全 文 ：第 71 卷第 4期
1 98 9年 1之月
西北农业大学学报
A e t a U h i v
.
S e p t e n t r i o n a l i o c c id e n t
.
A g r i e
.
V o l
.
1 7
,
N o
。
4
D e e
. ,
1 9 8 9
用放射免疫吸附测定法检测大麦
黄矮病毒及雀麦花叶病毒 ·
p足T EC T IO N O F BY D V A N D B M V B Y R A D月O IM朋U N O SO RB E N T 、 AS S AY
魏宁生 李 毅
(植保 系 )
张 慧
, 老
《中心实脸室 )
’
W
e i N i n g s h e n g L I Yi Z h a n g H u e i
( D e 夕 t . o f P l a n t P r o f e c t i o n ) ( eC n r r e l a b o r a r o r 夕 )
关健词 : 大麦黄矮病毒 , 雀麦花叶病毒多 放针 免疲吸附浏 定法
K e y w o r d s
:
b a r l e y y e l l o w d w a r f v i r u s ; b r o m e m o s a i e v i r u s , r a d i o i m m u n o -
s o r b e n t
a s s a y
放射免疫吸附测定法 ( R a d i o i m m u n o s o r b e n t a s s a y R I S A ) 是一 种 灵 敏 、 快速
检测植物病毒的方法 , 它的灵敏度高于酶联免疫吸 附 法 ( E nZ y m e 一 iL n k de i m m u n os 。 -
s o r b e n t a s s a y E L IS A )
。 作 者应用 ` 2 ` I分别标记雀麦花叶病毒 ( B r o m e M o s a i e V i r u s
BM V ) 和大麦黄矮病毒 ( B a r l e y Y e l l o w D w a r f V i r u s B Y D V ) 免疫卜 球蛋白 , 进 T
行病毒检测 , 取得了较为满意的结果 , 这为进行蚜虫带毒率的侧定 和病害流行测报打下
基础 。
1 材料和方法
1
.
1 病毒提 纯
将大麦黄矮病毒混合株系接种于三叶期的岸黑燕麦 ( A ve an b y : 。 nt i n a ) 上 , 在 20
~ 25 ℃的防虫温室内培养3 ~ 4个星期 。 提纯方法基本采用 lC e 。 : “ J . 等人 〔” 的程序 。 雀
麦花叶病毒 E 株系接种于三叶期大麦 ( H Or d eu m v ul g a r e ) 上 , 于 20 ~ 25 ℃下培养 2 个
星期 , 提纯方法基本采用魏宁生等 〔 ` 〕聚乙二醇沉淀法 。
了. 2 E L I S A程序
( 1) 抗血清的制备及 r 一球蛋白的提取 : B Y D v 和 B M v 抗血清的制备是分别通过三次
肌肉注射和一次静脉注射免子后获得的 。 琼脂双扩散试验表 明 , 其效价分别为 B M V I :
2 5 6
,
B Y D V I
:
32
。
B y D V和 B M V免疫 r一球蛋白的提取是通过饱和硫酸按沉淀后加以透
析 , 再通过 D E A E ( 或W ha t m an D E 。 : ) 纤维素柱纯化后获得的 。
( 2) r一 球蛋白的标记 : 供标记用 r 一球蛋白的浓度分别为 B Y D v o . s m g / m l 及B M V
3
.
3 m g / m l
。 r一蛋白经戍二醛氧化后用碱性磷酸盐酶 (西德 B o e h r i n g e : M a : 、 n h e im , 。 r -
der 一N O . 5 6 7 75 2 ) 标记 、 后在 P B S缓冲浪中透析 2 h4 除掉残余的戍二醛 , 加 入 少 许 牛
血清 白蛋白及微量 25 沁叠氮化钠于 4℃下保存备用 。
本文于 19 8 8年 12 月 14 日收到
第 4期 魏宁生等 :用放射免疫吸附侧定法检测大麦黄矮病毒及雀麦花叶病毒 的
( )3 EL I SA测定程序 :采用 c l r ak等双抗体夹心法 〔 ` ’ 。 整个测定是在聚苯乙烯微
量试验板上 (1 0x 1 0)进行 , 具体程序从略 。
1
.
3 R I S A 程序
( 1 )
r一球蛋白的标记 : 标记抗体的制备基本采用 H u n t e r和 G r e e n w o o d 〔 5 ’所述氯胺
T法 。 即各取 50 川 B Y D V和 B MV 的 r 一球蛋白置于小安培瓶内 , 用 l m o i N a ” 5 1标记 , 同
时加入新鲜配制的 10 %氯胺 T 溶 液氧化。 反应后随即应用偏重亚硫酸钠终止反应 。 再通
过eS p ha d Xe G一 50 分析柱除去游离碘 。 分离标记的 r 一 球蛋白用 P B S一 P V P一 B S A缓冲液 稀
释后备用 。
( 2 ) 测定程序 : 采用双抗体夹心法 , 与 E L IS A 不同之 处是 RI SA 用 N a ` “ ` I标记 r 一 球
蛋白代替前者的酶标 r 一 球蛋白 。 经 N ` ’ 2 5 1标记后于 4℃下培养 2功 , 用洗涤缓冲液冲洗
3 次 , 再用转移缓冲液转至聚苯乙烯塑料管中 。 最后在 r 一 放射免疫计数器上测定。
1
.
4 级冲液
( 1) 包被缓冲液 : O . 05 M碳酸钠缓冲液 (P H 9 . 6) 含。 。 02 %叠氮化钠 。
( 2 ) 样品缓冲液 : o . o ZM磷酸盐生理盐水缓冲液 ( p B S ) 含 0 . 0 5% T w e e o Z o和 0 . 0 2
%叠氮化钠 。
( 3) 基物缓冲液 : 10 %二乙醇胺用盐酸调 p H至 9 . 8。
( 4 ) 冲洗缓冲液 : o . o ZM p B S并含 0 . 0 2% T w e e n Z o 。
( 5 ) 磷酸盐生理盐水缓冲液 ( p B S ) : o . o ZM磷酸盐加 o . 15M N a C I ( p H 7 . 4 ) 。
(6 ) 转移缓冲液 : 。 . I M 甘氨酸一盐酸缓冲液 (P H 2 . 3) 。
( 7 ) P B S一 P V P 一B SA 缓冲液 : 0 . o ZM P B S含 0 . 0 2 %叠氮化钠 , 0 . 0 5 % T w e e l l Z o , 2 0%
P V P
, 0
.
2% B S A
。
2 试验结果
2一 N a ” ’ I标记 r 一 球蛋白的浦定
N a
’ “ ’ I标记的 B Y D v 和 B M v r 一 球蛋白经 s e p h a d e x G 一 5 0柱后 , 分管收集 , 每管约
l ml
, 共 收集 2 6管 。 经 r 一放射免疫计数器测定后 , 以管数为横坐标 , 以计 数率 为 纵 坐
标 , 绘出峰位 (见下 图 ) , 由此可得两个放射峰 , 第一峰在 6 一 12 管之间为碘化蛋白 ,
第二峰在 21 一 2 4管之间为游离碘峰 。 将第一峰各管合并于 。 ℃下保存备用 , 并计算 ` “ “ I
利用率 〔 “ ’ 。
, 2 ”
I利用率 = 蛋白质峰放射性
N a
’ “ `
I总投入放射性
结果表明 , 碘利用率可达 69 . 2 % 。
2
.
2 R I S A和 E L I S A浦定 B Y D V和 B MV的结果
分别用 B Y D V和 B M V提纯病毒以及 B Y D V病 株和 带
毒二岔蚜虫提取液 , 经系列稀释后进行测定 。 结果表明 ,
E L is A检测 BY D V和 B M V 提纯病毒可检测到的最低 浓 度
分别为 1“ g / m l和 10 0 : , g / m ! , 而R I SA 则分 别 达 到 1 0。
劝 ` 加 艺 翻 节教
` “ `
I标 记 r 一 球 蛋 白
( B M V ) 层析图
1 06 西北农业大学学报 、 ` - 一 1倦
n g / m l不口 l o n g / m l 。 B Y D V病株提取液 ( 19病叶加 s m l p B导 , p v p 一B s A 缓冲液匀浆 )可分
别稀释到1 0 一 “ ( R I SA ) 及 1 0 一 2 ( E L S A ) ; 而带毒蚜虫 ( 5 0头二岔 蚜加 l m lp B S一 p V P -
B SA 缓冲液匀浆 ) 则分别可稀释至川 “ 3 ( RI SA ) 及 1 0 “ 2 ( E LI SA ) ` 给果详见下表 。
R I S A和 E L I S A的侧定结果
病毒名称 样 品 稀 释 倍 数 RIS A
I , 5 1
( c Pm / 卜主)
E IL S A
璐寮 《士) A ` 。 。 ( 2 )
十B Y D V 提纯病毒
( l m g / m l )
十病叶提取液
( 3 )
十饲毒蚜虫提取液
( 4 )
十于+BM V 提纯病毒
( l m g / m l )
10
一 2
10
一 s
10
一 4
10
一 5
1 0
一 6
1 0一 7
10
一 8
原滚
1 0
一 1
10
一 2
10
一 3
10
一 4
原液
10
一 1
1 0
一 2
10
一 3
1 0
一 4
无毒蚜
1 0
一 2
10 一 3
1 0一
10
一 5
10
一 6
1 0
一 7
1 0
一 8
10
一 9
对照
9 6 7 7
6 15 3
4奋59
4 8 37
2 8 0 2
1 7 4 7
`
2 9 2
3加9
3 3 4 0
2 8 9 7
1 3 1 7
3 0 2
4 2 0 1
2心8 0
1 7 4 2
1 2 78
3 1 5
3 0 2
2 5 6 0 6
2 0 9 6 0
14 9 6 0
5 63牙
4 0 0 8
2 18公
12 2 6
2 8 3
2 76
O
。 阳
0
。
7 1
0
一
6 5
0 , 5 9
0
。
5 2
_
0
。
0 8
0
。
0 9
O
。龙
0
。 母7
0
。
3 8
0
。
0 5
0
。
0 3
0
。
7 6
0
。
6 8
0
。
6 3
0
。 12
0
。
0 9
介·办气
0
。
8 1
0
。
74
d
.
6 2
0
。
57
0
。
5 0
0
。
4 2
0
。
1 1
0 。 0 7
0
。
0 9
1t ) + 示清晰可见的黄色反应 , 一 示无黄色出现 ,
( 2) 在 E L IS A醉标仪 (波长 4 05 n m ) 上侧得的吸收值 ,
(3 ) g1 病叶加 sm lP B S 一 P V P 一 B SA缓冲液匀浆为原液
(4 ) 50 头蚜虫加 l m l P B S 二 P V P 一 B S A缓冲液匀浆为原液 .
3 讨 论
G ha br ial S A 等 〔” 报道 , 应用 ` ’ 5 1标记花椰菜花叶病毒 ( C o M v ) 和葛芭花叶病
毒 ( L M V ) 免疫 r 一球蛋白 , 可检测到的最低浓度分别为 s gn / ml 和 Zgn / m l 。 对 某 些
第 4期 魏宁生等 : 用放射免疫吸附测定法检测大麦黄矮病毒及雀麦花叶病毒 加 1
病毒可检测到的浓度则更低 , 低于 nI g / m l 。 作者应用 ` “ 5工分 别 标 记 B Y D V 和 BM V r 一
球蛋白 , 经测定后可检测到的最低浓度分别为 l o o n g / m l和 1 0n g / ml , 高于 E LI SA的测
定结果 lu g / m l和 1 0 01 9 / m l 。 RI S A测定中的灵敏度主要取决于三个因素 : 首先是病毒 抗
原性的强弱 ; 其次是抗血清的效价 、 纯度和 r 一 球蛋白的纯度和浓度 ; 第三是标记的 r 一 球
蛋白的放射性比活度 。 由于 B Y D V在寄主组织中的含量低 , 提纯后病毒的浓度也低 , 所
以难于获得高效价的抗血清 , 以致影响检测的灵敏度 。
对单头蚜虫带毒情况的检测有待于在进一步提高RI S A 的检测灵敏度和摸索 出 完全
释放并不损失蚜虫体液的程序后 , 方可尝试单头蚜虫带毒与否的测定 。
R is A 中用作标记的 ` “ 5 1 , 其半衰期为 6 d0 , 所 以 标记的 : 一 球蛋白可保持 6 个星期
左右而不 明显地丧失其在测定中的灵敏度 。 再者 , 采用氯胺 T 法标 记 , 不仅可获得高比
度的碘化抗体而且 ` “ 5 1利用率可达 6 7 . 2% 。
参 考 文 献
魏宁生等 。植病学报 , 1 9 8 4 , 1 4 ( 2 ) : 7 1一 7 8
金子渔等 . 病毒学集刊 , 10 5 7 ( s ) : s 。一。5
C l
e o r a J e t a l
.
P h y t
o P a t h o lo g y 1 9 5 5 ( 7 3 )
: 了5 5一 7 5 9
C I
a r k M F e t a l
.
J G e n V i r o l o g y 2 0 7 7 ( 54 )
.
4 7 5一 4 5 3
G
r e e n w o o d F G e t a l
.
J B i o e h e m i e a l 1 96 3 ( 8 , ) , 1 2 4一 2 2吕
G h a b r i a l 5 A e t a l
.
J G
e 刀
V i
r o
l 29 5 0 ( 4 5 )
,
3 1 1一 3 17