全 文 ：6h。图 1、2 皆在此条件下获得。明确了电泳的类型后 , 则需选择用于分离的丙烯酰胺的浓度。后者影响孔径的大小 , 从而影响蛋白分离的效果。在实验初期 ,由于对小鼠肠组织蛋白混合物的分子量范围不清 ,而选择了 10%的胶 , 但斑点数目稀少。 进一步增大凝胶的浓度至均一的 13%,则斑点分布均匀 ,数目增多。
3.5　染色方法:蛋白质的银染色是一种高度灵敏的染色方
法 ,可检出凝胶上 0.1-0.5ng 的蛋白质样品。文献[ 3] 0.25%的银反应液浓度偏大 ,造成背景较深 ,凝胶表面黏附较多银离子 ,易使呈色液变黄及凝胶表面银膜形成。我们将银反应液浓度降为 0.12%,固定液乙醇浓度改为 40%后 ,显色过程注意多换两次液体 ,获得了满意的结果(图 1、2)。
3.6　存在的问题:在图谱中出现了水平条纹 , 虽已采取了一系列的优化策略 , 但仍然依稀可见。 故今后将重点放在如何提高双向电泳的分辨率和重复性 , 为后续的大规模分析奠定
基础。参考文献:[ 1] Donovan CO , Apweiler R , Bai roch A.The human proteomics initist ive(HPI)[ J] .Trends Biotechnol , 2001 ,19(5):178-181.
[ 2] Jungblut P R , Zimny-Arndt U , Zeindl-Ebernart E , et al.Proteomics in
human disease:cancer , heart and infectious diseases[ J] .Electrophoresis,
1999, 20(10):2100-2110.[ 3] 郭尧君.蛋白质电泳实验技术[ M] .北京:科学出版社 , 1999.141-
142.[ 4] Görg A.Two-dimensional electrophoresis of protein using immobilezed pH
gradients[ EB/OL] .http: www.Weihenstephan.de blm deg.2002.[ 5] Staudenmann W , Hatt PD , Hoving S , et al.Sample handing for proteome
analysis[ J] .Electrophoresis , 1998 , 19(6):901-908.[ 6] Görg A ,Obermaier C , Boguth G , et al.The current state of two-dimension-
al electrophoresis with immobilized pH gradients[ J] .Electrophoresis, 2000 , 21(6):1037-1053.[ 7] Rabilloud T.Solubilization of protein for electrophoretic analyses[ J] .Elec-
trophoresis, 1996 ,17(5):813-829.[ 8] Sanchez JC , Rouge V ,Pisteur M , et al.Improved and simplified in gel sam-
ple application using reswelling of dry immobilezed pH gradients[ J] .Electro-
phoresis , 1997, 18:324-327.[ 9] Gö rg A , Boguth G , Obermaier C , et al.Two-dimensional polyacrylamide
gel electrophoresis immobilezed pH gradients in the first dimensional the state of
the art and the cont roversy of vertical and horizontal systems[ J] .Electrophore-
sis, 1995 ,16(7):1079-1086.
液体悬浮培养促进蔓茎堇菜高效再生的研究代容春 ,何文锦 ,林荣华 ,朱锦懋 ,陈由强(福建师范大学生物工程学院 ,福建 福州 350007)摘要:液体悬浮培养具有促进蔓茎堇菜芽分化的作用。以叶片为外植体在培养基MS+2 , 4-D 1.5+ZT 1.0 中诱导出生长良好的愈伤组织。愈伤组织在液体培养基MS+6-BA 1.0+NAA 0.25 中振荡培养 12d 后(转速为 90r/ min),转入固体培养基MS+6-BA 2.0+NAA 0.5 中继续培养 14d , 芽分化率可达97.5%。转接至生根培养基MS+NAA 2.0+6-BA 0.25中培养 1个月后可移栽 ,成活率在 90%以上。关键词:蔓茎堇菜;液体悬浮培养;植株再生中图分类号:Q943.1　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2003)04-0025-02
Study on the Rapid Plant Regeneration of Viola diffusa Ging.by Liquid Shake Culture
DAI Rong-chun ,HE Wen-jin ,LIN Rong-hua ,ZHU Jin-mao ,CHEN You-qiang(Bioengineering College , Fujian Normal University ,Fuzhou 350007 ,China)
Abstract:The propagation of shoots of Viola diffusa Ging.can be promoted by liquid shake culture.Well-grown calli are induced from leaves in
the media of MS+2 , 4-D 1.5+ZT 1.0.The calli are cultured in the solid media of MS+6-BA 2.0+NAA 0.5 for 14 days after liquid shake
culture(90 r min)in the liquid media of MS+6-BA 1.0+NAA 0.25 for 12 days , then the inducing rate of shoots is 97.5%.The plants can be
transplanted after the shoots are cultured in the root media of MS+NAA 2.0+6-BA 0.25 for 1 month , and the living rate is over 90%.
Key words:Viola diffusa Ging.;liquid shake culture;plant regeneration
收稿日期:2003-02-11;修回日期:2003-03-17基金项目:福建省自然科学基金资助项目(B0210008)作者简介:代容春(1973-),女 ,福建仙游人 , 讲师 ,硕士 , 从事植物生理学和植物分子生物学研究 ,主持省级项目 2项 ,发表论文 6篇。
　　蔓茎堇菜(Viola diffusa Ging.)为堇菜科堇菜属植物[1] 。全草可入药 ,有清热解毒 、散瘀消肿 、去腐生肌 、清肺止咳之效。主治肝炎 、风热咳嗽 、痢疾 、痈肿疮毒 、眼睑炎 、烫伤 、毒蛇咬伤
等[ 2 , 3] 。目前 , 蔓茎堇菜组织培养已有报道 , 但在固体培养基
上分化率不高(仅为 67.9%)[ 4] 。运用液体悬浮培养促进蔓茎堇菜芽分化的研究国内外尚未见报道。本文在固体培养基础上 ,探讨液体悬浮培养促进蔓茎堇菜高效再生的研究。
1　材料与方法
1.1　材料供试材料为蔓茎堇菜(Viola diffusa Ging.)无菌苗 , 由福建
师范大学生物工程学院植物细胞工程实验室提供。
1.2　方法
1.2.1　愈伤组织的获得将无菌叶片切去外缘 , 把靠近主脉的部分切成 0.5cm2 左右的小片状 , 接种于 MS +2 , 4-D 1.5+ZT 1.0 中遮光培养 ,
25d后更换新鲜培养基 , 继代 3-4 次后得到生长良好的愈伤组织。
1.2.2　固体培养与芽分化固体培养基参照朱锦懋等的培养基[ 4] 。将上述所得的愈
伤组织切成 0.5cm3 的小块 , 转入培养基 MS+6 -BA 2.0+
NAA 0.5+琼脂 7.5g L中 , 培养 35d 后统计分化的芽数及分化率。
1.2.3　液体悬浮-固体培养与芽分化先将愈伤组织转入液体培养基 , 在一定转速下振荡培养一定时间后 ,转入固体分化培养基(与上同), 2w 后统计分化的芽数及分化率。
1.2.4　根分化与再生植株移栽待芽长高至 1cm 以上时 , 将芽从基部切下 ,转接至生根培养基中。待根长至 2-3cm 后进行移栽。先打开瓶塞进行炼苗 , 3d 后洗去根上的培养基 ,并栽入花盆。最初几天每天早晚见阳光 ,上午 10:00点至下午 3:00 点放至背光处。 1w 后即可移至室外。
2　结果与分析
2.1　固体培养与芽分化蔓茎堇菜愈伤组织在固体分化培养基上培养35d 后 ,分化率为 67.5%, 每个外植体分化的芽数为 3.1 个。
2.2　振荡速度对芽分化的影响表 1　不同振荡速度对芽分化的影响
序号 转速(r/min) 总数(个) 分化数(个) 分化率(%) 外植体平均芽个数(个)
1 50 40 21 52.5 2.7
2 60 39 22 56.4 2.6
3 70 40 27 67.5 3.1
4 80 40 32 80.0 3.9
5 90 40 33 82.5 4.2
6 100 40 26 65.0 2.5
7 110 40 - - -　　愈伤组织在液体培养基(MS+6-BA 2.0+NAA 0.5)中振荡培养 2w 后 ,转入固体分化培养基 , 其转速不同 , 则分化率及分芽数亦不同 , 如表 1所示。当转速达到 110r mim 时 , 有利于获得分散的细胞 , 而不利于愈伤组织的分化 , 中等速度(90r/
min)的振荡培养促进了愈伤组织的分化 , 而当转速过低时 , 则愈伤组织因获得氧气不足造成褐化比较严重。因此 , 转速为
90r min 比较适宜进行愈伤组织振荡培养 , 以促进愈伤组织的分化。
2.3　振荡时间对芽分化的影响振荡时间对促进愈伤组织的分化起着重要的作用。如表
2 , 振荡时间过短 ,则所起作用不明显 , 分化率及芽数未见明显变化 , 当振荡时间为12d时 , 明显促进了芽的分化 ,如果时间过长 ,则愈伤组织大量褐化死亡 , 影响芽的分化。因此 , 愈伤组织振荡培养 12d ,是愈伤组织的最佳振荡时间。表 2　振荡时间对芽分化的影响
序号 时间(d) 总数(个) 分化数(个) 分化率(%) 外植体平均芽个数(个)
1 3 40 28 70.0 3.3
2 6 40 30 75.0 3.4
3 9 40 31 77.5 3.8
4 12 40 36 90.0 4.6
5 15 40 33 82.5 4.1
6 18 40 20 50.0 2.9
7 21 38 8 21.1 1.1
2.4　液体培养基对芽分化的影响
第 13卷第 4 期:25
2003 年 8 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.13 , No.4:25
Aug.2003
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2003.04.016
由表 3 可以看出 , 固体分化培养基比较适宜作为振荡培养的培养基 ,激素种类不变而浓度稍调低时则效果最好。而其它种类的激素配比则对促进芽的分化没有明显作用甚至起到抑制作用。这与蔓茎堇菜固体分化培养基的筛选结果基本一致。因此 ,激素 6-BA1.0+NAA 0.25 是振荡培养的最佳激素组合。 表 3　不同液体培养基对芽分化的影响
序号 激素配比 总数(个) 分化数(个) 分化率(%) 外植体平均芽个数(个)
1 6-BA 2.0+NAA 0.5 40 36 90.0 4.6
2 6-BA 1.0+NAA 0.25 40 39 97.5 6.5
3 6-BA 3.0+NAA 0.75 40 31 77.5 4.3
4 6-BA 2.0 40 22 55.0 2.3
5 ZT 2.0+IBA 0.5 40 18 45.0 2.2
6 ZT 2.0+NAA 0.5 40 21 52.5 1.9
2.5　根分化与再生植株移栽芽切下转接至生根培养基MS+NAA 2.0+6-BA 0.25 中约 12d 后 ,可见白色根点长出 , 1 个月后 , 转接的芽都长出较长的根 , 植株生长良好。移栽至土壤中 , 最初几天叶子变黄 , 呈营养不良状 , 随后逐渐粗壮 , 最后长成健壮的植株 ,移栽成活率在 90%以上。
3　讨论蔓茎堇菜在固体分化培养基上分化率较低 , 芽数少。液体悬浮培养能够显著提高蔓茎堇菜芽的分化率。据报道 , 白鹤芋可以在完全液体培养条件下 , 获得高速繁殖丛芽的目
的[ 5] 。而蔓茎堇菜在完全液体培养条件下不能完成芽的分化过程 ,只有采用液体悬浮振荡培养与固体培养相结合的方法 ,获得芽分化率高且芽数多。这与悬浮振荡培养提高重瓣大岩
桐及草莓的分化率相一致[ 6 , 7] 。液体培养一方面能使外植体充分接触培养基 , 供给充足的养分 , 使芽数多 ,分化迅速 , 增殖指数高于固体培养。另一方面 , 多酚氧化物质在液体培养基中易扩散 , 使整个组织变褐甚至死亡 , 影响植物组织分化和生长。因此要根据不同的植物材料 , 应用适于该组织的液体培养条件 , 达到提高芽分化率的目的。对于蔓茎堇菜芽分化 , 宜采用液体培养与固体培养相结合的方法 , 才能获得愈伤组织的高效再生。总之 , 液体悬浮培养具有促进蔓茎堇菜芽分化的作用。以叶片为外植体在培养基 MS+2 , 4-D 1.5+ZT 1.0中诱导出生长良好的愈伤组织。 愈伤组织先在液体培养基
MS+6-BA 1.0+NAA 0.25 中进行转速 90r min 的振荡培养
12d ,再转入固体分化培养基MS+6-BA 2.0+NAA 0.5中继续培养 14d ,则分化率及芽数均有较大提高 ,分别为 97.5%和 6.5个。转接至生根培养基 MS+NAA 2.0+6-BA 0.25 中培养 1个月后可移栽 , 成活率在 90%以上。参考文献:[ 1] 福建省科学技术委员会 ,福建植物志编写组.福建植物志[ M] .第 4卷.福州:福建科学技术出版社 , 1989.2-3.[ 2]福建省中医研究所.福建药物志[M] .第 3卷.福州:福建科学技术出版社 , 1979.175-176.[ 3] 江苏新医学院.中药大辞典[M] .上海:上海人民出版社 , 1977.811.[ 4] 朱锦懋 ,代容春 ,等.蔓茎堇菜愈伤组织分化再生植株[ J] .福建师范大学学报(自然科学版),2001 , 17(1):79-83.[ 5] 马国华 ,朱西儒 ,等.液体振荡培养高速繁殖白鹤芋丛芽[ J] .园艺学报 , 1993, 20(3):307-308.[ 6] 王鸿鹤 ,葛欣 ,吴绛云.液体悬浮振荡培养快速繁殖重瓣大岩桐[ J] .植物生理学通讯 ,1999 , 35(2):126-127.[ 7] 童克明 ,郑宏清 ,等.液体振荡培养繁殖草莓无菌苗[ J] .上海农业学报 , 1994, 10(3):55-57.
耐热芽孢杆菌高温中性蛋白酶制备工艺研究
活泼1 ,茆军2 ,石玉瑚2(1.浙江科技学院生物化学工程系 ,浙江 杭州 310012;2.新疆农科院微生物所 ,新疆 乌鲁木齐 830000)摘要:为使耐热芽孢杆菌(Thermophilic Bacillus)XJT9503高温中性蛋白酶产业化并在生产中应用 , 对 XJT9503 高温中性蛋白酶的制备工艺进行了研究。结果表明 ,可采用加热真空薄膜浓缩 , 在 40℃, -0.094～ -0.096MPa 真空度下 , 经过 45 ～ 55min 浓缩 ,可使发酵处理液浓缩 2～ 3倍 , 其酶活力仅损失 10%左右。确定了采用喷雾干燥法生产固体酶制剂的最优工艺条件:进口温度
170℃、出口温度 75℃、流量 30kg·h-1 。在此条件下 , 酶得率为 68%。对固体酶与液体酶保存期稳定性的测定结果表明 ,固体酶的保存效果远比液体酶好 ,当保存 210d时 , 固体酶制剂的酶活损失仅为 2～ 8%。关键词:高温中性蛋白酶;制备工艺;喷雾干燥中图分类号:Q814.1　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2003)04-0026-02
Study on the Pilot Preparation Technology of the XJT-9503 Thermostable Neutral Protease
HUO Po
1 ,MAO Jun2 ,SHI Yu-hu2(1.Zhejiang University of S cience and Technology , Hangzhou 310012;2.Xinjiang Agriculture Academy of Science , Urumuqi 830000 , China)
Abstract:In order to industrialize the XJT9503 thermostable neutral protease and make it applied in every area of industry.The preparation techn-
ology of the XJT9503 thermostable neutral protease had been studied.The experiment results indicated that the activity of the enzyme only lost
about 10%when concentrated by using thermal spin concentrator , under the conditions of 40℃, -0.094 ～ -0.096Mpa , after 45-55min con-
centrating , the concentration of the fermentation broth could be concentrated by 2-3 times of that of original.And the solid enzyme preparation
technology — the spray-on process optimum conditions had been determined:the entrance temperature 170℃, the exit temperature 75℃, flow rate
30kg h-1.At these conditions the enzyme productivity was 68%.Compared to the liquid enzyme , the solid enzyme was more stable than the liquid
one.After storing 210 days , the activity of solid enzyme only lost about 2-8%.
Key words:thermostable neutral protease;preparation technology;spray-on process
收稿日期:2003-03-08;修回日期:2003-04-29作者简介:活泼(1962-),女 ,博士 ,副研究员 ,研究方向:生物制药。
　　蛋白酶分为酸性蛋白酶 、碱性蛋白酶和中性蛋白酶。酸性蛋白酶与碱性蛋白酶由于有较好的热稳定性 , 而最早被大量应用于食品 、洗涤 、纺织等行业。中性蛋白酶由于其作用条件温和 ,虽也被应用于食品 、洗涤 、毛纺 、丝纺 、制药 、化妆品 、皮革加工等行业 ,但是由于中性蛋白酶的热稳定性较差 , 生产与使用条件复杂 , 因而限制了它的应用范围。高温中性蛋白酶具有较好的热稳定性 ,弥补了一般中性蛋白酶的不足 , 且具有一般中性蛋白酶的优点 , 有着更为广阔的应用前景。 从而
成为国内外酶研究领域的热点[1-5] 。 XJT9503 高温中性蛋白酶是从新疆吐鲁番火焰山土壤里分离得到的一株嗜热芽孢杆菌(Thermophilic Bacillus)产生的。其最适反应温度 65℃, 最适反应 pH7.2 , 10 吨发酵罐最高发酵酶活 14934u mL。酶的性质和产率都可与现有的国际产品相妣美 ,为使 XJT9503高温中性蛋白酶产业化 ,本文对其制备中试工艺进行了系统研究。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　菌种:嗜热芽孢杆菌(Thermophilic Bacillus)XJT9503 , 新疆吐鲁番火焰山土壤里筛选而得。
1.1.2　发酵液:嗜热芽孢杆菌 XJT9503 以玉米粉 、豆饼粉 、葡萄糖等为原料 ,在罐温 46℃、转速 180r min , 通气量 1∶0.25vvm的条件下 ,发酵 18h 制得。
1.1.3　仪器与试剂:离心机(上海医用分析仪器厂);喷雾干燥机(江苏常州干燥设备有限公司);硫酸铵(A.R ,上海试四赫维化工有限公司);葡萄糖(A.R, 中国医药集团上海化学试剂公司);氯化钠(A.R, 上海试四赫维化工有限公司);95%医用酒精(上海试四赫维化工有限公司)。
1.2　方法
1.2.1　发酵液预处理:100kg发酵液中加入 150g 絮凝剂 A , 使其浓度达到 0.15%, 搅拌均匀后 , 再加入浓度为 30%絮凝剂 B使发酵液中浓度达到 0.9%, 继续搅拌 ,静置 1h ,经过 2 次离心即得澄清酶液。
1.2.2　酶液浓缩:采用加热真空薄膜浓缩法浓缩发酵处理液。将发酵液在 40℃, -0.094 ～ -0.096MPa 真空度下 , 浓缩 45 ～
55min。
1.2.3　固体酶制备方法
1.2.3.1　硫酸铵盐析法:100kg 发酵液中加入约 36kg硫酸铵 ,使硫酸铵饱和度至 55%,再加入 1%硅藻土快速过滤后风干。
1.2.3.2　喷雾干燥法:浓缩发酵液中加入氯化钠等辅料 ,控制
进口温度 170℃、出口温度 75℃、流量 30kg·h-1 ,喷雾干燥一次性制得干酶粉。
1.2.4　液体酶制备:将 40℃, -0.094 ～ -0.096MPa 真空度下 , 浓缩 45～ 55min 后的发酵液添加防腐剂 , 分装密封即可。
1.2.5　医用高温中性蛋白酶制备:发酵液经 55%硫酸铵沉淀后 ,将沉淀用无离子水悬浮 , 经反渗透超滤 , 再用 4 倍酒精沉淀即可。
1.2.6　固体酶与液体酶保存期稳定性测定:对包装后的酶制
第 13卷第 4 期:26
2003 年 8 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.13 , No.4:26
Aug.2003