 psr680和
psr687 ,为分子辅助育种打下了基础.借助 RFLP 标记和遗传图 ,明确了易位涉及的染色体 ,确
定了易位断点的遗传距离.将抗黄矮病基因定位到 7XL上 Xpsr680 ,Xpsr687附近 ,这比前人报
道的该基因在染色体 7X上的位置更具体 、确切[ 2 ,13] .
Banks等人[ 13] 、Hohmann等人[ 14] ,对以 L1为抗源 、通过组织培养获得的 TC5-TC10 ,TC14材
料进行了 RFLP分析 ,鉴定出这些材料除 TC7外均为易位系 ,易位片段最小的 TC14易位断点
在小麦染色体 7DL 中部 、Xpsr129附近 ,距着丝点遗传距离约 45 cM.本文通过 GISH和 RFLP
416　 中　　国　　科　　学　　(C　辑) 第 29卷
分析 ,对以 L1为抗源 、CSph诱导产生的易位系H960642进行了研究 ,鉴定出H960642为小片段
纯合易位系 ,其易位断点发生在 7DL末端 Xpsr680与 Xpsr965位点之间 ,距着丝点的遗传距离
为90 ～ 99 cM ,该易位系的易位片段小于 TC14的易位片段 , 更易于育种家利用.
致谢　感谢中国农业科学院品种资源研究所贾继增研究员在 RFLP 分析方面给予的支
持 ,感谢李志武同志帮助绘制图1.
参　　考　　文　　献
1　Cauderon Y , Saigne B , Dauge M.The resistance to wheat rusts of Agropyron intermedium and its use in wheat improvement.In.Proc
4th Wheat Genet Symp , Missouri:Columbia , 1973.401～ 407
2　辛志勇 ,徐惠君 ,陈　孝 , 等.应用生物技术向小麦导入黄矮病抗性的研究.中国科学 , B辑 , 1991, (1):36～ 42
3　Larkin P J , Banks P M , Lagudah E S , et al.Disomic Thinopyrum intermedium addition lines in wheat with BYDV resistance and with
rust resistance.Genome , 1995 , 38:385～ 394
4　马有志 ,富田因则 ,中田升 ,等.应用分子原位杂交技术解析小麦-天兰冰草部分双二倍体———远中 2号的染色体构成.
遗传学报 , 1997 , 24(4):344～ 349
5　Sharp P J , Chao S , Desai S , et al.The isolation , characterization and application in the Triticeae of a set of wheat RFLP probes identi-
fying each homoeologous chromosome arm.Thero Appl Genet , 1989 , 78:342～ 348
6　Devos K M , Atkinson M D , Chinoy C N , et al.RFLP-based genetic map of the homoeologous group 3 chromosomes of wheat and rye.
Theor Appl Genet , 1992, 83:931～ 949
7　Koebner RM D , Miller T E, Snape J W , et al.Wheat endopeptidase:genetic cont rol , polymorphism , intrachromosomal gene location ,
and alien variation.Genome , 1987 , 30:186～ 192
8　Liu C J , Atkinson C N , Chinoy CN , et al.Nonhomoeologous translocations between group 4 , 5 , and 7 chromosomeswithin wheat and
rye.Theor Appl Genet , 1992 , 83:305～ 312
9　Gale M D , Devos K M.Progress in genome mapping of wheat and related species.Joint Proceedings 5th and 6th Public Workshops of
the International Triti ceae Mapping Initiative , California:University of California , 1996.108
10　贾继增 ,Miller T E , Reader S E , 等.小麦抗白粉病基因 Pm12的 RFLP标记.中国科学 , B辑 , 1993 , 23(6):589～ 594
11　张增艳 ,马有志 ,辛志勇 ,等.应用基因组原位杂交技术鉴定抗黄矮病小麦新种质.中国农业科学 , 1998 , 31(3):1～ 4
12　Donini P , Koebner M D , Ceoloni C.Cytogenetic andmolecular mapping of the wheat-Aegilops longissima chromatin breakpoints in pow-
dery mildew-resistant int rogression lines.Theor Appl Genet , 1995 , 91:738～ 743
13　Banks P M , Larkin P J , Bariana H S , et al.The use of cell culture for subchromosome introgressions of barley yellow dwarf virus resis-
tance f rom Thinopyrum intermedium to wheat.Genome , 1995 , 38:395～ 405
14　Hohmann U , Badaeva K , Busch W , et al.Molecular cytogenetic analysis of Agropyron chromatin specifying resistance to barley yellow
dwarf virus in wheat.Genome , 1996 , 39:336～ 347
第 4 期 张增艳等:用分子标记定位源于中间偃麦草的小麦抗黄矮病基因 417