全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2015 年
收稿日期：2014－12－16
基金项目：云南省大理白族自治州科学研究计划项目（DL2012）；大理学院 2012 应用开发基金项目（KY1219211210）
作者简介：赵志莲（1972－），女（白族），云南大理人，高级讲师，硕士，主要从事生物技术教学与研究工作，（电话）13170764216（电子信箱）
zzldl666＠sina．com；通信作者，徐 立，副教授，（电话）0872－2251475（电子信箱）lihfzh888＠sina．com。
滇龙胆优质种质筛选及离体培养条件优选研究
赵志莲 1，徐 立 1，2a，李海峰 2b
（1．大理农林职业技术学院，云南 大理 671003；2．大理学院，a．基础医学院；b．药物研究所，云南 大理 671000）
摘要：以大理州不同居群滇龙胆（Gentiana rigescens Franch．ex Hemsl．）、同一居群不同植株为试验材料，
采用高效液相色谱法（HPLC）对滇龙胆根及根茎中龙胆苦苷的含量进行测定；再以龙胆苦苷含量≥7．0
％的优质种质资源为外植体，采用正交试验设计方法研究培养基、蔗糖浓度、pH 及培养温度对滇龙胆离
体培养植株再生的影响。 结果表明，大理州 6 个居群滇龙胆根及根茎中的龙胆苦苷含量较高，不同居群
间龙胆苦苷含量具有显著差异（P＜0．05），以鹤庆县居群的龙胆苦苷含量最高（80．70 mg ／ g），含量最低的巍
山县居群也超过国家药典规定标准的 2 倍多； 同一居群内不同植株滇龙胆根及根茎中龙胆苦苷含量差
异较小，只有云龙县居群不同植株间具有显著差异（P＜0．05），其他居群不同植株间无显著差异（P＞0．05）；
滇龙胆生长点离体培养及植株再生最适培养基和培养条件是 1 ／ 2MS＋30 g ／ L 蔗糖＋pH 5．2＋20 ℃ ／ 25 ℃变
温培养，再生植株诱导率最高可达 88．9％，试验初步建立了滇龙胆离体培养及植株再生体系。
关键词：滇龙胆（Gentiana rigescens Franch．ex Hemsl．）；种质资源；龙胆苦苷；离体培养；植株再生
中图分类号：S567．23＋9；S502．4；Q946．83 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）17－4228－04
DOI：10．14088 ／ j．cnki．issn0439－8114．2015．17．031
Study on the Screening of High Quality Germplasm and Optimization of in Vitro
Culture Conditions for Gentiana rigescens
ZHAO Zhi－lian1，XU Li1，2a，LI Hai－feng2b
（1． Dali Vocational and Technical College of Agriculture and Forestry， Dali 671003， Yunnan， China；
2a．College of Basic Medicine； 2b． Institute of drug， Dali University， Dali 671000， Yunnan， China）
Abstract： Gentiana rigescens Franch．ex Hemsl． plants from different populations and different individuals from the same
population in Dali prefecture were selected as the experimental material． The gentiopicroside content of root and rhizome
of G． rigescens was determined by High performance liquid chromatography （HPLC）． Then the high quality germplasm
resources of which the gentiopicroside content was not lower than 7．0％ were selected as the explants； and the effects of
culture medium， sucrose concentration， pH value， and culture temperature on the in vitro culture and plant regeneration of
G． rigescens were explored by orthogonal experiment design． The experimental results showed that the gentiopicroside content
of root and rhizome of G． rigescens from 6 different populations of Dali prefecture was high， and there was significant
difference among different populations in the gentiopicroside content （P＜0．05）． Among them， the gentiopicroside content from
Heqing county population was the highest （80．70 mg ／ g）； and from Weishan county population was the lowest， which was still
more than twice of the standard gentiopicroside content of national pharmacopoeia． The difference of the gentiopicroside content
of root and rhizome of G ． rigescens from the same population was smaller． There was significant difference in the gentiopicroside
content among different plants from Yunlong county population （P＜0．05）， while no significant difference in other populations
（P＞0．05）． The optimal culture medium and culture conditions for the growing point of in vitro culture and plant regeneration
of G． rigescens of Dali populations was 1 ／ 2 MS ＋ 30 g ／ L sucrose ＋ pH 5．2， and variable temperature culture at 20 ℃ ／ 25 ℃．
Under the condition， the regenerated plant inductivity was the highest as the inductivity reached to 88．9％ ． This study
preliminary construct the in vitro culture and plant regeneration system for G． rigescens from Dali population．
Key words：Gentiana rigescens Franch．ex Hemsl．； germplasm resources； gentiopicroside； in vitro culture； plant regeneration
第 54 卷第 17 期
2015年 9 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 54 No.17
Sep.，2015
第 17 期
表 1 L9（34）正交试验设计
水平
1
2
3
培养基（A）
1/4MS（NH4NO4、KNO3含量为 1/2 的 MS 培养基）
1/2MS（NH4NO4为 1/2 的 MS 培养基）
MS
蔗糖浓度（B） //g/L
10
20
30
pH（C）
5.2
5.6
6.0
因素
培养温度（D）//℃
20
25
20/25
注：因素 D 列的“20/25 ℃”为变温水平。
滇龙胆（Gentiana rigescens Franch．ex Hemsl．）
是龙胆科 （Gentianaceae）龙胆属 ［Gentiana （Tourn．）
L．］多年生草本植物，别名坚龙胆、龙胆草、兰花根、
青鱼胆等，主要分布在云南、贵州、四川等省［1］，为国
家重点保护三级野生药材濒危物种。 滇龙胆是传统
中药龙胆的重要基源植物，以根及根茎入药，具有清
热泻火、保肝健脾、消炎杀菌等作用［2］。最新药理学研
究表明，滇龙胆还具有抗呼吸道合胞病毒（Respira-
tory Syncytial Virus，RSV）、降血糖等功效［3，4］。
研究［5－7］发现，滇龙胆根及根茎中主要活性成分
龙胆苦苷的含量因产地不同而存在较大的差异，云
南省不同产地的滇龙胆其根及根茎中龙胆苦苷的
含量在 2．75％～4．87％， 全省滇龙胆的龙胆苦苷含量
平均为 4．77％；其中大理白族自治州的洱源、巍山、
剑川县所产滇龙胆根及根茎中龙胆苦苷的含量分
别为 7．02％、6．02％、5．35％，显著高于寻甸县所产滇
龙胆的龙胆苦苷含量（3．85％）以及昆明市所产滇龙
胆的龙胆苦苷含量（2．45％）。 由此可见，大理州所产
滇龙胆根及根茎中的龙胆苦苷含量远远高于《中国
药典》中 1．5％ ［8］的限量标准，所以有必要以根及根
茎中龙胆苦苷含量为标准对大理州滇龙胆优质种
质资源进行筛选，并建立滇龙胆优质种质资源离体
培养及植株再生体系。 为此，试验采用高效液相色
谱 法 （High performance liquid chromatography，
HPLC）对大理州范围内所产滇龙胆野生优质种质资
源进行筛选，再以活性成分龙胆苦苷含量较高的野
生优质种质资源为外植体，在植物组织培养基中不
添加任何植物激素的条件下，采用正交试验设计方
法研究培养基、 蔗糖浓度、pH 及培养温度对滇龙胆
离体培养及植株再生的影响，以期为滇龙胆野生优
质种质资源筛选、离体保存、快速繁殖、资源可持续
利用提供理论依据和参考。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 采样点选择与样品采集 2011 年 9～11 月，
分别在云南省大理州的大理市、剑川县、鹤庆县、巍
山彝族回族自治县、云龙县、洱源县等滇龙胆的主
要原料来源地采集野生居群单株， 各居群间距离
100 km， 株距不小于 3 m，6 个居群各随机采集 30
株，自然干燥。 滇龙胆离体培养及植株再生外植体
为大理市居群 12～2月分化的休眠芽生长点。
1．1．2 仪器与试剂 仪器主要有美国惠普公司 Ag-
ilent1100 高效液相色谱仪（包括 G1313A ALS 自动
进样器、G1315A ／ B DAD 检测器、Agilent ChemSta-
tion 色谱工作站）、 梅特勒－托利多 AE240 分析天
平 ［瑞士梅特勒－托利多仪器 （中国 ）有限公司 ］、
SK5200H 型超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限
公司）、FY135 型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器
有限公司）、Millipore 纯水处理系统［默克化工技术
（上海）有限公司］、BUCHI 旋转蒸发仪（瑞士步琦有
限公司）以及人工智能气候箱；高压灭菌器；无菌操
作台等。 试剂主要有中国药品生物制品检定所提供
的龙胆苦苷对照品（批号：110770－200510），高效液
相用甲醇为色谱纯，高效液相用水为三重蒸馏水，
其他试剂均为分析纯。
1．1．3 样品的选择 在滇龙胆不同居群根及根茎
中龙胆苦苷含量测定时，从每个居群中随机选取根
及根茎质量为 6．0～6．6 g 的植株 9 株混合后作为样
品。 在滇龙胆同一居群不同植株根及根茎中龙胆苦
苷含量测定时，以龙胆苦苷含量较高的 4 个居群为
研究对象，从每个居群中随机选取根及根茎质量为
6．0～6．6 g 的植株 5 株作为样品。
1．2 方法
1．2．1 样品中龙胆苦苷含量测定 所有样品经过粉
碎、过 100 目筛、混合均匀，按照前期建立的方法 ［9］
提取与测定龙胆苦苷的含量， 每个样品重复测定3
次。 龙胆苦苷含量用龙胆苦苷质量/干物质质量表示。
1．2．2 滇龙胆离体培养及植株再生 滇龙胆外植
体处理及接种方法按照前期建立的方法 ［9］完成。 采
用 L9（34）正交试验方法设计因子水平，分别设培养
基、蔗糖浓度、pH 和培养温度 4 个因子，每个因子
取3 个水平，基本培养基为 MS（含琼脂 8 g ／ L），各因
子水平组合见表 1。 培养容器为 250 mL 玻璃三角
瓶，每瓶加入 50 mL培养基，120 ℃高压灭菌 15 min，
冷却后每瓶接种 6 个外植体，每个处理接种 5 瓶，
设 3 次重复。 培养温度按试验设计进行设置，光照
度为 27 μmol ／ （m2·s），光照时间为 16 h ／ d。培养 30 d
赵志莲等：滇龙胆优质种质筛选及离体培养条件优选研究 4229
湖 北 农 业 科 学 2015 年
后统计出芽数 （接种外植体中有芽生成的外植体
数），计算诱导率，诱导率为出芽数占接种外植体数
的百分数。
1．3 数据处理
试验所得数据表述为“平均数±标准差”，应用
SPSS13．0 统计软件进行单因素方差分析（One－way
ANOVA）。
2 结果与分析
2．1 滇龙胆居群间及居群内植株根及根茎中龙胆
苦苷含量比较
2．1．1 不同居群的根及根茎中龙胆苦苷含量 试
验测定得到的龙胆苦苷对照品及试验样品的色谱
图见图 1， 不同居群的根及根茎中龙胆苦苷含量情
况见表 2。 在对大理州 6 个不同居群滇龙胆根及根
茎中龙胆苦苷含量的比较分析后发现，大理州所产
滇龙胆根及根茎中的龙胆苦苷含量整体较高，均高
于《中国药典》中 1．5％［8］的限量标准。 其中，含量较
低的巍山县居群和剑川县居群就分别达到了
42．87、57．33 mg ／ g，而鹤庆县居群滇龙胆根及根茎中
的龙胆苦苷含量高达 80．70 mg ／ g， 显著高于其他 5
个居群（P＜0．05）；大理市、云龙县、洱源县 3 个居群
之间滇龙胆根及根茎中的龙胆苦苷含量（分别为
73．30、72．27、72．40 mg ／ g）差异不显著（P＞0．05），但也
显著高于巍山县居群和剑川县居群（P＜0．05）。 研究
结果表明，大理州的 6 个野生滇龙胆居群之间根及
根茎中龙胆苦苷含量具有差异分化，在野生滇龙胆
中存在龙胆苦苷含量较高的优质种质资源，这为从
野生滇龙胆居群中筛选根及根茎中龙胆苦苷含量
较高的优质种质资源提供了依据。
2．1．2 同一居群不同植株的根及根茎中龙胆苦苷
含量 大理州野生滇龙胆在大理市、洱源县、鹤庆
县、云龙县 4 个居群内不同植株的根及根茎中龙胆
苦苷含量测定结果见表 3。 对表 3 数据比较分析可
知，大理市、洱源县、鹤庆县 3个居群内植株之间的滇
龙胆根及根茎中龙胆苦苷含量差异不显著（P＞0．05），
仅云龙县居群的植株间龙胆苦苷含量存在显著差
异（P＜0．05），说明滇龙胆同一居群内各植株的根及
根茎中龙胆苦苷含量具有较稳定的居群遗传能力，
可以把从野生滇龙胆居群中筛选出的根及根茎中
龙胆苦苷含量较高的优势居群作为繁殖及育种材
料使用。
2．2 滇龙胆离体培养及植株再生的结果
2．2．1 L9（34）正交试验设计因素对滇龙胆离体培养
及植株再生的影响 试验设计的 L9（34）正交试验结
果见表 4。 从表 4 可见，当试验因素水平组合为 MS
培养基＋蔗糖 20 g ／ L＋pH 5．2＋培养温度 20 ℃ ／ 25 ℃
时，滇龙胆离体培养接种外植体芽的诱导率最高，
达到了 84．4％。 对滇龙胆离体培养芽诱导率进行
L9（34）正交试验结果分析可知，培养温度和培养基
pH是滇龙胆离体培养诱导芽的主要影响因素，对滇
龙胆离体培养芽诱导率的影响较大，而培养基类别
表 3 滇龙胆居群内不同植株的根及根茎中龙胆苦苷含量比较
植株
编号
002
003
004
005
006
大理市
71.67±0.901 8 a
72.23±0.960 9 a
72.70±1.312 0 a
71.23±0.981 5 a
72.60±1.114 0 a
洱源县
71.13±1.079 a
71.06±2.194 a
70.60±1.179 a
71.57±1.234 a
70.93±1.795 a
鹤庆县
79.50±0.065 6 a
79.40±0.098 5 a
80.30±0.149 3 a
79.57±0.120 1 a
79.97±0.125 0 a
龙胆苦苷含量//mg/g
云龙县
68.20±0.105 4 a
72.70±0,468 6 a
69.80±0. 320 8 a
63.50±0.080 0 b
72.10±0.132 3 a
注：同列里不同英文小写字母表示同一居群内不同植株间在 P＜
0.05 水平上存在差异显著性。
表 4 滇龙胆离体培养的 L9（34）正交试验结果分析
试验
号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
k1
k2
k3
R
A（培养基）
1
1
1
2
2）
2
3
3
3
52．23
58．87
47．73
11．14
B（蔗糖浓度//g/L）
1
2
3
1
2
3
1
2
3
52．20
51．47
55．17
3．70
D（培养温度//℃）
1
2
3
3
1
2
2
3
1
37．77
42．57
78．50
40．73
因子水平
C（pH）
1
2
3
2
3
1
3
1
2
65．53
42．57
50．73
22．96
诱导率
%
48.9
30.0
77.8
73.3
40.0
63.3
34.4
84.4
24.4
表 2 滇龙胆不同居群根及根茎中龙胆苦苷含量比较
大理市
剑川县
鹤庆县
巍山县
云龙县
洱源县
DL001
JC001
HQ001
WS001
YL001
EY001
龙胆苦苷含量//mg/g
73.30 ± 0.111 3 b
57.33 ± 0.116 8 c
80.70 ± 0.072 1 a
42.87 ± 0.094 5 d
72.27 ± 0.135 0 b
72.40 ± 0.121 2 b
居群来源地及编号
注：同列里不同英文小写字母表示居群间在 P＜0.05 水平上存在
差异显著性。
t/min
图 1 龙胆苦苷对照品（左）和样品（右）色谱图
10 20 30 10 20 30
4230
第 17 期
和蔗糖浓度对滇龙胆离体培养芽诱导率的影响较
小。综合各因子分析结果，得出滇龙胆离体培养及
植株再生的最佳组合是 A2B3C1D3，即培养基类别为
1 ／ 2 MS 培养基＋蔗糖 30 g ／ L＋ pH 5．2＋培养温度
20 ℃ ／ 25 ℃； 用此组合方法对滇龙胆离体培养芽诱
导进行了验证试验，结果芽诱导率达到了 88．9％，与
试验结果相近，证明 L9（34）正交试验所得结果具备
客观有效性，可以作为滇龙胆离体培养芽诱导的培
养方法。
2．2．2 方差分析 为了进一步了解试验设计的各
因子之间在滇龙胆离体培养促进效果方面的差
异，又对试验结果芽诱导率进行了方差分析，结果
见表 5。 由表 5 可知，因子 D（培养温度）对滇龙胆
离体培养芽诱导率产生的作用达到了极显著差异
水平（P＜0．01），因子 C（pH）对滇龙胆离体培养芽诱
导率的作用达到了显著差异水平（P＜0．05），而因子
A（培养基种类）和因子 B（蔗糖浓度）对滇龙胆离
体培养芽诱导的作用不显著（P＞0．05）。 综合各因
子的表现， 得出滇龙胆离体培养及植株再生的最
佳组合是 A2B3C1D3， 即培养基种类为 1 ／ 2MS＋蔗糖
浓度 30 g ／ L＋pH 5．2＋培养温度 20 ℃ ／ 25 ℃。
3 讨论
试验结果表明，大理州范围内滇龙胆根及根茎
中龙胆苦苷含量整体较高，滇龙胆不同居群间龙胆
苦苷含量具有显著差异（P＜0．05），其中，鹤庆县居群
龙胆苦苷含量显著高于其他居群，含量最低的巍山
县居群中龙胆苦苷含量也是 《中国药典》2010 年版
1．5％［8］限量标准的 2 倍多。 滇龙胆同一居群不同植
株根及根茎中龙胆苦苷含量差异较小， 大理市、洱
源县、鹤庆县 3 个居群内不同植株间龙胆苦苷含量
差异不显著（P>0．05），云龙县居群内不同植株间龙
胆苦苷含量具有显著差异（P＜0．05），说明滇龙胆同
一居群内不同植株根及根茎中龙胆苦苷含量具有
较稳定的居群遗传能力，这个研究结果与杨维泽等
［10］的研究结果相似，滇龙胆居群间表型变异高于居
群内的表型变异。 证明大理州范围内存在龙胆苦苷
含量较高的野生滇龙胆优质种质资源，野生滇龙胆
居群间龙胆苦苷含量差异较大，居群内龙胆苦苷含
量差异较小。
植物组织培养技术是开展珍稀濒危药用植物
资源保护、 离体培养及植株再生研究的有效途径。
试验结果表明，在培养基中不添加任何植物激素的
条件下，不同组合的培养基、蔗糖浓度、pH及培养温
度处理均能诱导滇龙胆茎尖生长点再生植株，优选
出滇龙胆离体培养及植株再生的最佳培养组合条
件是培养基种类为 1 ／ 2MS＋蔗糖浓度 30 g ／ L＋pH 5．2＋
培养温度 20 ℃ ／ 25 ℃。 而朱宏涛等 ［11］、罗春梅等 ［12］
及张洁等 ［13］的研究都在培养基中添加了植物生长
调节剂，滇龙胆外植体经过愈伤组织途径后再完成
植株再生，与本研究的植株再生方式不一样。 因此，
滇龙胆离体培养再生植株根及根茎中龙胆苦苷含
量较高的性状是否能够得到稳定遗传？ 同时本研究
仅建立了大理州滇龙胆居群离体培养及植株再生
体系，在此培养基及培养条件下是否能建立其他居
群的离体培养及植株再生体系等，都还需要经过下
一步的试验研究来证实。
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表 5 对滇龙胆离体培养结果的方差分析
方差来源
D
C
A
B
误差
总和
SS
2.973
0.813 2
0.188 2
0.023 01
0.023 03
4.025
df
2
2
2
2
9
17
MS
1.488
0.406 8
0.094 6
0.011 6
F
128.4**
35.10*
8.164
1.000
F0.01
99.00
注：“*”表示在 α=0.05 水平上差异显著；“**”表示在 α=0.01 水
平上差异显著。
F0.05
19.00
19.00
（责任编辑 王 珞）
赵志莲等：滇龙胆优质种质筛选及离体培养条件优选研究 4231