全 文 ：2014 年 11 月第 21 卷第 11 期 中国中医药信息杂志 ·59·
竹节参多糖对肝细胞损伤的影响
覃玉娥 1,张长城 2,王婷 2,袁丁 2,刘朝奇 1
1.三峡大学分子生物学研究所,湖北 宜昌 443002；2.三峡大学医学院,湖北 宜昌 443002
摘要：目的 探讨竹节参多糖对脂肪变性肝细胞的保护作用。方法 制备竹节参多糖不同浓度(30%、60%
及 90%)乙醇洗脱部位,应用棕榈酸(PA)诱导 HepG2脂肪变性的细胞模型,筛选药物的干预活性,采用 MTT法观察
细胞存活状况,油红 O染色观察细胞脂肪变性情况,提取细胞总 RNA检测相关因子的表达水平。结果 MTT法
检测结果显示,30%醇沉组细胞存活率较模型组明显升高；油红 O 染色其细胞内泡状脂滴数目较模型组明显减
少；RT-PCR检测结果显示,内质网应激相关基因葡萄糖调节蛋白、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白及炎性因子
的表达较模型组明显降低。结论 竹节参多糖 30%乙醇洗脱部位能明显降低 PA诱导的 HepG2细胞脂肪变性,其
机制可能是通过干预内质网应激反应实现。
关键词：竹节参多糖；细胞脂肪变性；棕榈酸；内质网应激
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.11.018
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2014)11-0059-04
Effect of Polysaccharide from Panax japonicus on Hepatic Cell Injury QIN Yu-e1, ZHANG Chang-cheng2,
WANG Ting2, YUAN Ding2, LIU Chao-qi1 (1.Molecular Biology Research Institute of China Three Gorges
University, Yichang 443002, China；2.The Medicine College of China Three Gorges University, Yichang 443002,
China)
Abstract：Objective To explore the protective effects of polysaccharide from Panax japonicus on
free fatty acid in different parts of hepatic cell injury. Methods Polysaccharide of Panax japonicus
was prepared through different concentrations of ethanol precipitation and was named as 30%
polysaccharide component (pc), 60% pc and 90% pc. Palmitic acid (PA) was used to induce a
cellular model of steatosis in HepG2 cells in order to screen the intervention viability of
polysaccharide of Panax japonicus. MTT method was used to detect cell viability, and Oil Red O
staining was used to demonstrate steatosis. Total RNA was extracted to detect the expression level
of the relevant genes. Results MTT results showed that the 30% pc significantly increased cell
viability compared with the model group；Oil Red O staining showed that the number of
intracellular lipid droplets was significantly reduced in the 30% pc compared with the model
group；RT-PCR results showed that expressions of the endoplasmic reticulum stress-related gene
glucoese-regulated protein, CCAAT enhancer binding protein homologous protein and TNF-α were
significantly lower in the 30% pc compared with the model group, and there was no significant
difference compared with normal control group. Conclusion The 30% ethanol precipitation fraction
of polysaccharide from Panax japonicus significantly reduced PA-induced steatosis in HepG2 cells.
Its mechanism was possibly realized through intervention in endoplasmic reticulum stress-related
response.
Key words：polysaccharide of Panax japonicus；steatosis；palmitic acid；endoplasmic reticulum
stress
竹节参 Panax japonicus C.A.Mey.为五加科植
物,其干燥根茎性温、味甘、微苦,属于补益类中药,

基金项目：湖北省自然科学基金重点项目(2012FFA086)
通讯作者：刘朝奇,E-mail：ctgulcq@163.com
具有滋补强壮、散癖止痛、止血祛痰功效,在我国民
间尤其是土家族广泛使用。现代药理研究表明,竹节
参具有多种生物学活性,对氧化应激及炎症等均具有
一定的调节作用[1-2]。本实验采用不同浓度乙醇醇沉的
竹节参多糖作用于棕榈酸诱导的脂肪变性 HepG2 细
·60· Chinese Journal of Information on TCM Nov.2014 Vol.21 No.11
胞,探讨其对脂肪变性的肝细胞的保护作用。
1 实验材料
1.1 细胞与药物
HepG2 肝癌细胞株购自武汉大学中国典型培养物
保藏中心。竹节参购于湖北恩施竹节参种植基地,经
三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室鉴
定为五加科人参属植物竹节参。
1.2 主要试剂与仪器
棕榈酸(PA,Sigma 公司),二甲基亚砜(DMSO,广东
光华化学有限公司),反转录试剂盒(Thermo 公司)。倒
置荧光显微镜(ECLIPSE TE2000-S,日本尼康),全波长
酶标仪(美国 Thermo),凝胶成像分析系统(Gel logic
200,美国柯达),PCR 仪(Whatman Biometra,德国),
NU-4750E 型二氧化碳培养箱(Nu Aire,美国)。
2 实验方法
2.1 样品制备
将竹节参原料粉碎,按照竹节参与乙醇水溶液的
质量比 1∶10 浸泡在体积分数为 85%乙醇水溶液中,
浸泡 1～5 h,再加热回流提取脱脂,分离得到竹节参
粉的沉淀物,按照竹节参沉淀物与蒸馏水的质量比
1∶10 添加蒸馏水,加热回流提取 2～4 h,然后分离获
得提取物,将竹节参沉淀物再用蒸馏水重复提取 2～5
次,合并提取液,再减压浓缩,得到浓缩的水提取液；
然后加入 Sevage 试剂(质量比 1∶0.8),摇动后静置,
上清液进行离心分离,获得的上清液按照上述操作重
复 2～10 次,得到脱蛋白的上清液；再加入氨水,pH
值调至 7.0～9.0,再缓慢滴加 H2O2,在不断搅拌下使
H2O2 的体积达到所述脱蛋白上清液总体积的 1%～
5%,45 ℃下保温 4～6 h,得到一种无色溶液,即粗制
竹节参多糖。进一步加入 95%乙醇,使乙醇浓度达到体
积分数为 30%、60%、90%,室温下静置 8～10 h,1000～
3000 r/min 离心 10 min,取上清液进行真空干燥,得
到醇沉 30%、60%、90%竹节参多糖。
2.2 试剂配置
称取MTT 0.5 g,溶于100 mL PBS中,配成5 mg/mL,
用 0.22 μm 滤膜过滤除去溶液里的细菌,4 ℃避光保
存。称取 0.5 g 油红干粉,溶于少量的异丙醇,然后加
异丙醇定容至 100 mL,即 5 mg/mL,4 ℃保存备用。精
密称取 PA 粉末 256 mg,加 950 μL 的无水乙醇,再加
50 μL DMSO 溶解,配成 1 mol/L 的储备液,-20 ℃保存
备用,用时稀释。
2.3 造模
PA 是游离的饱和脂肪酸,用不同浓度的 PA 处理
培养的HepG2细胞,建立肝细胞脂肪变性的模型,通过
油红 O 染色、MTT 法等筛选出最佳的 PA 浓度。
2.4 细胞存活状况检测
2.4.1 MTT检测 培养肝癌细胞HepG2,用胰酶消化
传代,以每孔 10 000 个细胞铺 96 孔板,实验分为正常
组、模型组和竹节参多糖 30%、60%、90%醇沉组,每组
5 个复孔,待细胞贴壁生长后,加入竹节参不同醇沉部
位,每个竹节参醇沉部位分为6.25、25、100、400 μg/mL
4个浓度,然后加入PA,稀释,使其终浓度为800 μmol/L,
37 ℃、5%CO2箱培养 24 h,然后加 MTT 使其终浓度为
500 μg/mL,4～6 h 后弃掉上液,再加入 150 μL DMSO,
放摇床上 15 min,全波长酶标仪 490、570 nm 处测 OD
值。计算细胞保护率[(给药组 OD 值－模型组 OD 值)/
(正常组 OD 值－模型组 OD 值)×100%]。正常组保护
率为 100%,模型组保护率为 0%。
2.4.2 油红O染色法检测 实验分组同上,待细胞贴
壁生长良好时,加入竹节参多糖不同醇沉部位,浓度
为 100 μg/mL,然后加入 PA,其终浓度为 500 μmol/L,
培养 24 h,弃上清液,然后油红 O 染色,用冷的 PBS 冲
洗 2 遍,然后每孔加入 10%多聚甲醛 500 μL,室温固定
30 min,弃多聚甲醛,用 PBS 冲洗 2 遍,然后过滤油红,
用三蒸水稀释 3 倍(质量浓度为 1.67 g/L),每孔加入
500 μL 油红 O 液,染色 30 min 后,弃掉油红液,用 60%
异丙醇快速冲洗,晾干,倒置显微镜下拍照。油红染色
完成后,显微镜下迅速拍照,加异丙醇 150 μL,放摇床
上1 min,酶标仪500 nm处测 OD 值。
2.5 肝细胞相关因子基因水平检测
HepG2 细胞在培养瓶里生长良好时,加入竹节参
多糖不同醇沉部位,浓度为 100 μg/mL,然后加入 PA,
终浓度为 500 μmol/L,继续培养 24 h 后,按 Trizol
试剂操作说明书抽提肝细胞 RNA,测定其浓度,取总
RNA 1 μg,按照反转录试剂盒说明书在 20 μL 反转录
反应体系合成 cDNA,并进行 PCR 扩增。葡萄糖调节蛋
白(GRP78)：上游 5-TTCCTCCTGCTCCTCGTGG-3,下游
5-GCGATTCTGGTCATTGGTGATT-3；结合蛋白同源蛋
白(CHOP)：上游 5-AACCAGCAGAGGTCACAAGCAC-3,下
游 5-GCCACTTTCCTTTCATTCTCC TGT-3；肿瘤坏死因
子α(TNF-α)：上游 5-TGGCAGTTTCTGAGCAGTCGT-3,
下游 5-GATTTACCATCCAGCAGGGCTT-3；Toll 样受体
4(TLR4)：上游 5-AGACACTTTATTCAGAGCCGTTGG-3,
下游 5-TCCTCCCATTCCAGGTAGGTG-3；GAPDH：上游
5-ACTTCAACAGCGACACCCACTC-3,下游 5-TCTCTCTTC
CTCTTGTGCTCTTGC-3。引物由上海生工生物工程技术
服务公司合成。PCR 参数 94 ℃预变性 3 min；94 ℃、
30 s,55 ℃、30 s,72 ℃、30 s,25～30 个循环；最
2014 年 11
后 72 ℃延
logic 200
品各基因的
mRNA 相对水
3 统计学方
采用 S
用—x±s 表示,
差异有统计
4 结果
4.1 竹节参
影响
MTT法检
细胞保护效
浓度的 30%
剂量依赖关
经过油
红染或淡染
滴,大而多；
目较模型组
其他 2 个部
细胞脂肪变
肝细胞
用PBS洗去
示,30%醇沉
达到 107.5%
表 1 MTT法不
组别 6.2
30%醇沉组 74.7
60%醇沉组 -19.6
90%醇沉组 48.5
注：与模型组
注：A.正常组；B
图 1
月第 21 卷
伸 5 min。
凝胶成像分
灰度值与其
平。
法
PSS13.0 统计
多组间比较
学意义。
多糖不同醇
测结果显示
果优于其他
醇沉组保护率
系。见表 1。
红 O 染色发
；模型组细
竹节参多糖
明显减少,细
位效果不甚
性的保护效
脂肪变性后
残留的油红液
多糖对肝细
,且成良好的
同浓度醇沉竹节
5 μg/mL 25
0±7.34* 80.62
2±3.45 16.59
5±5.07 15.07
比较,*P＜0.05
.模型组；C.30%醇
各组 HepG2细胞
第 11 期
2%琼脂糖凝
析系统测定
内参照 GAP
软件进行分
采用方差分
沉部位对脂
,竹节参多
2 个部位,且
可达 106.

现,正常组 H
胞内胞质广
30%醇沉肝细
胞肿胀减轻
明显。说明
果最好。见
,油红染上脂
后,再用异
胞脂肪变的
剂量依赖性
参多糖肝细胞保
μg/mL 100
±7.08* 95.76±
±2.43 18.72±
±1.38 1.50±
,**P＜0.01(下同
沉组；D.60%醇沉
形态比较(油红

胶电泳,采用
平均灰度值
DH 的比值代
析。计量资
析。P＜0.05
肪变性肝细
糖30%醇沉组
400 μg/mL
4%,并且有良
epG2 胞质无
泛染色,为红
胞红泡状脂
,细胞数目
30%醇沉部位
图 1。
肪变的细
丙醇溶解,结
保护率最明
,见表 2。
护率比较(—x±s,n
μg/mL 400
9.97** 106.41±
2.98 53.18±
1.19 -4.74±
)

组；E.90%醇沉组
O 染色,×200)
中国中医药
Gel
,以样
表其
料均
表示
胞的
对肝
药物
好的
明显
色脂
滴数
增多,
对肝
胞,当
果显
显,可
＝3,%)
μg/mL
11.30**
6.17*
1.59

(下同)
30%
60%
90%
4.
因
于
组
5

够
氧
应
胞
增
CH
明

清
枸
低
mR
NA
相
对
表
达
量
/倍
信息杂志
TNF-α
表 2 油红
组别 6.25 μ
醇沉组 15.48±
醇沉组 77.88±
醇沉组 21.33±
2 竹节参多
水平的影响
模型组 GR
正常组,而 3
明显降低。


图 2
讨论
PA 是人体
增加体外培
的生成,诱导
激介导了肝
损伤模型分
加内质网应
OP 的表达及
内质网应激
Hu J 等[8
三酰甘油水
杞多糖对非
组织病理学
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
GRP
GRP78
CHOP
TLR4
TNF-α
GAPDH
A
3.5
3.0
5
2.0
5
1.0
5
0
GRP
mR
NA
相
对
表
达
量
/倍


O染色不同浓度醇
比较(—x±s
g/mL 25 μg/
1.99 54.16±
10.74* 81.36±
3.67 40.15±
糖不同醇沉
P78、CHOP、
0%醇沉组则
见图 2。
各组 HepG2细
血浆中含量
养的细胞凋
细胞氧化应
细胞凋亡[3-4]
析内质网应激
激相关基因
炎性因子 T
参与了游离脂
]发现,太子参
平,抑制 TNF
酒精性脂肪
损伤和游离
78 CHOP
B
78 CHOP

沉竹节参多糖肝
,n＝3,%)
mL 100 μg/
6.70 76.45±7.
10.08* 43.61±5.
5.85 62.64±7.
部位对肝细
TNF-α、TL
与正常组差
胞相关因子 mRNA
最多的一种
亡,可能通过
激,PA 诱导
。本实验应
相关因子,
GRP78 和
NF-α和 TLR
肪酸诱导肝
多糖能显著
-α升高。Xi
性肝炎具有
脂肪酸水平
TLR-4

C D
TLR4
·61
细胞保护率
mL 400 μg/m
56* 107.46±10.
81 41.88± 6.
94* 72.26± 9.
胞相关因子
R4 的表达量
异不大,较模
表达
游离脂肪酸,
增加细胞活
肝细胞内质
用 PA 诱导肝
结果显示PA
CCAAT/增强
4 的高表达,
细胞损伤。
降低血糖及
ao J 等[9]发现
保护作用,可
,使炎性介质
TNF-α
正常
模型
30%醇沉
60%醇沉
90%醇沉
E
TNF-α
A
B
C
D
E
·
L
43**
23
76*
基
高
型
能
性
网
细
可
子
表

血
,
降
和
·62· Chinese Journal of Information on TCM Nov.2014 Vol.21 No.11
甘露消毒丹抗肠道病毒 71型作用的体外实验研究
艾碧琛,贺又舜,赵国荣,何宜荣,龙玲,李灿,罗成宇
湖南中医药大学中医学院,湖南 长沙 410208
摘要：目的 探讨甘露消毒丹体外抗肠道病毒 71 型(EV71)的作用。方法 以病毒唑为对照药,运用细胞
培养技术,通过直接抑毒实验、治疗性抑毒实验、预防性抑毒实验、预防＋治疗性抑毒实验 4组实验观察甘露
消毒丹体外抗 EV71的病毒抑制率。结果 在直接抑毒实验、治疗性抑毒实验、预防＋治疗性抑毒实验中,甘露
消毒丹的 EV71病毒抑制率高于病毒唑；在预防性抑毒实验中,甘露消毒丹与病毒唑的 EV71病毒抑制率几乎为
零。结论 甘露消毒丹抗 EV71作用强于病毒唑,且其抗 EV71效应体现在影响 EV71复制的多个环节。
关键词：甘露消毒丹；肠道病毒 71型；体外实验
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.11.019
中图分类号：R285.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2014)11-0062-04
A Study on Anti-EV71 Effects of Ganlu Xiaodudan in Vitro AI Bi-chen, HE You-shun, ZHAO Guo-rong,
HE Yi-rong, LONG Ling, LI Can, LUO Cheng-yu (College of Tranditional Chinese Medicine, Hunan University of
Chinese Medicine, Changsha 410208, China)
Abstract：Objective To explore anti-EV71 effects of Ganlu Xiaodudan in vitro. Methods Ribavirin
was taken as control drug, with the help of cell culture to observe anti-EV71 inhibition rate of
Ganlu Xiaodudan in inhibiting-virus-directly experiment, therapeutic-inhibiting-virus experiment,
preventive-inhibiting-virus experiment and preventive-therapeutic-inhibiting-virus experiment.
Results In inhibiting-virus-directly experiment, therapeutic-inhibiting-virus experiment and
preventive-therapeutic-inhibiting-virus experiment, virus inhibition rate of Ganlu Xiaodudan was
higher than ribavirin. In preventive-inhibiting-virus experiment, virus inhibition rates of Ganlu
Xiaodudan and ribavirin both were almost zero. Conclusion Ganlu Xiaodudan has better antiviral
effects on EV71 than ribavirin, and it can affect more than one link of multiplication of EV71.
Key words：Ganlu Xiaodudan；EV71；experiment in vitro

基金项目：国家自然科学基金(81173188)；湖南省方剂学重点学科(2011－2015 年)
通讯作者：贺又舜,E-mail：cz_abc0719@163.com

趋化因子的产生减少。竹节参多糖具有抗炎镇痛、抗
衰老、促进免疫低下小鼠脾细胞增殖等作用,且毒副
作用小[5-7]。本研究表明,竹节参多糖 30%醇沉部位具
有较好的干预诱导的肝细胞损伤活性,MTT 法检测结果
显示,与模型组比较,30%醇沉多糖可显著增加细胞存
活率；RT-PCR 检测结果显示,30%醇沉多糖可降低内质
网应激反应相关因子 GRP-78、CHOP 及 TNF-α等产生。
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(收稿日期：2014-06-08；编辑：华强)