全 文 ：第 16卷　第 4期
2000年 12月
福建师范大学学报 (自然科学版 )
Journal o f Fujian Teach ers Univ ersity ( Natural Science)
Vo l. 16　 No. 4
Dec. 2000
文章编号: 1000-5277( 2000) 04-0067-03
蔓茎堇菜总黄酮含量的测定⒇
陈由强1 , 林国宇2 , 代容春1 , 朱锦懋1 , 叶冰莹1 , 林荣华1
( 1. 福建师范大学生物工程学院 , 福建 福州 , 350007; 2. 福建省药材公司 , 福建 福州 , 350001)
　　摘要: 蔓茎堇菜样品经提取、 净化后 , 用紫外分光光度法测定 . 以芦丁为标准品 , 在 265 nm处测定其
总黄酮含量 . 结果表明 , 植株总黄酮含量为 2. 39% , 根总黄酮含量为 1. 08% , 细胞悬浮物总黄酮含量为
0. 76% . 研究结果可为利用蔓茎堇菜生产黄酮类药用成分提供科学根据 .
关键词: 蔓茎堇菜 ; 紫外分光光度法 ; 总黄酮 ; 芦丁
中图分类号: Q945　　　文献标识码: A
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蔓茎堇菜 (Viola dif fusa Ging. )为堇菜科 ( Violaceae)堇菜属植物 [1 ] . 全草可入药 , 有清热解毒、
散瘀消肿、 去腐生肌、 清肺止咳之效 . 化学成分主要为黄酮、 糖类、 粘液质 [2 ] . 主治肝炎、 风热咳嗽、
痢疾、 痈肿疮毒、 眼睑炎、 烫伤、 毒蛇咬伤等 [2～ 4 ] . 杭州市第四医院中医科肝炎病房用蔓茎堇菜合剂治
疗急性黄疸型肝炎 ,黄疸指数恢复正常最快的仅 3 d[ 2] . 为实现蔓茎堇菜次生代谢物黄酮的工业化生产
提供实验基础 ,作者对蔓茎堇菜细胞悬浮培养进行了研究 [5 ] .但迄今国内外未见蔓茎堇菜总黄酮含量的
测定的有关研究 . 蔓茎堇菜的化学成分主要为黄酮 , 因此 , 急需建立蔓茎堇菜总黄酮含量的测定方法 .
作者将样品提取液经聚酰胺柱层析后 , 用紫外分光光度法 , 于波长 265 nm处测定 O. D值 , 以芦丁标
准品计算总黄酮含量 , 方法简单、 准确 , 易于推广使用 .
1　材料与方法
1. 1　材料
芦丁: C27 H30O16· 3H2 O, 相对分子质量为 664. 57, 生化试剂: 上海试剂二厂 .
蔓茎堇菜样品采集自福建师范大学生物工程学院 . 由叶片诱导愈伤组织 , 经多次继代后 , 部分愈
伤组织结构变得疏松 . 挑选疏松愈伤组织再次继代 , 则可作为细胞悬浮培养的材料 . 细胞悬浮培养时
间为 10天 [ 5] . 取样测定时的悬浮细胞培养的细胞密度约为 6. 0× 105个 /ml.
样品 I: 蔓茎堇菜全植株 , 包括根部 .
样品 II: 蔓茎堇菜细胞培养悬浮物 .
样品 III: 蔓茎堇菜根部 .
1. 2　仪器
紫外 -可见光分光光度计 , 型号为 Pha rmacia Ult rospec 2000 uv /visible spect ropho tometer, 索氏
抽提装置 .
1. 3　方法
1. 3. 1　总黄酮的提取: 取适量材料 , 放置 80℃恒温箱干燥至恒重 , 取出后马上研碎 , 粉末过 60目筛 .
精密称取 3g粉末 , 置 100 ml容量瓶中 , 加入 95%乙醇 50 ml , 80℃浸提 1 h . 过滤后 , 滤渣重复浸提
两次 . 将浸提液浓缩至 50 m l后加入 2倍水 ,放置冰箱中 ,使叶绿素沉淀 .再用石油醚萃取脂溶性杂质 ,
⒇
⒇
⒇ 作者简介: 陈由强 ( 1956—　 ) , 福建福州人 , 副教授 , 博士生 , 从事植物生理学和植物分子生物学研究 .
基金项目: 福建省自然科学基金资助项目 ( B0010007) .
收稿日期: 2000- 06- 25
将下层溶液用 95%乙醇定容至 250 ml , 得到总黄酮提取液 .
1. 3. 2　总黄酮的紫外吸收曲线: 将各样品稀释 10倍后 , 用芦丁标样的 60%乙醇液 (适当浓度 ) 作对
照 , 于紫外 -可见光分光光度计上 , 在 200～ 400 nm波长范围内测定其吸收曲线 , 试剂为空白参比 .
1. 3. 3　标准曲线绘制: 精密称取芦丁标样 10 mg ( 105℃干燥至恒重 ) , 置 10 ml容量瓶中 , 加 60%乙
醇适量溶解并稀释至刻度 , 摇匀 , 精密量取 1 ml置 100 ml容量瓶中 , 加 60%乙醇稀释至刻度 , 摇匀 .
精密量取 0. 5、 1. 0、 1. 5、 2. 0、 2. 5、 3. 0、 3. 5、 4. 0、 4. 5、 5. 0、 5. 5、 6. 0、 6. 5、 7. 0、 7. 5, 8. 0 ml,
分别置 10 ml容量瓶中 , 各加 60%乙醇稀释至刻度 , 摇匀 , 于 265 nm波长处 , 测定 O. D值 , 试剂为
空白参比 , 绘制标准曲线 .
1. 3. 4　总黄酮含量的测定: 取 1 m l上述定容之提取液 ,于 10 ml容量瓶中用 60%乙醇稀释至刻度 ,摇
匀 , 于 265 nm波长处 , 测定 O. D值 , 试剂为空白参比 , 计算样品总黄酮含量 .
1. 3. 5　回收率试验: 精密称取样品粉末 3 g , 加入精密称定的 40 mg芦丁标样 , 按样品测定法进行提
取、 层析、 测定 , 得回收率平均值 .
以上测定均为 3次重复 .
2　结果与分析
2. 1　总黄酮的紫外吸收曲线
芦丁标校准溶液和样品总黄酮的紫外吸收曲线见图 1和图 2, 由图上可见样品的提取液与芦丁标
校准溶液 , 均在波长 265± 10 nm处有最大吸收 , 且图谱基本一致 . 故以此为测定波长 .
图 1　芦丁标准品紫外吸收曲线 图 2　样品提取液紫外吸收曲线
图 3　标准曲线
2. 2　标准曲线绘制
以 O. D值对芦丁标准品含量 ( mg· L- 1 )作图 , 标准曲线回归方程为 y = 0. 009+ 30. 761* x (图
2) , 其线性范围为 0～ 0. 1 mg , 相关系数 R= 0. 999, 经检验差异极显著 t= 435. 967, p < 0. 01) .
2. 3　总黄酮含量的测定
样品测定结果见表 1. 植株粉末总黄酮含量最
高 , 平均值为 2. 39% , 根粉末总黄酮含量为 1. 08
% , 细胞悬浮物粉末总黄酮含量最低 ,为 0. 76% ,仅
为植株粉末含量的 1 /3.
2. 4　回收率试验
精密称取样品 I粉末 3 g , 加入准确称定的 40
mg芦丁标样 ,按样品测定法进行提取、层析、测定 ,
得回收率平均值 (n= 3) 102. 5% , 标准差为 1. 80.
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表 1　蔓茎堇菜样品总黄酮含量测定结果 (按芦丁计算 )
样品 总黄酮含量 /% 平均值 /% S
植株粉末
2. 16
2. 55
2. 47
2. 39 0. 21
细胞悬浮物粉末
0. 75
0. 75
0. 78
0. 76 0. 02
根粉末
1. 11
1. 03
1. 09
1. 09
1. 08 0. 03
3　讨论
蔓茎堇菜因其植株小 , 且分布于山地林下、 草坡、 溪谷旁及岩石缝隙中 , 不易采收 , 故还未能推
广使用 , 多作为民间偏方 . 蔓茎堇菜自然状态下较难采摘 , 蔓茎堇菜的悬浮培养 , 规模可以较大 , 并
且操作方式比较简单 , 特别是现代工艺植物发酵罐的应用可使之成为可能 . 蔓茎堇菜细胞悬浮培养可
为实现蔓茎堇菜次生代谢物黄酮的工业化生产提供实验基础 . 本研究用紫外分光光度法 , 以芦丁标准
品计算总黄酮含量 ,结果表明样品的提取液与芦丁标准溶液 , 均在波长 265+ 10 nm处有最大吸收 , 且
图谱基本一致 . 回收率平均值 (n= 3) 为 102. 5% , 标准差为 1. 80, 故以此为测定波长 , 可较好测定
蔓茎堇菜总黄酮含量 . 测定结果还表明 , 细胞悬浮物粉末的总黄酮含量为 0. 76% , 约为植株粉末总黄
酮含量的 1 /3. 通过蔓茎堇菜细胞悬浮培养 , 可实现蔓茎堇菜次生代谢物黄酮的工业化生产 . 并且 , 可
进行高黄酮含量的单细胞株系筛选 , 提高细胞悬浮物的总黄酮含量 . 此外 , 蔓茎堇菜根部的总黄酮含
量也较高 ,达到 1. 08% ,如应用发根农杆菌的 Ri质粒对蔓茎堇菜进行遗传转化 , 诱导蔓茎堇菜毛状根
产生 , 也可望作为蔓茎堇菜总黄酮工业化大量生产的一种方法 .
参考文献:
[ 1]福建省科学技术委员会 , 福建植物志编写组 . 福建植物志 : 第四卷 [M ]. 福州: 福建科学技术出版社 , 1989. 2- 3.
[ 2] 中国科学院中国植物志编辑委员会 . 中国植物志: 第五十一卷 [M ]. 北京: 科学出版社 , 1991. 100- 101.
[ 3] 福建省中医研究所 . 福建药物志: 第三册 [ M ]. 福州: 福建科学技术出版社 , 1979. 175- 176.
[ 4] 江苏新医学院编 . 中药大辞典: 上册 [ M ]. 上海: 上海人民出版社 , 1977. 811.
[ 5] 陈由强 , 代容春 , 朱锦懋等 . 蔓茎堇菜细胞悬浮培养的研究 [ J]. 应用与环境生物学报 , 2000, 6 ( 1): 43～ 47.
Determination of Flavones in Viola diffusa Ging
CHEN You-qiang
1
, LIN Guo-yu
2
, DAI Rong-chun
1
, ZHU Jin-mao
1
, YE Bing-ying
1
, LIN Rong-hua
1
1. Bioengineering College , Fujian Teachers Univ ersity , Fuzhou 350007, China;
2. Fujian Medicinal Material Company , Fuzhou 350001, China )
Abstract: Af ter ex tracted and purified, the sample of Viola di f fusa Ging w ere determined by ul-
trav iolet spect rometric method. The rutin was used as a standa rd compound and the flavones of Viola
dif fusa Ging was quanti ta ted by measurement o f the abso rbance at 265 nm. The results show that the
content o f the whole plant is 23. 9% , the roo t, 1. 08% and the suspended cells, 0. 76% . This study
w ill provide scientific basis on producing medicinal composition of f lav ones from Viola dif fusa Ging.
Key words: Viola dif fusa Ging; ult rav iolet spectrometric method; f lav ones; rutin
(责任编辑　余　望 )
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