全 文 ：第 17卷　第 1期
2001年 3月
福建师范大学学报 (自然科学版 )
Journal o f Fujian Teach ers Univ ersity ( Natural Science)
Vo l. 17　 No. 1
Ma r. 2001
文章编号: 1000-5277( 2001) 01-0079-05
蔓茎堇菜愈伤组织分化再生植株⒇
朱锦懋1 , 代容春1 , 林国宇2 , 陈由强1 , 叶冰莹1 , 林荣华1
( 1. 福建师范大学生物工程学院 , 福建 福州　 350007; 2. 福建省药材公司 , 福建 福州　 350001)
　　摘要: 研究了蔓茎堇菜植株再生的培养条件 . 通过 L9 ( 34 ) 正交试验筛选出诱导蔓茎堇菜愈伤组织的适
合培养基为 MS+ 2, 4-D 1. 5+ ZT 1. 0; 4个激素组合即 ZT 2. 0+ NAA 0. 5、 ZT 2. 0+ IBA 0. 5、 6-BA 2. 0和
6-BA 2. 0+ NAA 0. 5可诱导出蔓茎堇菜芽 ; 诱导根分化与植株培养的适宜培养基为 MS+ NAA 2. 0+ 6-BA
(或 ZT ) 0. 25或 MS+ ( IBA+ IAA) 1. 0 + 6-BA (或 ZT ) 0. 25.
关键词: 蔓茎堇菜 ; 组织培养 ; 植株再生
中图分类号: Q945　　　文献标识码: A
　⒇⒇
蔓茎堇菜 (Viola di f f usa Ging . ) 为堇菜科堇菜属植物 [1 ] . 全草可入药 , 有清热解毒、 散瘀消肿、
去腐生肌、 清肺止咳之效 . 主治肝炎、风热咳嗽、 痢疾、 痈肿疮毒、眼睑炎、烫伤、 毒蛇咬伤等 [2, 3 ] . 但
因其植株小 , 且分布于山地林下、 草坡、 溪谷旁及岩石缝隙中 , 不易采收 . 本文作者旨在通过组织培
养方法使野生蔓茎堇菜在人为控制条件下生长 , 以扩大蔓茎堇菜药用、 食用面积 .
1　材料与方法
1. 1　植物体
蔓茎堇菜 (Viola di f f usa Ging . ) 植株 , 取自福建师范大学生物工程学院 .
1. 2　培养条件
基本培养基 M S,琼脂 7. 5 g· L- 1 ,蔗糖 30 g· L- 1 , p H5. 8. 光照 14 h,黑暗 10 h,光强 2500 Lx,
温度 25°C± 2°C.
1. 3　培养方法
1. 3. 1　外植体灭菌: 取蔓茎堇菜健康叶 (叶片、 叶柄 ) 浸入 1. 5 g /L奇强洗衣粉中浸泡约 10 min, 再
用软刷轻轻刷洗外植体表面 , 除去附着在表面的尘土和部分菌体 , 然后用自来水冲洗 , 去除污物 , 然
后入 75%乙醇中 15～ 30 s, 再用 0. 1% HgCl2浸泡 6～ 9 min , 最后用无菌水较迅速漂洗 5次 , 漂洗时
不断摇动 .
1. 3. 2　愈伤组织诱导与培养: 应用正交试验筛选出诱导愈伤组织的适宜激素配比 . 依据 3种因子和每
1因子的 3种状态选用 L9 ( 34 ) 正交表 [4 ] , 确定各试验因子的水平值 (表 1) [5, 6 ] . 按照正交表配方配制
好各种培养基 .
将灭过菌的叶片切去外缘 ,把靠近主脉的部分切成 0. 5 cm2左右的小片状 ,接种于愈伤组织诱导培
养基中 (每瓶接 5个外植体 ) , 遮光或弱光培养 . 记录各处理开始出现愈伤组织所需的时间 (即诱导天
数 ) . 30天后转接至相同新鲜培养基中 , 45天后 , 统计各处理的诱导率 .
⒇
⒇
⒇ 作者简介: 朱锦懋 ( 1958- 　 ) , 男 , 福建古田人 , 博士 , 副教授 .
基金项目: 福建省自然科学基金资助项目 ( B0001007)
收稿日期: 1999- 11- 15
表 1　因子水平表
因子水平 A
2, 4-D浓度 /mg· L- 1
B
细胞分裂素 /1 mg· L- 1
C
生长素 /1 mg· L- 1
1 0 6-BA NAA
2 0. 5 KT IBA
3 1. 5 ZT 无
1. 3. 3　芽分化诱导与培养: 将淡黄色生长良好的愈伤组织切成大小一致约为 0. 5 cm3的小块状 , 转接
至芽分化诱导培养基中 . 记录各处理中诱导芽分化所需的最短时间 (即诱导天数 ) . 30天后转接至相同
新鲜培养基中 , 2个月后 , 统计各处理的诱导率及每块愈伤组织分化出芽的个数 .
1. 3. 4　根分化诱导与植株培养: 待芽长高至 1 cm以上时 ,将芽从基部切下 , 转接至生根培养基中 . 记
录各处理生根所需的最短时间 (即诱导天数 ) . 1个月后 , 统计各处理的生根率、 平均根条数 , 测量各
处理的平均根长 , 观察各处理的植株生长状况 .
1. 3. 5　再生植株移栽: 先打开瓶塞进行炼苗 , 3天后洗去根上的培养基 , 并栽入花盆 . 最初几天每天
早晚见阳光 , 上午 10∶ 00点至下午 3∶ 00点放至背光处 . 一周后即可移至室外 .
2　结果与讨论
2. 1　愈伤组织诱导与培养
蔓茎堇菜叶柄接种后 6天 , 两端开始膨大 , 叶片在 8天后边缘膨大 , 10天后均有明显的愈伤组织
形成 , 一个月后形成大量的愈伤组织 (图 1: 1) .
表 2　 L9 ( 34 ) 试验结果表
处理号 A
1
B
2
C
3
　
4
外植体总数
/个
诱导数
/个
诱导率
/%
1 1 1 1 1 26 0 0
2 1 2 2 2 28 0 0
3 1 3 3 3 29 14 48. 3
4 2 1 2 3 25 10 40. 0
5 2 2 3 1 27 17 63. 0
6 2 3 1 2 19 18 94. 7
7 3 1 3 2 24 21 87. 5
8 3 2 1 3 24 22 91. 7
9 3 3 2 1 22 22 100
K1 48. 3 127. 5 186. 4 163. 0
K2 197. 7 154. 7 140. 0 182. 2
K3 279. 2 243. 0 198. 8 180. 0
总和= 525. 2
　　　　　　注: 本表为培养 45天的结果 .
L9 ( 34 ) 试验结果见表 2. 由显著性检验可知 , A差异极显著 , B差异显著 , C差异不显著 . 对 A、
B各水平作 Q测验可知 , A3 ( 2, 4-D 1. 5)极显著优于 A1 ( 2, 4-D 0) ,与 A2 ( 2, 4-D 0. 5)差异不显著 ; A2显
著优于 A1; B3 ( ZT) 显著优于 B2 ( K T) 和 B1 ( 6-BA) , B2、 B1差异不显著 .
因此 , 3个因子的主次顺序为 A、 B、 C, 即 2, 4-D在蔓茎堇菜愈伤组织的诱导中起主要作用 . 2,
4-D浓度为 0 mg· L- 1时 ,虽然 ZT也能诱导出愈伤组织 , 但诱导率低 , 仅为 48. 3% , 并且诱导所需的
时间较长 . 2, 4-D浓度高 ( 1. 5 mg· L- 1 ) 比低 ( 0. 5 mg· L- 1 ) 效果好 . 因此在所测试范围内 2, 4-D
浓度为 1. 5 mg· L- 1时对诱导蔓茎堇菜愈伤组织效果最好 . 细胞分裂素在蔓茎堇菜愈伤组织诱导中起
80 福 建 师 范 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 　　　　　　　　　　　 2001年　
较重要的作用 . ZT与 2, 4-D配比效果最好 ,诱导率达 100% , 并且诱导时间很短 . 6-BA和 KT则对蔓
茎堇菜愈伤组织诱导没有促进作用 . N AA和 IBA对蔓茎堇菜愈伤组织诱导没有明显作用 . 因此 ,蔓茎
堇菜愈伤组织诱导与生长的适合培养基为 MS+ 2, 4-D 1. 5+ ZT 1. 0.
2. 2　芽分化诱导与培养
愈伤组织转接至分化培养基中约 20天可观察到刚诱导出的芽 (图 1: 2) , 约 1个月后 , 各愈伤组
织均诱导出较整齐一致的芽 (图 1: 3) , 再培养半个月 , 芽可长至 1 cm以上 (图 1: 4) , 从基部切下 ,
转接至生根培养基中 .
由表 3可以看出 , 6-BA和 ZT均可诱导出蔓茎堇菜芽 , KT则不能诱导出芽 . 单一细胞分裂素 6-
BA可诱导出芽 , 而单一 ZT则对蔓茎堇菜芽的诱导没有作用 , 需要生长素 NAA或 IBA的协同作用 .
6-BA与 NAA协同作用也可诱导出芽 ,与 IBA配合则不能诱导出芽 .表 3的 4个组合诱导率都比较低 ,
均在 50%左右 , 每块愈伤组织诱导出的芽个数也比较少 , 不多于 4个 . 因此 4个激素组合即 ZT 2. 0+
N A A 0. 5、 ZT 2. 0+ IBA 0. 5、 6-BA 2. 0和 6-BA 2. 0+ N AA 0. 5可诱导出蔓茎堇菜芽 ,芽的最适宜培
养基的筛选还在进一步试验之中 .
表 3　不同激素对诱导芽分化的影响
序号 ZT KT 6-BA N AA IBA 诱导天数 /天 诱导率 /% 外植体平均芽个数 /个
1 - - - - - / 0 0
2 + - - - - / 0 0
3 + - - + - 25 46. 7 2. 29
4 + - - - + 26 57. 1 1. 81
5 - + - - - / 0 0
6 - + - + - / 0 0
7 - + - - + / 0 0
8 - - + - - 19 58. 6 2. 18
9 - - + + - 22 67. 9 3. 21
10 - - + - + / 0 0
　　注: ① 6-BA、 K T、 ZT的浓度均为 2. 0 mg· L- 1, N AA、 IBA的浓度均为 0. 5 mg· L- 1. ② “+ ” 表示含有 , “ - ” 表
示不含有 . ③本表为培养 60天的结果 .
图 1　蔓茎堇菜植株再生过程
　　注: 1. 愈伤组织 ; 2.刚从外植体分化出的芽 (培养 20天 ) ; 3. 从外植体分化出的大量整齐一致的芽 (培养 1个月 ) ; 4. 长高至 1cm
以上的芽 ; 5. 芽诱导生根 (培养 1个月 ) ; 6. 错综复杂的根系 (培养 2个月 ) ; 7. 植株在试管内开花 ; 8. 试管苗移栽成活
2. 3　根分化诱导与植株培养
芽切下转接至生根培养基中约 12天后 , 可见白色根点长出 , 1个月后 , 转接的芽都长出较长的根
81　第 1期　　　　　　　　　　　朱锦懋等: 蔓茎堇菜愈伤组织分化再生植株
(图 1: 5) . 继续培养 1个月 , 则出现错综复杂的根系 (图 1: 6) , 植株生长相当健壮 . 继续培养 , 还
可观察到花芽分化 , 看到白色的小花 (图 1: 7) .
由表 4和表 5可以看出 , N AA与 IBA+ IAA都可诱导出根 . N AA的诱导作用使蔓茎堇菜根短而
多 , IBA+ IAA的诱导作用使根长而少 . 对植株而言 , 根短而多更有利于吸收营养 ,因此植株会更粗壮
一些 . N AA与 IBA+ IAA都需要 6-BA或 ZT与之协同作用才更适合于蔓茎堇菜根的诱导 . K T则对
蔓茎堇菜根的诱导没有作用 . 单一激素 NAA也可诱导出根 , 但诱导所需时间长 ( 23天 ) , 诱导率低
( 26. 3% ) , 长出的根少而短 , 因而不适合作为蔓茎堇菜根分化诱导培养基 . 因此 , 蔓茎堇菜根分化诱
导与植株培养的适宜培养基为 MS+ NAA 2. 0+ 6-BA (或 ZT) 0. 25或 MS+ ( IBA+ IAA) 1. 0+ 6 -BA
(或 ZT) 0. 25.
表 4　根分化诱导中不同的激素配比
序号 NAA IBA+ IAA 6-BA KT ZT
1 - - - - -
2 + - - - -
3 + - + - -
4 + - - + -
5 + - - - +
6 - + - - -
7 - + + - -
8 - + - + -
9 - + - - +
　　注: ① N AA的浓度为 2. 0 mg· L- 1, IBA、 IAA的浓度均为 1. 0 mg· L- 1, 6-BA、 K T、 ZT的浓度均为 0. 25 mg· L- 1.
② “+ ” 表示含有 , “- ” 表示不含有 .
表 5　不同激素配比对根分化诱导与植株生长的影响
序号 诱导天数 /天 生根率 /% 平均根条数 /条 平均根长 /cm 植株生长状况
1 / 0 0 0 /
2 17 26. 3 1. 2 0. 30 生长缓慢 , 叶子微黄色
3 17 94. 4 5. 3 0. 62 植株粗壮 , 叶子墨绿色
4 / 0 0 0 /
5 17 90. 0 4. 9 0. 71 植株粗壮 , 叶子墨绿色
6 / 0 0 0 /
7 13 100 3. 2 1. 18 植株健康 , 叶子鲜绿色
8 / 0 0 0 /
9 17 85. 0 1. 6 2. 05 植株健康 , 叶子鲜绿色
　　　　　　注: 本表为培养 30天的结果 .
2. 4　再生植株移栽
植株移栽土壤中 , 最初几天叶子变黄 , 呈营养不良状 , 随后逐渐粗壮 , 最后长成健壮的植株 (图
1: 8) . 移栽成活率为 90% .
参考文献:
[ 1]福建省科学技术委员会 , 福建植物志编写组 . 福建植物志: 第四卷 [M ]. 福州: 福建科学技术出版社 , 1989. 2-
3.
[ 2]福建省中医研究所 . 福建药物志: 第三册 [ M ]. 福州: 福建科学技术出版社 , 1979. 175- 176.
[ 3]江苏新医学院编 . 中药大辞典: 上册 [ M ]. 上海: 上海人民出版社 , 1977.
[ 4]杜荣骞编 . 生物统计学 [ M ]. 北京: 高等教育出版社 , 1986.
82 福 建 师 范 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 　　　　　　　　　　　 2001年　
[ 5]王隆华 , 沈庆 . 正交试验法在植物生理学实验中的应用示例 [ J]. 植物生理学通讯 , 1994, 30 ( 5): 366- 367.
[ 6]林德光编著 . 生物统计的数学原理 [ M ]. 沈阳: 辽宁科学技术出版社 , 1987.
The Study on the Differentiation of Callus and the Regeneration
of Plant with Viola Diffusa Ging.
ZHU Jin-mao
1
, DAI Rong-chun
1
, LIN Guo-yu
2
, CHEN You-qiang
1
, YE Bing-ying
1
, LIN Rong-hua
( 1. Bioengineering College , Fujian Teachers Univ ersity , Fuzhou 350007 , China;
2. Fujian Medicinal Material Company , Fuzhou 350001, China)
Abstract: The study of reg enera tion o f Viola di f f usa Ging. w as car ried out. The fi t inducing
culture media of Viola di f f usa Ging. calli which w ere M S+ 2, 4-D 1. 5+ ZT 1. 0 was siev ed out by the
experiment L9 ( 3
4 ) . Four combination of di fferent hormone including ZT 2. 0+ N AA 0. 5、 ZT 2. 0+
IBA 0. 5、 6-BA 2. 0和 6-BA 2. 0+ N AA 0. 5 could induce shoo ts o f Viola di f f usa Ging. . The fi t
culture media inducing ro ots and culturing plants w ere M S+ N AA 2. 0+ 6-BA ( o r ZT) 0. 25 or M S+
( IBA+ IAA) 1. 0+ 6-BA ( or ZT) 0. 25.
Key words: Viola dif fusa Ging. ; tissue cul ture; reg eneration o f plant
(责任编辑　余　望 )
(上接第 74页 )
Effects of Cultivation Systems on the Growth
of Spirulina platensis
CHEN Bi-l ian, ZHUANG Hui-ru, WANG Ming-zi, WU Song-gang
(Bioengineering College , Fujian Teachers Univ ersity , Fuzhou 350007, China )
Abstract: Two cultiv ation systems, stationary culture ( shake four times every day ) and shaking
f lask culture ( reciprocating shaker) , w ere applied to cul tiv ate Spirul ina platensis. The results showed
that the grow th speed , biomass, chlo rophy ll a of Spirul ina were much higher in shaking f lask cul ture
( SFC) than stationary cul ture ( SC) , SFC was bui lt easily , bet ter mix ed, and it did not cause alg ae
fi lament to be broken easily than SC. The biomass of Spirulina increased to 22. 0% .
Key words: Spirulina platensis; shaking flask culture; sta tionary culture ; g row th
(责任编辑　余　望 )
83　第 1期　　　　　　　　　　　朱锦懋等: 蔓茎堇菜愈伤组织分化再生植株