全 文 ：北方园艺２０１５（０６）：９５～９８ ·生物技术·
第一作者简介：周佳红（１９９２－），女，山东烟台人，本科，研究方向为
园艺植物逆境生理与分子生物学。Ｅ－ｍａｉｌ：５３２００３９５９＠ｑｑ．ｃｏｍ．
责任作者：李鼎立（１９７９－），男，博士，副教授，现主要从事果树分子
生物学等研究工作。
基金项目：山东省优秀中青年科学家科研奖励基金资助项目
（ＢＳ２０１１ＮＹ００７）；现代农业产业技术体系建设专项资金资助项目
（ＣＡＲＳ－２９）；青岛农业大学高层次人才启动基金资助项目（６３０９２０）。
收稿日期：２０１４－１１－１０
ＤＯＩ：１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１５０６０２６
秋子梨茎段薄层细胞培养再生初探
周 佳 红１，邢 才 华２，曹 慧２，王 德 芬２，杨 春 蕾２，李 鼎 立２
（１．长岛富涛建筑有限公司，山东 烟台２６５８００；２．青岛农业大学 园艺学院，山东 青岛２６６１０９）
摘 要：以秋子梨试管苗为试材，进行了其茎段薄层细胞组织培养再生体系的构建，以期为
秋子梨无性繁殖和工厂化育苗奠定基础，同时为薄层细胞培养在梨属植物当中的应用提供参考。
结果表明：秋子梨茎段薄层细胞的再生受到激素浓度和配比的影响，其中不定芽再生最佳培养基
为ＭＳ＋ＢＡ １．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．２５ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂糖７ｇ／Ｌ，再生效率达１００％；不定
根再生最佳培养基为１／２ＭＳ＋ＩＢＡ ０．５ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂糖７ｇ／Ｌ，根再率达６６．７％；同
时研究还发现适宜的暗培养有助于愈伤组织的诱导和不定芽的再生。
关键词：秋子梨；薄层细胞；再生；茎段
中图分类号：Ｓ ６６１．２０３．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１５）０６－００９５－０４
秋子梨（Ｐｙｒｕｓ ｕｓｓｕｒｉｅｎｓｉｓ）原产于中国，是梨种中最
抗寒的砧木类型，其野生种可耐－５２℃低温，同时兼具
抗病、抗旱、抗涝以及与栽培梨亲和性好等优点［１］。但
在实际生产中，秋子梨砧木主要依靠种子繁殖，后代变
异大，参差不齐，种苗的一致性难以保证，限制了其进一
步的应用。组织培养技术是实现种苗无性繁殖的途径
之一，已经在草莓、香蕉、葡萄等果树当中得到应用并取
得较好的效果。在梨属植物中，组织培养研究仍以高效
再生体系的建立及优化为主，除基因型、培养基的筛选
外［２－４］，外植体也是影响其再生的重要因素之一。薄层细
胞（ＴＣＬ，Ｔｈｉｎ ｃｅｌ ｌａｙｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）是将外植体横切成１ｍｍ
厚的薄片进行培养的方法（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ＴＣＬ），该技术始于
紫凤草（Ｎａｕｔｉｌｏｃａｌｙｘ ｌｙｎｃｈｉ）表皮组织的培养，后逐渐
在十几个属中培养成功［５－６］。相比茎段、叶片，薄层细胞
培养作为组织培养外植体具有来源广泛、数量大等优点
为研究者青睐，且再生过程中嵌合体少，可以直接经过
器官发育途径再生植株，提高了再生效率。除此以外其
还是进行植物形态建成和遗传转化研究的原始材料。
梨属植物中，叶片、茎段、茎尖等外植体组织培养研究已
经得到开展［７］，但薄层细胞培养尚鲜见相关报道。故现
以秋子梨茎段薄层细胞为外植体进行培养和再生研究，
以期为秋子梨无性繁殖和工厂化育苗奠定基础，同时为
梨属植物形态建成、基因工程研究提供技术支撑。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
试验材料秋子梨采自青岛农业大学现代农业科技
示范园梨种质资源圃，试管苗２０１２年获得，常规继代
保存。
１．２ 试验方法
１．２．１ 薄层细胞的获得 取秋子梨试管苗在黑暗条件
下预培养１５ｄ，温度２５℃。预培养后用手术刀在无菌滤
纸上进行横切，厚度约１ｍｍ，然后放置在无菌蒸馏水中
待用或快速放置在不定芽诱导培养基中。
１．２．２ 茎段薄层细胞不定芽诱导培养基的筛选 不定
芽诱导培养基的筛选，以ＭＳ为基本培养基，分别附加不
同的ＢＡ和ＮＡＡ，试验采用双因素完全随机设计（表１），
培养基为 ＭＳ＋ＢＡ（０、０．５、１．０、１．５、２．０ｍｇ／Ｌ）＋ＮＡＡ
（０、０．２５、０．５０、０．７５、１．００ｍｇ／Ｌ）＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂
糖７ｇ／Ｌ，ｐＨ ５．８，光周期１６ｈ／ｄ。
１．２．３ 暗培养时间的筛选 将茎段薄层细胞接种在芽
最佳诱导培养基上进行暗培养时间的筛选，处理时间分
别为０、３、７、１１、１５ｄ后统计结果。
１．２．４ 根的诱导与再生 在前期研究的结果上重点对
ＩＢＡ的浓度进行筛选（表３），培养基为１／２ＭＳ＋ＩＢＡ（０、
０．５、１．０、１．５、２．０ｍｇ／Ｌ）＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂糖７ｇ／Ｌ，
ｐＨ ５．８，光周期１６ｈ／ｄ。
５９
·生物技术· 北方园艺２０１５（０６）：９５～９８
１．３ 项目测定
再生效率（％）＝芽（愈伤组织、根）的外植体数量／
总外植体的数量×１００％；平均生芽（根）数＝芽（根）的总
数／生芽（根）的外植体数量。
２ 结果与分析
２．１ 培养基的筛选
以ＭＳ为基本培养基评价了不同浓度ＢＡ和ＮＡＡ
对茎段薄层细胞再生的影响，表１表明，经过５ｄ暗培养
后，茎段薄层周围开始出现淡黄色的愈伤组织，后逐渐
增多，不定芽一般伴随愈伤组织的产生而出现，但不定芽
的再生效率和愈伤组织的再生效率并不一致（图１Ｂ、Ｄ）。
经３０ｄ后，统计结果显示，在培养基ＭＳ＋ＢＡ １．５ｍｇ／Ｌ＋
ＮＡＡ ０．２５ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂糖７ｇ／Ｌ上，不定
芽的诱导效率最高，达到１００％，同其它培养基相比在
１％水平达到极显著性差异（图１Ｃ）。相比不定芽的再生
效率，薄层细胞平均生芽数则较低，各处理之间差异不
明显，每个茎段薄层平均再生芽数多数仅为３～４个，且
受到外植体大小的影响，再生芽数目重复性较差，未达
到预期效果。
２．２ 暗培养时间的筛选
暗培养时间影响茎段薄层愈伤组织和不定芽的再
生效率，经３０ｄ的统计发现，暗培养７ｄ后愈伤组织和
不定芽的再生效率和０、３ｄ相比均具有显著性差异，分
别达到７２％和９６％。但随着暗培养时间的延长，在１１ｄ
和１５ｄ时，愈伤组织和不定芽的再生效率并没有明显的
变化（表２），故在秋子梨茎段薄层培养７ｄ左右就可以满
足愈伤组织和不定芽的诱导要求。
表１ 激素对愈伤组织和不定芽再生效率的影响
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｏｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ
ｃａｌｉ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｓｈｏｏｔｓ
ＢＡ浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＡ
／（ｍｇ·Ｌ－１）
ＮＡＡ浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ＮＡＡ／（ｍｇ·Ｌ－１）
愈伤组织诱导率
Ｃａｌｉ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ／％
不定芽再生效率
Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｓｈｏｏｔ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ／％
０ ０ ８．０ｈＦ ０．０ｆＧ
０ ０．２５ ４８．０ｄｅｆｇｈＡＢＣＤＥＦ ４．０ｆＦＧ
０ ０．５０ ３２．０ｆｇｈＤＥＦ ８．０ｒｆＦＧ
０ ０．７５ ３２．０ｆｇｈＤＥＦ ４．０ｆＦＧ
０ １．００ ３２．０ｆｇｈＤＥＦ １２．０ｒｆＦＧ
０．５ ０ ２８．０ｇｈＥＦ ８．０ｒｆＦＧ
０．５ ０．２５ ５２．０ｃｄｅｆｇＡＢＣＤＥＦ ２４．０ｄｅｆＣＤＥＦＧ
０．５ ０．５０ ８０．０ａｂｃｄｅＡＢＣＤＥ ４．０ｆＦＧ
０．５ ０．７５ ６８．０ａｂｃｄｅｆｇＡＢＣＤＥ ４．０ｆＦＧ
０．５ １．００ ８８．０ａｂｃｄＡＢＣＤ ２４．０ｄｅｆＣＤＥＦＧ
１．０ ０ ３２．０ｆｇｈＤＥＦ １６．０ｅｆＥＦＧ
１．０ ０．２５ ６４．０ａｂｃｄｅｆｇＡＢＣＤＥ ４４．０ｂｃｄＢＣＤＥ
１．０ ０．５０ ５６．０ｂｃｄｅｆｇＡＢＣＤＥＦ ５０．０ｂｃＢＣ
１．０ ０．７５ ７２．０ａｂｃｄｅｆＡＢＣＤＥ ６４．０ｂＢ
１．０ １．００ １００．０ａＡ ５２．０ｂｃＢＣ
１．５ ０ ２８．０ｇｈＥＦ １２．０ｒｆＦＧ
１．５ ０．２５ ９２．０ａｂｃＡＢＣ １００．０ａＡ
１．５ ０．５０ ９６．０ａｂＡＢ ５２．０ｂｃＢＣ
１．５ ０．７５ ７６．０ａｂｃｄｅＡＢＣＤＥ ２０．０ｅｆＤＥＦＧ
１．５ １．００ ５２．０ｃｄｅｆｇＡＢＣＤＥＦ １６．０ｅｆＥＦＧ
２．０ ０ ４０．０ｅｆｇｈＢＣＤＥＦ １６．０ｅｆＥＦＧ
２．０ ０．２５ １００．０ａＡ １６．０ｅｆＥＦＧ
２．０ ０．５０ ７６．０ａｂｃｄｅＡＢＣＤＥ １２．０ｒｆＦＧ
２．０ ０．７５ ９６．０ａｂＡＢ ４８．０ｂｃＢＣＤ
２．０ １．００ ７２．０ａｂｃｄｅｆＡＢＣＤＥ ３２．０ｃｄｅＣＤＥＦ
注：数据分析采用邓肯氏新复极差法，其中大写字母和小写字母分别代表在
０．０１和０．０５水平上的差异。下同。
Ｎｏｔｅ：Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｖｉａ ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ，ａｎｄ
ｃａｐｉｔａｌ ａｎｄ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｓｈｏｗ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ０．０１ａｎｄ ０．０５ｌｅｖｅｌｓ．Ｔｈｅ ｓａｍｅ
ｂｅｌｏｗ．
注：Ａ：茎段薄层；Ｂ、Ｄ：愈伤组织和体细胞胚的再生；Ｃ：芽的再生；Ｅ、Ｆ：根的再生；Ｇ：温室苗。
Ｎｏｔｅ：Ａ：Ｔｈｉｎ ｃｅｌ ｌａｙｅｒ；Ｂ，Ｄ：Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｕｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏ；Ｃ：Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｏｔ；Ｅ，Ｆ：Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｏｏｔ；Ｇ：Ｐｌａｎｔｌｅｔ ｉｎ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ．
图１ 秋子梨茎段薄层细胞再生过程
Ｆｉｇ．１ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣＬ ｏｆ Ｐｙｒｕｓ ｕｓｓｕｒｉｅｎｓｉｓ
６９
北方园艺２０１５（０６）：９５～９８ ·生物技术·
表２ 暗培养时间对再生效率的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄａｒｋ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｓｈｏｏｔｓ
处理时间
Ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ
／ｄ
愈伤组织再生效率
Ｃａｌｉ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
／％
不定芽再生效率
Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｓｈｏｏｔｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
／％
０ ８ｂＢ １６ｂＢ
３ ３２ｂＢ ２４ｂＢ
７ ７２ａＡ ９６ａＡ
１１ ７４ａＡ ９６ａＡ
１５ ８４ａＡ ９６ａＡ
２．３ 根的诱导与再生
根的再生是组织培养是否成功的关键，研究表明，
不定根的诱导一般不需要进行预培养，待茎段薄层细胞
再生不定芽生长到约０．５ｃｍ高度时就可以直接进行生
根培养，一般在不定芽接种到生根培养基１５ｄ后即开始
产生不定根。经３０ｄ的统计结果可知，在１／２ＭＳ培养
基上，ＩＢＡ浓度为０．５ｍｇ／Ｌ时，与其它浓度相比差异性
显著，根的诱导效果达到最佳，其中根的再生率达到
６６．７％，平均生根数为３．８条（图１Ｅ、Ｆ）。但同时研究发
现，不定根诱导后经常出现根茎处输导组织不通畅的现
象，在经过温室练苗后逐渐干枯致死。
表３ 激素对不定根再生的影响
Ｔａｂｌｅ ３ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｈｏｒｍｏｎｅ ｏｎ ｒｏｏｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｈｏｏｔｓ
培养基
Ｍｅｄｉｕｍ
根再生率
Ｒａｔｅ ｏｆ ｒｏｏｔｉｎｇ／％
平均生根数
Ｎｏ．ｏｆ ａｖｅｒａｇｅ ｒｏｏｔｓ／条
１／２ＭＳ＋ＩＢＡ ０ｍｇ／Ｌ ４．２ｃＣ ０．２ｃＣ
１／２ＭＳ＋ＩＢＡ ０．５ｍｇ／Ｌ ６６．７ａＡ ３．８ａＡ
１／２ＭＳ＋ＩＢＡ １．０ｍｇ／Ｌ ３７．５ｂＢ ２．４ｂＢ
１／２ＭＳ＋ＩＢＡ １．５ｍｇ／Ｌ ３３．３ｂＢ ２．２ｂＢ
１／２ＭＳ＋ＩＢＡ ２．０ｍｇ／Ｌ ３７．５ｂＢ ２．０ｂＢ
３ 讨论
组织培养技术是工厂化育苗的技术基础，同时还为
植物的基础研究提高了材料基础和技术支撑。对于梨
的组织培养研究，前人开展了大量工作［１，７－１０］，主要以体
系优化和理论研究为主，包括的外植体类型，但对于薄
层细胞培养则无相关报道。在植物组织培养再生中，激
素是影响再生的关键因素之一，该研究以秋子梨茎段薄
层细胞为外植体进行了再生体系的优化，初步建立了梨
茎段薄层细胞的再生体系。研究表明，秋子梨薄层细胞
不定芽诱导最佳培养基为 ＭＳ＋ＢＡ １．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ
０．２５ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂糖７ｇ／Ｌ，不定根再生最
佳培养基为１／２ＭＳ＋ＩＢＡ ０．５ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼
脂糖７ｇ／Ｌ，但和其它梨的组织培养再生相比［８－１１］，虽然
外植体的数量得到一定的提高，但再生不定芽和不定根
的数量并不是很理想。推测其原因，其再生效率的差异
主要和基因型、外植体类型和激素种类有关［１２］，如郑亚
杰等［１３］和杨芳等［９］同样在秋子梨再生体系的构建中，不
同外植体对激素浓度和配比和该研究均不相同，原因即
是受基因型、外植体类型等因素的影响；同时，薄层细胞
生理状态、大小、极性和所处光暗环境等亦是影响其再
生的重要因素［１４］，推测这些也直接导致了薄层细胞再生
的不稳定，故如何获得稳定的再生效率将会是今后研究
的重点之一。
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ＺＨＯＵ Ｊｉａ－ｈｏｎｇ１，ＸＩＮＧ Ｃａｉ－ｈｕａ２，ＣＡＯ Ｈｕｉ ２，ＷＡＮＧ Ｄｅ－ｆｅｎ２，ＹＡＮＧ Ｃｈｕｎ－ｌｅｉ ２，ＬＩ Ｄｉｎｇ－ｌｉ ２
（１．Ｃｈａｎｇｄａｏ Ｆｕｔａｏ Ｄｅｓｉｇｎ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｙａｎｔａｉ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２６５８００；２．Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｑｉｎｇｄａｏ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２６６１０９）
７９
·生物技术· 北方园艺２０１５（０６）：９８～１０２
第一作者简介：高兴旺（１９８３－），男，博士，现主要从事植物分子生
物学等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｘｗ５１６＠１６３．ｃｏｍ．
责任作者：李冠（１９４９－），男，硕士，教授，博士生导师，现主要从事
植物生理生化与分子生物学等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｕａｎｌｉ＠ｘｊｕ．
ｅｄｕ．ｃｎ．
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３１２６０２５８）；新疆高技术发
展资助项目（２０１１１１１２０）。
收稿日期：２０１４－１１－１０
ＤＯＩ：１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１５０６０２７
甜瓜掌状裂叶基因ｐｌｌ的精细定位
高 兴 旺１，王 贤 磊２，宁 雪 飞２，张 自 强２，卢 浩２，李 冠２
（１．新疆大学 资源与环境科学学院，新疆 乌鲁木齐８３００４６；２．新疆大学 生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐８３００４６）
摘 要：以甜瓜掌状裂叶材料ｂｍ７和甜瓜圆叶材料Ｙ８为亲本，构建ＢＣ１ 分离群体作为作图
群体，同时利用甜瓜基因组序列，采用ＳＳＲ分子标记技术，结合混合分离分析法（ＢＳＡ），将甜瓜裂
叶基因ｐｌ 进一步定位到ＳＳＲ标记Ｇ６１和Ｇ７６之间６５ｋｐ的区间之内。结果表明：在此区域内，
共有６个候选基因，从ＭＥＬＯ３Ｃ０１０７８０到ＭＥＬＯ３Ｃ０１０７８５，其中，ＭＥＬＯ３Ｃ０１０７８４与ＡＮＴ转录因
子相似。根据文献报道，在拟南芥中过表达从椰子中克隆的ＡＮＴ基因导致叶片出现锯齿形边
缘，该表型与甜瓜株系ｂｍ７的裂叶形状具有相似性。这些结果表明ＭＥＬＯ３Ｃ０１０７８４为最可能的
候选基因。
关键词：甜瓜；裂叶；ＳＳＲ；精细定位；叶发育
中图分类号：Ｓ ６５２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１５）０６－００９８－０５
甜瓜是世界十大果蔬之一，在世界范围内广泛栽
培。新疆甜瓜以其优良品质享誉海内外，并发展成为新
疆重要的特色经济作物之一。甜瓜叶片是进行光合作
用的主要器官，其形态对甜瓜品质产生重要影响。甜瓜
叶片多为规则的扇形全缘叶。新疆农业大学的王惠林
教授在育种地发现一株叶形表现为规则掌状裂叶形态
的自然突变体，并将其命名为ｂｍ７。该突变体的获得为
深入进行裂叶形态建成的分子机制的研究提供了良好
的研究材料。
叶片形态建成的分子机制是发育生物学研究的重
要内容之一，是研究植物形态发生，尤其是多细胞生物
有机体形成机理的良好模型［１－３］。国外从２０世纪９０年
代［４］开始开展叶发育的机制研究，通过模式植物拟南芥
揭示了大量与叶片形态建成相关的基因。在研究叶片
形态建成的分子机制的过程中，发现多个基因与裂叶形
成相关，如ＣＵＣ２［５］和ＫＮＡＴ （包括ＫＮＡＴ１、ＫＮＡＴ２、
ＫＮＡＴ６）［６－１０］。但是，关于裂叶形态建成的分子机制还
是一知半解，也没有开展这方面的专门研究，国内在这
方面的研究也很少，因此，深入研究裂叶形态建成的分
子机制具有重要的理论意义。
Ｎｉｋｌａｓ［１１］研究发现，裂叶植株可以减少植株自身引
起的遮阴效应，从而有利于植株更好地接收光能［１２］。
Ｖｏｇｅｌ［１３］研究发现，裂叶有利于热扩散，可以一定程度上
降低叶片温度，从而可以减弱阳光对植物的灼伤。叶片
形态影响着植株生长状态以及光能利用效率，进而影响
作物产量和品质［１４－１５］，比较不同叶形的棉花近等基因系
（浅裂叶、适中裂叶、较大裂叶、深度裂叶）的光合效率发
现，具有适中裂叶的棉花株系表现出最高的光合效
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｔｈｉｎ ｃｅｌ ｌａｙｅｒｓ（ＴＣＬ）ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｓｈｏｏｔｓ ｏｆ Ｐｙｒｕｓ ｕｓｓｕｒｉｅｎｓｉｓ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ，
ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ａｓｅｘｕａｌ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚｅｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｙｒｕｓｕｓｓｕｒｉｅｎｓｉｓ，ｍｅａｎｗｈｉｌｅ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ
ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣＬ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｉｎ Ｐｙｒｕｓｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ＴＣＬ ｗａｓ
ａｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅｓ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｓｈｏｏｔｓ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ＭＳ＋ＢＡ １．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．２５ｍｇ／Ｌ＋ｓｕｃｒｏｓｅ ３０ｇ／Ｌ＋ａｇａｒｏｓｅ ７ｇ／Ｌ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ
１００％．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｒｏｏｔｓ ｗａｓ １／２ＭＳ＋ＩＢＡ ０．５ｍｇ／Ｌ＋ｓｕｃｒｏｓｅ ３０ｇ／Ｌ＋ａｇａｒｏｓｅ ７ｇ／Ｌ，ａｎｄ
ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｒｏｏｔｉｎｇ ｗａｓ ６６．７％．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｃａｌｕｓ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｓｈｏｏｔｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｕｎｄｅｒ ｄａｒｋ ｃｕｌｔｕｒｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｙｒｕｓ ｕｓｓｕｒｉｅｎｓｉｓ；ｔｈｉｎ ｃｅｌ ｌａｙｅｒ；ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；ｓｔｅｍ
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