全 文 ：植物资源与环境学报　2005, 14(1):6-9　　　　　　　　
JournalofPlantResourcesandEnvironment　　　　　
　　　 元宝枫蛋白酶的分离纯化及其生化性质
马　丽 1 ,邱业先 2 ,杨进军 3 ,杜天真 4
(1.安徽工业大学 , 安徽 马鞍山 243002;2.仲恺农业技术学院 , 广东广州 510225;
3.天津理工学院 , 天津 300191;4.江西农业大学 , 江西南昌 330045)
摘要:采用有机溶剂沉淀和柱层析方法 , 从元宝枫(AcertruncatumBunge)叶片中提取并纯化了叶蛋白酶。该蛋白酶
的比活性为 1 408.04U· mg-1 ,纯化倍数 50.77。以酪蛋白为底物时 , 该蛋白酶最适 pH7.5, 最适温度 60℃;该蛋
白酶在 pH5.0 ～ pH10.0范围内以及在 60℃以下较为稳定。该酶的活力能被半胱氨酸和 EDTA激活 , 但受 HgCl
2
抑制 , 具有巯基蛋白酶的特性。
关键词:元宝枫蛋白酶;酶活力;最适 pH;最适温度;抑制剂
中图分类号:Q814.1;Q946.5　　文献标识码:A　　文章编号:1004-0978(2005)01-0006-04
IsolationandbiochemicalpropertiesofaproteasefromAcertruncatumBunge　MALi1 , QIUYe-
xian2 , YANGJin-jun3 , DUTian-zhen4 (1.AnhuiUniversityofTechnology, Ma anshan243002,China;2.ZhongkaiUniversityofAgricultureandTechnology, Guangzhou510225, China;3.TianjinUniversityofTechnology, Tianjin300191, China;4.JiangxiAgriculturalUniversity, Nanchang330045,
China), J.PlantResour.＆Environ.2005, 14(1):6-9Abstract:AproteasewasextractedandpurifiedfromthefreshleavesofAcertruncatumBungebymeansofSephadexA-50, SephadexG-200 columnchromatography.Thespecificactivityoftheproteasewas
1 408.04 U· mg-1 , thepurificationtimeswas50.77.TheoptimalpHvalueoftheproteasetakingcaseinasasubstratewasaboutpH7.5, andtheoptimaltemperature60℃.Itwasrelativelystableatthe
rangingfrompH5.0topH10.0 andatthetemperaturebelow60℃.Theproteasehasthepropertiesofmercaptoproteinase, itcouldbeactivatedbycysteineandEDTA, butinhibitedbyHgCl2.Keywords:Acertruncatum Bungeprotease;enzymeactivity;optimalpH;optimaltemperature;inhibiter
　　蛋白酶是催化肽键水解的酶类 ,广泛存在于动
物内脏 、植物茎叶和果实及微生物中。由于蛋白酶
来源丰富 ,很多胞外酶具有容易提纯 、分子较小 、功
能较简单等特点 ,因而在酶学研究中蛋白酶的研究
较早也最深入 ,是比较成熟经典的研究领域之一。
蛋白酶对蛋白质具有高效专一的分解特性 ,不
同来源的蛋白酶具有不同的用途 ,广泛应用于医药 、
食品 、轻工 、化妆品 、饲料和生命科学研究等方面 ,目
前饲料工业也开始利用包括蛋白酶在内的多种酶作
为饲料添加剂。酶制剂市场需求旺盛 ,开发植物蛋
白酶新资源 ,可以缓解目前蛋白酶的供需矛盾 。
目前人们所利用的植物蛋白酶主要是木瓜蛋白
酶 、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶[ 1] 。随着研究的深
入 ,新的有使用价值的植物蛋白酶资源将会不断被
发现。 邱业 先 等的 研 究结 果 表 明 , 槭 树科
(Aceraceae)植物含有高蛋白酶活性 [ 2] 。槭树科植
物在中国分布广泛 ,为森林中常见树种之一 ,也是常
用的庭院或行道树种 ,资源丰富。为此 ,本文分离纯
化了槭树属(AcerL.)元宝枫(AcertruncatumBunge)
的蛋白酶 ,并对其性质进行了鉴定研究 ,以期为这一
优良蛋白酶资源的开发利用提供实验数据。
1　材料和方法
1.1　材料
元宝枫叶片采自江西农业大学校园内 ,为 10月
份期间生长良好的成熟叶片(均匀采集)。
收稿日期:2004-01-07
基金项目:国家自然科学基金(30060010)和江西省自然科学基金
(0030032)资助项目
作者简介:马　丽(1978-),女 , 山东泰安人 , 硕士 ,助教 , 从事蛋白
质和酶的研究工作。
1.2　方法
1.2.1　蛋白酶的分离纯化　元宝枫叶片切碎匀浆
后 ,按下列工艺流程经有机溶剂沉淀进行粗分
离 [ 3] ,然后经 SephadexA-50和 SephadexG-200进行
2次柱层析纯化 [ 4, 5] ,得到元宝枫蛋白酶纯品。
工艺流程:元宝枫叶片 ※切碎※加入 pH7.8
磷酸缓冲液匀浆※3 000 r· min-1离心 10 min※弃
渣 , 上清液 3 000 r·min-1离心 10 min※弃渣 ,上清
液加 100%丙酮※ 4 000 r· min-1离心 10 min※弃
上清液 ,沉淀冷冻干燥(粗酶)※pH7.8磷酸缓冲液
溶解※SephadexA-50层析柱※收集活力高峰管浓
缩※SephadexG-200层析柱※收集活力高峰管 ,冷
冻干燥(纯化酶)。
1.2.2 　酶活力测定 　采用福林试剂法测定酶活
力 [ 6, 7] ,以 25℃最适反应条件下 1 min水解酪蛋白
产生 1 μg酪氨酸的酶量为 1个酶活力单位(U)。
1.2.3　蛋白质含量测定　考马斯亮蓝 G-250染色
法 [ 6, 7] 。
1.2.4　最适 pH测定　室温(25℃)下 ,酶活力测定
体系用乙酸 -乙酸钠缓冲液调节 pH值为 5.0和
5.5[ 8] ,用磷酸氢二钠 -磷酸二氢钠缓冲液调节 pH
值为 6.0、6.5、7.0、7.5和 8.0[ 8] ,用 Tris-盐酸缓冲
液调节 pH值为 8.5和 9.0[ 8] ,用甘氨酸-氢氧化钠
缓冲液调节 pH值为 9.5和 10.0[ 8] , 10 min后分别
测定酶活力(重复 3次 ,取平均值)。
1.2.5　pH稳定性测定 　室温(25℃)下 , 分别在
pH值为 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、
9.5和 10.0(缓冲液体系同 1.2.4)条件下处理 30
min后测定酶活力(重复 3次 ,取平均值)。
1.2.6　最适温度测定　酶液在 pH7.5条件下 ,分
别在 20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和 80℃条件
下处理 10 min后 ,测定酶活力 (重复 3次 , 取平均
值)。
1.2.7　热稳定性测定　酶液在 pH7.5条件下 ,分
别在 20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和 80℃条件
下处理 30 min后 ,测定酶活力 (重复 3次 , 取平均
值)。
1.2.8　激活剂对酶活力的影响　在酶活力测定体
系(pH7.5, 60℃)中分别加入 1.00×10-2 ～ 6.25×
10
-4 mol· L-1 EDTA和 1.00 ×10-1 ～ 6.25×10-3
mol·L-1半胱氨酸(对照则加入蒸馏水),测定酶活
力(重复 3次 ,取平均值)。
1.2.9　抑制剂对酶活力的影响　在酶活力测定体
系(pH7.5, 60℃)中分别加入 4 ×10-7 ～ 5×10-8
mol·L-1 HgCl2(对照则加入蒸馏水),测定酶活力
(重复 3次 ,取平均值)。
2　结果和分析
2.1　元宝枫蛋白酶的纯化结果
元宝枫蛋白酶的纯化结果见表 1。从表 1可以
看出 ,经过丙酮沉淀和 SephadexA-50和 Sephadex
G-200柱层析纯化后的元宝枫蛋白酶比活力可达
1 4 0 8.0 4U/mg-1 , 但最终回收率不高 , 仅达
18.96%,造成此结果的主要原因是 SephadexG-200
步骤的回收率较低 。
表 1　元宝枫蛋白酶的纯化结果
Table1　ThepurificationresultoftheAcertruncatumBungeprotease
纯化步骤
Purificationstep
体积 /mL
Volume
总蛋白量 /mg
Totalprotein
总活力 /U
Totalactivity
比活力 /U· mg-1
Specific
activity
纯化倍数
Purification
multiple
回收率 /%
Rateofrecovery
粗提液 Roughliquid 10 74.99 2 079.36 　 27.73 1.00 100.00
离心上清液 Centrifugalupper-liquid 10 52.03 1 904.70 　 36.61 1.32 91.60
SephadexA-50柱层析 Columnchromatograph 1.93 　834.24 　432.25 15.59 40.12
SephadexG-200柱层析 Columnchromatograph 0.28 　394.25 1 408.04 50.77 18.96
2.2　元宝枫蛋白酶的生化性质
2.2.1　最适 pH值　不同 pH条件下 ,元宝枫蛋白
酶的酶活力变化见表 2。结果表明 ,元宝枫叶蛋白酶
酶促反应的最适 pH值为 pH 7.5 ,与木瓜蛋白酶
(papain, pH7.3 ～ pH 7.6),剑麻 (Agavesisalana
Perr.exEngelm.)蛋白酶(pH7.5)[ 5]等植物蛋白酶
相近 ,而低于菠萝蛋白酶(bromelain, pH8.3)[ 9] 。
2.2.2 pH稳定性 纯化的元宝枫蛋白酶在pH5.0 ～
pH10.0范围内都较稳定(表 3),酶活力差异不明显
(186.4 ～ 213.4U·mg-1),在 pH7.0和 pH7.5时
7　第 1期　　　　　　　　　　　　马　丽等:元宝枫蛋白酶的分离纯化及其生化性质
酶活力达最高 ,与木瓜蛋白酶和剑麻蛋白酶相似 ,这
些蛋白酶都在接近中性的 pH值范围内最稳定。
表 2　元宝枫蛋白酶最适 pH值测定Table2　 TheoptimalpH valueoftheAcertruncatum Bunge
protease
pH 酶活力 /U·mg-1Enzymeactivity pH
酶活力 /U· mg-1
Enzymeactivity
5.0 15.69 8.0 162.91
5.5 21.76 8.5 80.34
6.0 35.60 9.0 68.49
6.5 63.74 9.5 34.18
7.0 208.48 10.0 　 9.86
7.5 220.54
表 3　元宝枫蛋白酶的 pH稳定性
Table3　ThepHstabilityoftheAcertruncatumBungeprotease
pH 酶活力 /U·mg-1Enzymeactivity pH
酶活力 /U· mg-1
Enzymeactivity
5.0 186.4 8.0 205.3
5.5 202.1 8.5 208.4
6.0 198.4 9.0 205.1
6.5 200.3 9.5 200.1
7.0 213.4 10.0 197.2
7.5 210.6
2.2.3　最适温度　不同温度下 ,元宝枫蛋白酶的酶
活力见表 4。结果表明 ,以酪蛋白为底物 ,元宝枫蛋
白酶的酶促反应最适温度为 60℃,当温度达 70℃
时 ,酶活力显著下降。
表 4　元宝枫蛋白酶最适温度测定
Table4　TheoptimaltemperatureoftheAcertruncatumBungeprotease
温度 /℃
Temperature
酶活力 /U· mg-1
Enzymeactivity
温度 /℃
Temperature
酶活力 /U· mg-1
Enzymeactivity
20 130.16 60 551.58
30 146.52 70 176.31
40 220.54 80 156.21
50 534.14
2.2.4　热稳定性　元宝枫蛋白酶在 60℃以内具有
较好的稳定性(表 5),温度高于 70℃后 ,酶活力急剧
降低 ,酶活力仅为最大活力的 29.17%。
2.2.5　EDTA对元宝枫蛋白酶活力的影响　不同浓
度 EDTA对元宝枫蛋白酶活力的影响见表 6。结果
表明 , EDTA具有激活元宝枫蛋白酶的作用 ,加入不
同浓度的 EDTA,酶活力均大于对照 ,并且激活程度
随 EDTA浓度增加而增大。
表 5　元宝枫蛋白酶的热稳定性
Table5　ThetemperaturestabilityoftheAcertruncatumBunge
protease
温度 /℃
Temperature酶活力 /U· mg
-1
Enzymeactivity
温度 /℃
Temperature 酶活力 /U· mg
-1
Enzymeactivity
20 254.38 60 423.41
30 279.27 70 123.51
40 382.46 80 85.36
50 400.28
表 6　EDTA对元宝枫蛋白酶活力的影响 1)
Table6　TheefectofEDTAonactivityoftheAcertruncatumBunge
protease1)
EDTA浓
度 /mol· L-1
Concentration
ofEDTA
酶活
力 /U· mg-1
Enzyme
activity
EDTA浓
度 /mol· L-1
Concentration
ofEDTA
酶活
力 /U· mg-1
Enzyme
activity
CK 551.58　　　 2.50×10-3 623.95(13.12)
6.25×10-4 564.54(2.35) 5.00×10-3 645.57(17.04)
1.25×10-3 582.36(5.58) 1.00×10-2 696.92(26.35)
　1)括号中的数值表示与对照相比酶活力提高的百分率 　The
numbersinbrackletsindicatethepercentageofenzymeactivity
increasingcomparingwithCK.
2.2.6　半胱氨酸对元宝枫蛋白酶活力的影响　不
同浓度半胱氨酸对元宝枫蛋白酶活力的影响见表 7。
结果表明 ,半胱氨酸对元宝枫蛋白酶具有较强的激
活效果 ,在 6.25×10-3 ～ 1.00×10-1 mol· L-1的浓
度范围里 ,随半胱氨酸浓度的增加激活效果增强 ,这
与前人报道的木瓜蛋白酶等植物蛋白酶受半胱氨酸
激活的效果是一致的 。
表 7　半胱氨酸对元宝枫蛋白酶活力的影响 1)
Table7　TheeffectofcysteineonactivityoftheAcertruncatum
Bungeprotease1)
半胱氨酸浓
度 /mol· L-1
Concentration
ofCys
酶活
力 /U· mg-1
Enzyme
activity
半胱氨酸浓
度 /mol· L-1
Concentration
ofCys
酶活
力 /U· mg-1
Enzyme
activity
CK 551.58　　 　 2.50×10-2 751.53(36.25)
6.25×10-3 607.18(10.08) 5.00×10-2 816.49(48.03)
1.25×10-2 682.46(23.73) 1.00×10-1 923.95(67.51)
　1)括号中的数值表示与对照相比酶活力提高的百分率 　The
numbersinbrackletsindicatethepercentageofenzymeactivity
increasingcomparingwithCK.
2.2.7　HgCl2对元宝枫蛋白酶活力的影响　不同浓
度 HgCl2对元宝枫蛋白酶活力的影响见表 8。结果
表明 , HgCl2对元宝枫蛋白酶活力具有抑制作用 ,并
且在 5×10-8 ～ 4×10-7 mol· L-1的浓度范围内随
HgCl2浓度的增高抑制作用加强 。
8 　　　　　　　　　　植 物 资 源 与 环 境 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 14卷　
表 8　HgCl2对元宝枫蛋白酶活力的影响 1)Table8　TheefectofHgCl2 onactivityoftheAcertruncatumBungeprotease1)
HgCl2浓
度 /mol· L-1
Concentration
ofHgCl2
酶活
力 /U· mg-1
Enzyme
activity
HgCl2浓
度 /mol· L-1
Concentration
ofHgCl2
酶活
力 /U· mg-1
Enzyme
activity
CK 551.58　　　 2×10-7 488.81(11.38)
5×10-8 530.23(3.87) 3×10-7 418.10(24.20)
1×10-7 505.41(8.37) 4×10-7 374.79(32.05)
　1)括号中的数值表示与对照相比酶活力提高的百分率 　The
numbersinbrackletsindicatethepercentageofenzymeactivity
increasingcomparingwithCK.
3　结论和讨论
本文对元宝枫蛋白酶的提取及纯化做了初步探
索 , 纯化的元宝枫蛋白酶的比活力可达 1 408.04
U· mg-1 ,但回收率不高 ,仅为 18.96%,主要原因
是 SephadexG-200步骤的回收率低。
元宝枫蛋白酶的酶促反应最适 pH值 、最适温
度 、pH稳定性和热稳定性等性质与木瓜蛋白酶和无
花果蛋白酶(ficin)等植物巯基蛋白酶相似。
目前人们已利用的植物蛋白酶主要有木瓜蛋白
酶 、菠萝蛋白酶 、无花果蛋白酶 、剑麻蛋白酶和骆驼
刺(AlhagisparsifoliaShap.exKeleretShap.)蛋白
酶 ,但是这些植物多产自热带地区 ,产地温度高 ,从
生产地到销售地需要经过长距离运输 ,这些都对酶
活力的保持极为不利 ,因而在热带以外地区开发新
的蛋白酶资源极为重要 。槭树科植物如元宝枫 ,不
仅蛋白酶含量高 ,而且性能好 ,是可替代木瓜等植物
制取蛋白酶的新资源之一 。
参考文献:
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季节变化 [ J] .江西农业大学学报 , 2003, 25(5):652-655.
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化性质研究 [ J] .江西农业大学学报 , 1996, 18(1):46-50.
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[ 5] 　许智强 ,徐凤彩 , 李明启.剑麻蛋白酶的分离纯化及其部分特
性的研究[ J] .植物学报 , 1993, 35(3):171-178.
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(责任编辑:惠　红)
《云南植物研究 》征订启事
　　《云南植物研究》是国家科委(79)国科发条字 341号文
批准创办的植物学专业学报 , 是中国科学院主管的全国性自
然科学期刊 , 现已成为中国植物科学研究发表论文的主要学
术性刊物之一 , 为中国生物学类科技核心期刊 、中国自然科
学核心期刊。本刊荣获中国科学院优秀期刊二等奖(1996)
及一等奖(2000)、第二届全国优秀期刊三等奖(1997)及云
南省优秀科技期刊一等奖(1997)等 , 2001年进入中国期刊
方阵 , 并入选国家 “双效期刊” 。所发表的论文被 CA、BA、
CABS、中国生物学文摘 、中国林业文摘 、中国药学文摘 、中国
科学引文数据库 、万方数据库及中国学术期刊(光盘版)等
国内外数据库所收录。凡从事植物学各分支学科研究的科
研人员及各大专院校的植物学教师及学生均可订阅本刊。
本刊报道植物学各分支学科具有创新水平的原始研究
论文和简报 ,植物学领域的新发现及重大应用价值的新成果
快报;结合本人研究工作 , 反映国际最新研究水平的短篇综
述等。中英文稿件均受欢迎。撰稿格式请参见本刊 “征稿简
则”要求。本刊论文发表周期 6 ～ 10个月 , 热情欢迎同行学
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9　第 1期　　　　　　　　　　　　马　丽等:元宝枫蛋白酶的分离纯化及其生化性质