全 文 ：第 41卷　第6 期 厦门大学学报(自然科学版) Vol.41　No.6
　2002年 11 月 Journal of Xiamen University (Natural Science) Nov.2002　
文章编号:0438-0479(2002)06-0796-04
无瓣海桑 Sonneratia apertala 钙调蛋白
基因的克隆及序列分析
陈　亮 , 杨大林 , 熊玲媛 , 邵寒娟 , 林　涛 , 王鸣刚＊
(厦门大学生命科学学院 细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 ,福建 厦门 361005)
摘要:用高等植物钙调蛋白的保守序列设计两端引物 , 以红树植物海桑属无瓣海桑 Sonneratia apertala 总 DNA为模
板 ,扩增出无瓣海桑钙调蛋白基因 , 并以之构建重组质粒 pT-ACaM.经测序分析比对 , 发现无瓣海桑钙调蛋白基因全
长 1 418 bp , 其中第 1 外显子 76 bp , 第 2外显子 371 bp , 中间为一 946 bp 的内含子所隔开.编码 148 氨基酸的蛋白质 ,
其编码区序列与已知的其他高等植物的钙调蛋白基因核苷酸序列同源性高达 85%以上.而蛋白质序列同源性达
95%以上.
关键词:钙调蛋白;无瓣海桑;同源性
中图分类号:Q 343.1 文献标识码:A　　　　　　　　　　　　　　　
收稿日期:2002-07-05
作者简介:陈 亮(1963-),男 ,副教授.
＊Corrosponding auther:Tel:2186050
　　无论动物或植物 ,钙信使系统都是非常重要的
细胞信号传导途径.而钙调蛋白(Calmodulin CaM)是
一种耐热 ,酸性 ,小分子量的球状蛋白 ,是一种从低
等到高等生物普遍存在的蛋白质 ,在 Ca2+信号系统
中起重要作用.CaM在植物体内发现较晚 ,但现今已
发现 CaM 在植物体内的许多作用.CaM 调节控制许
多激酶 ,其中最重要的是对 NAD 激酶的激活 ,继而
调控植物的能量代谢[ 1] .CaM 同时也激活 Ca2+-AT-
Pase ,使胞内的多余Ca2+泵入钙池 ,恢复胞内的Ca2+
水平 ,完成细胞溶质 Ca2+负调节[ 2] .在细胞周期的
调控[ 3] ,生殖生理[ 4] ,抗逆生理[ 5] 中的也起到不容忽
视的作用.正由于它对生物体的重要作用 ,越来越多
的CaM基因被分离克隆出来 ,包括动物 、植物和微
生物等等.并且发现它在进化上是极其保守的.但是
关于耐盐植物红树的钙调蛋白研究则很少.到目前
为止还没有关于红树植物钙调蛋白的报道.红树植
物的耐盐机制的研究对于植物耐盐生理有着重要作
用.CaM作为抗逆信号传导中重要的蛋白 ,它的基因
克隆对于阐明钙信使系统对于红树植物的耐盐机理
有着重要意义.
1　材料与方法
1)材料　无瓣海桑叶片采自漳州九龙江口浮
宫引种园.
E.coli JM101菌株由本实验室保存.
2)试剂　限制性内切酶 、T4DNA ligase、PCR试
剂盒及凝胶回收试剂盒购自 Takara、Sangon 、Biolab等
公司 , 其他常规试剂均为国产分析纯.引物由上海
生物工程公司合成.
3)无瓣海桑总 DNA提取　用 CTAB法从无瓣
海桑叶片中提取总 DNA[ 6] .
4)PCR体外扩增　引物设计根据植物 CaM 基
因起始密码子和终止密码子区段高度保守的序列 ,
合成如下碱基:
5′端引物 　5′—GCGCGAATTCCGGCATGGCG-
GATCCGCTCACCGA-3′
3′端引物 　5′—GGCCAAGCTTCTCCTAGGCCAT-
CATGACCTTGAC-3′
以无瓣海桑总DNA为模板进行 PCR扩增 ,反应条件
为:94 ℃变性45 s ,55 ℃退火60 s ,72 ℃延伸60 s ,共
35个循环 ,扩增后于 72 ℃保温 10 min ,最后于 4 ℃
保存.
5)PCR扩增产物的克隆　PCR扩增产物经琼
脂糖凝胶电泳鉴定后 ,经柱式凝胶回收试剂盒回收
后 ,与T 载体在 T4DNA Ligase的作用下 12 ℃连接 1
h.按Sambrook[ 6] 的方法制备大肠杆菌 JM 101感受态
细胞 ,将 5μL 连接产物加入到 40 μL JM 101感受态
细胞中 ,冰浴 30 min ,42 ℃热激 90 s ,冰浴 2 min ,加
入无抗性 LB液体培养基 360 μL ,于 37 ℃下轻摇 45
min ,取 200μL菌液涂布含 5μg μL 氨卞青霉素和 20
μg mL X-gal的 LB平板 ,37 ℃倒置培养过夜.
6)重组子克隆的筛选鉴定　在平板上挑取白
色菌落 ,接入3 mL LB液体培养基 ,37 ℃振摇6 h.用
碱裂解法少量提取质粒 DNA并进行 PCR、单酶切和
双酶切鉴定.选择插入外源片段的重组子测序 ,并用
Blast软件进行同源序列比较和分析.
2　结果与分析
2.1　钙调蛋白基因的 PCR扩增
用稀释后的无瓣海桑总 DNA为模板 ,经 35 个
循环的 PCR扩增后得到一特异的约 1.4 kb的 DNA
片段(图 1).
2.2　扩增产物的克隆和重组克隆的鉴定
将扩增得到的 1.4 kb DNA 片段 ,与 T 载体连
接 ,并转化 JM 101 感受态细胞 ,挑取 4个氨卞青霉
素抗性的单克隆.进行 PCR和酶切分析 ,其中 3 个
重组质粒经Sma I Pst I双酶切后出现两条DNA
图 1　PCR产物及酶切的重组质粒电泳图
1.总 DNA的 PCR产物;2.pT-ACaM 的 PCR产物;3.非
重组子的 PCR 产物;4.PCR 阴性对照;5.pT-AcaM 经
Sma I Pst I双酶切
Fig.1 　Agarose gel electrophoresis of PCR product and pT-
ACaM
带 ,一条与T 载体的大小相同 ,另一条与 PCR扩增
片段大小相同 ,即 1.4 kb的特异条带(见图 1中 5).
从而证明这 3个重组克隆中插入片段为 PCR扩增
片段 ,选择其中第 2号即 pT-ACaM-2测序 ,测序结果
如图2.
2.3　无瓣海桑 CaM 的序列分析
插入片段的 DNA序列测定结果表明 ,该片段全
长 1 418 bp , 其中第 1 外显子 76 bp , 第 2 外显子
3 71bp ,中间为一946bp的内含子所隔开 ,经过拼
　　 　图 2　无瓣海桑钙调蛋白基因的核苷酸序列
下划线部分示引物;斜体部分示外显子;正体部分为内含子
　　 　Fig.2　Nucleotide sequence of Sonneratia apertala calmodulin gene
·797·第 6期　　　　　　　　陈　亮等:无瓣海桑 Sonneratia apertala 钙调蛋白基因的克隆及序列分析
　图 3　无瓣海桑钙调蛋白基因编码序列与其他物种钙调蛋白基因核苷酸序列的比较
1、2 、3、4、5、6分别表示 Sonneratia apertala CaM 、Prunus avium CaM 、Soybean CaM、Alfalfa CaM 、Vigna radiata CaM和 Oryza sativa
CaM 基因的核苷酸序列;“ +”表示与无瓣海桑的核苷酸相同;下划线部分为引物序列　Fig.3　Comparison of nucleotide sequence of calmodulin gene from Sonneratia apertala and other species
接得到红树植物无瓣海桑钙调蛋白基因 ,编码区长
447 bp ,编码 148个氨基酸.全序列如图 2所示.
2.4　无瓣海桑 CaM的编码区序列及编码蛋
白质 Blast分析
将拼接后的无瓣海桑 CaM 编码区序列经 Gen-
bank Blast比对后 ,发现与大多数高等植物CaM 如大
豆 、紫花苜蓿 、水稻等同源性很高 ,大于 85%.其编
码蛋白质一级序列更显示了其蛋白质的保守性 ,大
·798· 厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　2002年
于95%.与水稻的 CaM 蛋白质只在 8位和 11 位氨
基酸不同 ,与甜叶菊 Stevia rebaudiana CaM 的则为
100%同源.图 3 示出的为无瓣海桑 CaM 与 Prunus
avium CaM 、Soybean CaM 、Alfalfa CaM 、Vigna radiata
CaM和 Oryza sativa CaM的编码区序列比较.
3　讨　论
由于钙调蛋白在生物体内作用的重要性 ,因此
在其活性部位的突变通常是致死的 , 从 Genbank
Blast比对结果来看 ,由于引物位于基因起始区与终
止区的附近 ,虽然是覆盖了一部分的编码区序列 ,但
是由于该区段在已知的钙调蛋白基因序列中是很保
守的 ,因此可以认为对无瓣海桑的基因序列的完整
性 ,真实性没有太大的影响 ,这一点在无瓣海桑钙调
蛋白基因与其他种类的钙调蛋白基因序列同源性比
较中也再次验证.无瓣海桑的钙调蛋白的基因核苷
酸序列同高等植物之间的同源性在 85%以上:如大
豆88%;水稻 、甜叶菊 、矮牵牛 87%;小麦 、胡萝卜 、
大麦 、烟草 86%.无瓣海桑的钙调蛋白的蛋白序列
则更保守 ,同高等植物之间同源性在 95%以上 ,同
脊椎动物之间也有至少 88%的同源性.在其 4个结
构区域 8 ～ 40 、44 ～ 76 、87 ～ 223和 117 ～ 148位的氨
基酸中 ,也符合钙调蛋白的一致特性 ,即:区域 1与
3 ,2与 4之间 ,十分相似 ,它们之间的氨基酸序列有
50%是完全一样的.至此 ,证实我们克隆到的 1 418
bp的基因 ,为红树植物无瓣海桑的钙调蛋白基因.
在无瓣海桑钙调蛋白基因内部位于 76 位核苷酸后
插入了 946 bp的内含子 ,同样的情况在许多物种的
CaM 中存在 ,如水稻 、衣藻等 ,只是内含子长度各有
不同.在红树植物中钙调蛋白的功能 ,以及内含子的
插入位置之间的关系还有待于进一步研究.
参考文献:
[ 1] 　孙大业.钙调节蛋白及其在植物体内的功能[ J] .植物
生理学通讯 , 1984(6):13-19.
[ 2] 　Enyedi A , Nancy L E , Adelaida G F , et al.Protein kinase
cphosphorylates the ” a” forms of plasma membrane Ca2+
pump isoforms 2 and 3 and prevents binding of calmodulin
[ J] .Biol.Chem., 1997 , 272(44):27 525-27 528.
[ 3] 　刘建英.钙调素与细胞周期[ J] .Foreign medical sciences
of pathophysiology and clinical medicine , 1998(4):322 -
324.
[ 4] 　陈绍荣 , 韩红梅 , 吕应堂 ,等.钙调素 mRNA和蛋白在
水稻花药和雌蕊发育过程中的原位定位[ J] .植物学
报.1998 , 40(12):1 087-1 092.
[ 5] 　章文华 , 陈亚华 , 刘友良 , 等.钙在植物细胞盐胁迫信
号转导中的作用[ J] .植物生理学通讯 , 2000 , 36(4):
146-153.
[ 6] 　奥斯伯 F ,金斯顿 R T , 塞德曼 J G , 等.精编分子生物
学实验指南[ M] .颜子颖 , 王海林 , 译.北京:科学出版
社 , 1998.37-38.
Cloning and Secquencing Analysis of Calmodulin Gene
from Sonneratia apertala of Mangrove Plant
CHEN Liang , YANG Da-lin , XIONG Ling-yuan ,
SHAO Han-juan , LIN Tao , WANG Ming-gang
(School of Life Sciences , Education Ministry Key Laboratory for Cell Biology and
Tumor Cell Engineering in Xiamen University , Xiamen 361005 , China)
Abstract:The sequence was amplified using total DNA of Sonneratia apertala as the template.The PCR primers was
designed and synthesized according to the 5′-and 3′-terminal oligo nucleotide sequences of calmodulin gene of plants in
Genbank.The result of DNA sequence analysis shows that the gene is 1 418 bp length which contains 2 exons.The first
one is 76 bp , the second is 731 bp.They are interrupted by a 946 bp intron.The nucleotide sequences of ORF share
more than 85%homologies as compared with those of calmodulin genes of other several plants , the amino acid sequences
share more than 95%homologies with it.
Key words:calmodulin;Sonneratia apertala;homology
·799·第 6期　　　　　　　　陈　亮等:无瓣海桑 Sonneratia apertala 钙调蛋白基因的克隆及序列分析