全 文 ：第 27卷第 4期
2008年 12月
武　汉　工　业　学　院　学　报Journal　of　Wuhan　Polytechnic　University Vol.27No.4Dec.2008
　　收稿日期:2008-07-08
作者简介:许彬(1983-),男 ,广东省汕头市人 ,研究生。
＊通讯作者:陈平(1955-),女 ,湖北省武汉市人,教授 , E-mail:chenpingvip24@ 163.com。
文章编号:1009-4881(2008)04-0005-04
竹节参粗多糖的初步纯化工艺研究
许　彬 ,陈　平＊
(武汉工业学院 生物与制药工程系 ,湖北 武汉 430023)
摘　要:先用乙醇对竹节参粗多糖进行分步醇沉以脱除色素 ,利用 Sevag法 、TCA法和木瓜蛋
白酶法对其进行脱蛋白 ,以多糖回收率和蛋白损失率为考察指标 ,比较三种方法对竹节参粗多
糖脱蛋白的效果。实验结果表明 ,进行 5次醇沉 ,最终乙醇浓度为 50%时沉淀出乳白色的粗
多糖 。Sevag法脱蛋白率 80.5%,多糖回收率 24%;TCA法脱蛋白率 59.8%,多糖回收率
47.3%;木瓜蛋白酶法脱蛋白率 86.7%,多糖回收率为 87.9%。可见 , 木瓜蛋白酶法能有效
去除竹节参粗多糖中的蛋白质 。
关键词:竹节参多糖;乙醇;Sevag法;TCA法;木瓜蛋白酶法
中图分类号:S567.3　　　　　　文献标识码:A
0　引言
竹节参(Panax-japonicusC.A.Mey)为五加科人
参属植物 ,是湖北省特色药用植物资源之一 ,主要分
布于鄂西地区。目前 ,已有文献报道竹节参中的粗
多糖成分具有抗疲劳作用和提高机体免疫能力 [ 1] ,
但是 ,国内对竹节参多糖的研究主要针对其粗多糖
的提取和药理作用研究 ,对竹节参粗多糖提纯方面
的研究尚未报道 。据文献报道[ 2] ,多糖的生理活性
与多糖分子量的大小有非常密切的关系。粗多糖进
行脱色素和脱蛋白以后 ,能调节体内的阴离子浓度
与一些物质的结合 ,从而提高机体免疫功能。因此 ,
为纯化竹节参粗多糖及其生物活性和有效部位之间
的关系提供样品 ,本文对竹节参粗多糖的醇沉和蛋
白质的脱除方法进行了研究。
1　材料和方法
1.1　材料
药材采用湖北省恩施产竹节参的根茎 。
1.2　试剂
苯酚(天津试剂六厂),硫酸(开封东大化工有
限公司试剂厂),无水乙醇(沈阳试剂二厂),盐酸 ,
氯仿(开封东大化工有限公司试剂厂),氢氧化钠 ,
正丁醇(天津市科密欧化学试剂开发中心),木瓜蛋
白酶(北京双旋微生物培养基制品厂),果胶酶(北
京双旋微生物培养基制品厂),纤维素素酶(和氏璧
生物科技有限公司),葡萄糖(天津市广成化学试剂
有限公司);牛血清白蛋白(上海浙沛生物科技有限
公司),考马斯亮蓝 G-250(湖南湘中地质实验研究
所),磷酸(武汉无机盐化工厂), 三氯乙酸(开封东
大化工有限公司试剂厂),水为超纯水(自制)。上
述所用试剂均为分析纯 。
1.3　仪器
UV-240IPC紫外分光光度计 (上海光谱仪器有
限公司), HH-显恒温水浴锅(国华电器有限公司),
旋转蒸发器 RE-52C(巩义市英峪予华仪器厂),高
速离心机 LG10-2.4A(北京瑞邦兴业科技有限公
司),赛多利斯酸度计 PB-10(北京赛多利斯仪器系
统有限公司),循环水式真空泵(郑州长城科工贸有
武　汉　工　业　学　院　学　报 2008年
限公司)。
1.4　实验样品的制备
称取竹节参粉末 300.0g,按料液比 1∶10加入
70%的乙醇 3000mL,搅拌回流提取 4h,抽滤 ,滤渣
挥干后称重 ,得 200.0g脱脂竹节参 。即 1.0g脱脂
竹节参相当于 1.5g竹节参原料。采用由纤维素酶
和果胶酶组成的复合酶提取脱脂竹节参中多糖成
分 ,再经离心 ,浓缩和冷冻干燥处理 ,得到竹节参粗
多糖成分含量为 42.9g。
1.5　多糖的醇沉实验
取竹节参粗多糖 4.0g,溶于 40mL水热浸提
30min,离心(4 000r/min, 15min)取上清液 ,测其多
糖浓度 ,在竹节参多糖水浸提的浓缩液中 ,加入适量
乙醇 ,调节乙醇浓度为 10%进行醇沉 ,收集沉淀;再
加入适量乙醇 ,将上清液乙醇浓度调节为 20%,进
行醇沉 ,收集沉淀;再加入乙醇 ,使上清液的乙醇浓
度为 30%进行醇沉 ,收集沉淀 ,依次类推至醇浓度
为 90%进行醇沉 ,收集沉淀 。用等体积蒸馏水溶解
多糖沉淀 ,测出各乙醇浓度醇沉下来的多糖含量。
1.6　竹节参粗多糖的脱蛋白方法
1.6.1　Sevag法脱蛋白
配制质量浓度为 1 %的粗多糖溶液 ,向粗多糖
溶液中加入该溶液等体积的 Sevag试剂 (氯仿∶
正丁醇 =4∶1),振摇 20min后静置 30min,然后离
心(4000r/min, 15min)除去沉淀 ,测定上清液中多
糖和蛋白质的含量 。上清液重复以上脱蛋白步骤 ,
直至离心无沉淀产生 。
1.6.2　三氯乙酸(TCA)脱蛋白
配制质量浓度为 1%的粗多糖溶液 ,分成 5份
等体积溶液 ,并相应加入浓度为 5%, 10%, 15%,
20%, 25%的三氯乙酸 ,均匀振摇 30min,静置过夜 ,
然后离心去除沉淀 ,上清液中加入等体积的无水乙
醇 ,摇匀静置 2h,离心收集沉淀 ,用等体积的蒸馏水
溶解 ,然后测定其多糖和蛋白质的含量。
1.6.3　木瓜蛋白酶法脱蛋白
配制质量浓度为 1%的粗多糖溶液 ,加入质量
浓度 0.4%, 0.8%, 1.2%, 1.6%, 2.0%的木瓜蛋白
酶(活力单位 100υ/mg),在其最适的 pH=6.0,最
适温度 40℃,进行酶解 2 h, 90℃灭酶 10min,离心
去除变性蛋白 ,取出上清液 ,加入等体积的无水乙醇
进行醇沉 ,离心去除上清液 ,用蒸馏水溶解沉淀 ,然
后测定其多糖和蛋白质的含量。
1.7　多糖和蛋白质的测定
竹节参多糖含量的测定:苯酚硫酸法[ 3] 。
竹节参多糖中蛋白含量的测定:考马斯亮蓝
法[ 4] 。
多糖回收率(%)=脱蛋白后多糖含量 /脱蛋白
前多糖含量。
蛋白损失率(%)=(脱蛋白前蛋白含量 -脱蛋
白后蛋白含量)/脱蛋白前蛋白含量。
2　结果与分析
2.1　竹节参粗多糖分步醇沉结果
从表 1看出 , 醇浓度为 10%、 20%、 30%及
70%、80%、90%时 ,沉淀出的竹节参多糖较少 ,当醇
浓度为 40% ～ 60%时 ,沉淀出的竹节参多糖较多 ,
其中 ,以醇浓度 50%的醇沉多糖所占比例最大。同
时 ,经过连续 5次醇沉 ,竹节参粗多糖的黄色素基本
脱除干净 ,沉淀下来的多糖为乳白色 。为方便接下
来的研究 , 选取经过 5次醇沉 , 最终乙醇浓度为
50%的乳白色多糖。
表 1　竹节参粗多糖分步醇沉结果
醇沉浓度 /% 醇沉结果 /g 平均质量 /g所占比例 /%
10 0.067 2.08 3.2
20 0.102 2.08 4.9
30 0.203 2.08 9.8
40 0.222 2.08 10.7
50 0.452 2.08 21.7
60 0.237 2.08 11.4
70 0.162 2.08 7.8
80 0.127 2.08 6.1
90 0.081 2.08 3.9
2.2　Sevag法脱蛋白结果
由图 2可见 , 随着 Sevag法脱蛋白次数的增加 ,
竹节参粗多糖中的蛋白质逐渐减少 ,但是多糖损失
率显著上升 , Sevag法脱蛋白 5次 , 脱蛋白率达到
80.5%,多糖回收率也降至 24%。
6
4期 许彬 , 陈平:竹节参粗多糖的初步纯化工艺研究
图 2　Sevag法脱蛋白结果
2.3　三氯乙酸(TCA)脱蛋白结果
从图 3可知 ,随着 TCA浓度的增加 ,竹节参多
糖中蛋白质缓慢减少 ,多糖损失率却显著增加 ,用
5%TCA时 ,脱蛋白率就达到 48.3%, 25%TCA脱蛋
白率仅达到 59.8%,而相对应的多糖回收率却分别
是 73.3%和 47.3%,多糖回收率降低速度明显快于
脱蛋白率。
图 3　TCA法脱蛋白结果
2.4　木瓜蛋白酶法脱蛋白结果
从图 4看出 ,木瓜蛋白酶能有效去除蛋白质 ,对
多糖损失小 。随着木瓜蛋白酶浓度的提高 ,蛋白质
损失率逐渐增大 ,多糖回收率基本不变。当木瓜蛋
白酶质量浓度达到 1.2%时 ,能有效去除竹节参粗
多糖中的蛋白质 ,且多糖损失较少。
图 4　木瓜蛋白酶脱蛋白结果
3　讨论
从上述竹节参粗多糖醇沉实验结果可知 ,竹节
参糖的分子量分布很广泛 ,且不同醇沉部分的多糖
分布很不均匀 , 10% ～ 30%醇浓度沉淀出的应是一
些高分子量的多糖 ,这一部分多糖在竹节参多糖中
所占比例很少 , 70% ～ 90%醇浓度沉淀出的应是一
些低分子量的多糖 ,这一部分多糖所占比例也很少 ,
40% ～ 60%醇浓度沉淀出的应是一些中等分子量的
多糖 ,这一部分多糖在竹节参多糖中所占比例较大 ,
且以 50%醇浓度沉淀出的多糖比例最大 。这表明
竹节参多糖中主要以中等分子量的多糖存在 。多糖
不溶于乙醇 ,而水溶性色素溶于乙醇 ,利用该性质除
去竹节参粗多糖中的色素 ,经 5次醇沉 ,可脱除色
素。
Sevage法脱蛋白 5次后能有效脱除蛋白质 , ,脱
蛋白率达到 80.5%,竹节参多糖回收率降至 24%。
这是因为 Sevage法脱蛋白是利用有机试剂使蛋白
质变性成胶状物沉淀而脱除 ,不可避免的使多糖部
分溶解。 TCA法脱蛋白是应用 TCA是一种强酸 ,使
蛋白质变性沉淀而去除 ,同时会使多糖链水解 ,造成
多糖损失和多糖组分发生变化。从图 4可看出 ,
TCA法脱除蛋白质的同时易造成多糖的损失 。木
瓜蛋白酶能有效去除蛋白质 ,对多糖损失小。竹节
参粗多糖成分中的蛋白质在木瓜蛋白酶作用下水解
成氨基酸 ,对多糖不影响。随着木瓜蛋白酶质量浓
度的提高 ,蛋白质损失率逐渐增大 ,多糖回收率基本
不变 。当达到 1.2%的木瓜蛋白酶时 ,蛋白质损失
率达到最大 ,继续增加木瓜蛋白酶浓度 ,蛋白质损失
率基本不变 ,这说明竹节参多糖中不仅有游离蛋白
质 ,而且有结合蛋白质。因此 ,应用质量浓度 1.2%
木瓜蛋白酶能有效去除竹节参粗多糖中的游离蛋白
质 ,对多糖损失率小 。
参考文献:
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武　汉　工　业　学　院　学　报 2008年
StudyonElementaryPurificationProcessof
thePolysaccharidesfrom
Panax-japonicusC.A.Mey
XUBin, CHENPing
(DepartmentofBiologicalandPharmaceuticalEngineering, WuhanPolytechnicUniversity, Wuhan430023, China)
Abstract:TostudyontheremovalofpigmentandproteininthepolysaccharidesfromPanaxjaponicus.C.A.Mey,
ethylalcoholwasusedtostrippigmentofpolysaccharides.Sevagmethod, TCAmethodandcaroidmethodwere
chosen.Comparedwithefectsoftheremovedproteinandtherecoveredpolysaccharide, theyieldofremoved
proteinandtherateofrecoveredpolysaccharideswereusedtoevaluatethefactorlevels.Theresultsindicatedthat
themilkpolysaccharideswasacquiredby5timesethylalcoholdepositand50% theethylalcoholdensity, theyield
ofremovedproteinandtherateofrecoveredpolysaccharideswere80.5% and24% inSevagmethod, 59.8% and
47.3% inTCAmethod, 86.7%and87.9%incaroidmethod.Theconclusionisthatcaroidmethodcanefectively
removeproteininthePolysaccharidesfromPanaxjaponicus.C.A.Mey.
Keywords:Panaxjaponicus.C.A.Meypolysaccharide;ethylalcohol;sevagmethod;TCAmethod;caroidmethod
(上接第 4页)
[ 7] 　陈复生 ,赵俊廷 ,娄源功.利用反胶束萃取技
术同时分离植物蛋白和油脂 [ J] .食品科学 ,
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Reverse Miceles for the Simultaneous
ExtractionofOilandProteinfromVegetablie
Meal[ J] .BiotechnolBioeng, 1989, 34(11):
1140-1146.
StudyontheForwardExtractionofRapseedProteinand
OilbyReverseMiceles
CHENYin-he, ZHENGJing-cheng
(ColegeofFoodScienceandEngineering, WuhanPolytechnicUniversity, Wuhan430023, China)
Abstract:Inthispaper, wemaderesearchonprocessingoftheforwardextractionofrapeseedproteinbyreverse
miceles.Therapeseedpowder, theintensityoftheion, thevalueofpHandtheextractiontime, werestudied,
andtheresultswereexplainedinmicrocosmicstructrureofreversemiceles.
Itprovedthattheoptimumconditionofforwardextractionis:0.09mol/lKCl, pH7.0, extractiontime80min.
Underthiscondition, theproteinextractionis70.19%.
Keywords:thetechnologyofreversemiceles;rapeseedprotein;forwardextraction;optimize
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