全 文 ：天然四倍体紫花地丁的体细胞染色体观察
徐传远，王丽萍，王晶晶 (河北理工大学化工与生物技术学院，河北唐山 063009)
摘要 ［目的］了解药用植物紫花地丁的植物分类及区域分布，为其提供细胞学资料。［方法］分别随机采集 50株野生紫花地丁的幼蕾
及 50株成熟野生紫花地丁的果实，经预处理后，对子房细胞及根尖细胞进行卡宝品红染色及染色体观察并计数。［结果］对 50株野生
紫花地丁的子房，用 8-羟基喹啉溶液预处理，进行子房细胞染色体制片，经光学显微镜镜检后，共得到 127 个可染色体计数的子房细胞;
50株野生紫花地丁的种子经发根培养，8-羟基喹啉溶液预处理，进行根尖体细胞染色体制片后，共得到 92 个可染色体计数的细胞。这
219个可染色体计数的体细胞的染色体数目均为 48。［结论］发现了一个紫花地丁的天然四倍体种群，其体细胞染色体数目为 48。
关键词 紫花地丁;四倍体;体细胞;染色体数目
中图分类号 S567． 2 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2010)28 －15503 －01
Observation of the Chromosome in the Somatic Cell of Natural Tetraploid Viola yedoensis Makino
XU Chuan-yuan et al (College of Chemical Engineering and Biological Technology，Hebei Polytechnic University，Tangshan，Hebei
063009)
Abstract ［Objective］The data for the research on the cytology of tetraploid Viola yedoensis Makino was provided through investigation of the
classification and the regional distribution of the medicinal plant． ［Method］The immature bud and mature fruits of 50 wild plants were ran-
domly collected and the chromosome in the cells of root tip and ovary was observed and counted after the samples were pretreated and stained．
［Results］After the ovary of 50 wild plants were pretreated with 8-hydroxyquinoline solution and dyed，then，the chromosome in cell was ex-
amined by means of optical microscopy，and the chromosome in total of 127 cells could be counted． The root from seed-germinating of 50 wild
plants were pretreated with 8-hydroxyquinoline solution and dyed，and the chromosome in total of 92 cells could be counted． The chromosome-
counting result of 219 cell indicated that the number of chromosome in the somatic cell of tetraploid Viola yedoensis Makino was 48． ［Conclu-
sion］A natural tetraploid populations of Viola yedoensis Makino was found，in which somatic cell，the number of chromosome was 48．
Key words Viola yedoensis Makino;Tetraploid;Somatic cell;Number of chromosome
基金项目 唐山市科技局项目(09120202c)。
作者简介 徐传远(1978 － ) ，男，山东长清人，博士，讲师，从事植物分
子细胞遗传研究。
收稿日期 2010-07-21
紫花地丁(Viola yedoensis Makino) ，为堇菜科堇菜属多年
生草本植物，除青海、西藏外全国各地均有分布［1］。其干燥
全草为中药“紫花地丁”［2］，为常见中药之一。全草入药，性
苦、辛、寒，入心、肝经，具有清热解毒、消痈散结的功效［3］。
紫花地丁之名最早见于唐代孙思邈所著的《备急千金要方》，
但长期以来，该药的品种及类型较为复杂，各地又有不同的
用药习惯。笔者对在唐山市区随机采集的紫花地丁进行体
细胞染色体观察，旨在为植物分类及区域植物的研究提供细
胞学资料。
1 材料与方法
1． 1 材料 紫花地丁花期时，在唐山市区随机抽取 10 个地
点，每个地点随机采集 5 个单株的幼蕾;在紫花地丁果实成
熟期时，以同样的方法采集了 50个单株的成熟蒴果。
1． 2 方法
1． 2． 1 子房有丝分裂相细胞的制备。用解剖刀剥取紫花地
丁幼蕾的子房，于 22 ℃下，置于 0． 002 mol /L 的8-羟基喹啉
溶液中处理 3 h，取出，置于卡诺固定液(乙醇∶乙酸 =3∶ 1)中
24 h以上备用。
1． 2． 2 根尖有丝分裂相细胞的制备。25 ℃下，于遮光处，将
成熟的紫花地丁种子置于培养皿中发根培养。待根长 1 cm
左右，截取根尖的分生区，于 22 ℃下，置于 0． 002 mol /L 的
8-羟基喹啉溶液中处理 3 h，取出，置于卡诺固定液(乙醇∶乙
酸 =3∶ 1)中 24 h以上备用。
1． 2． 3 体细胞染色体观察。将制备好的子房和根尖自固定
液中取出，置于 1 mol /L盐酸中，60 ℃下，解离 8 min。清水
漂洗 3 min，常规压片，卡宝品红染色，油镜下观察并拍照。
2 结果与分析
对供试的 50株野生紫花地丁的子房进行子房体细胞染
色体制片，经光学显微镜镜检后，共得到 127 个可染色体计
数的子房细胞，这 127 个子房体细胞的染色体数目无一例
外，均为 48。50株野生紫花地丁的种子经发根培养，进行根
尖体细胞染色体制片后，经光学显微镜镜检，共得到 92 个可
染色体计数的细胞，这 92 个可染色体计数的根尖体细胞的
染色体数目也均为 48(图 1)。所以通过紫花地丁体细胞染
色体制片及镜检观察，发现所有可以计数的总共 219 个体细
胞(子房细胞或根尖细胞)的染色体数目均为 48，即该紫花
地丁种群的染色体数目为 48。
图 1 2n =4x =48的紫花地丁根尖细胞
Fig． 1 The root tip cell of Viola yedoensis Makino(2n =4x =48)
3 讨论
紫花地丁的染色体数目很早之前已经有相关报道，但其
数目均为 24［4 －5］。所以笔者在唐山市区采集并镜检的紫花
地丁应为天然四倍体种群，即 2n =4x =48。由于基因数目的
(下转第 15509页)
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2010，38(28):15503，15509 责任编辑 李菲菲 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2010.28.094
存环境，因此应指明使用的培养基、血清种类、用量以及细胞
生存的适宜 pH 值等［1］。多重比较结果显示，在采用 RP-
MI1640培养液培养的条件下，第 6 组处理条件显著优于第 2
组和第 3组处理(P ＜0． 05) ;与 DMEM培养液培养的条件相
比较，第 6 组处理极显著优于第 10、11、12、18 组处理(P ＜
0. 01) ，同时显著优于第 14、15、16、17 组处理。另外，细胞的
贴壁状况和生长状况也证明了第 6 组处理要优于其他各组
处理。可见，Hepa1-6细胞在含有 20%血清的 RPMI-1640 培
养基，接种密度为 4 × 104 个 /cm2，100 U /ml 的双抗浓度，贴
壁率在 90%以上，D-Hanks漂洗 1 次，0． 5%胰蛋白酶消化 2
min的条件下，传代效果最好。
血清含量是影响细胞增殖的一个非常重要的因素，研究
表明，当培养基中血清浓度在 15% ～20%时，细胞生长较好;
当超过 30%时，反而不利于细胞的生长［1］。为了降低培养成
本，血清含量可以适当降低，大多细胞在 10%以上都能增殖，
而 Hepa1-6细胞增殖缓慢，因此要求血清含量较高。迄今为
止，人工合成的培养基已有多种，如 RPMI-1640、Eagle’s
MEM、DMEM、Ham’s F12等，其主要差别在于氨基酸、维生
素、无机盐和能源物质的组成以及含量不同。一般认为［6］，
RPMI-1640营养全面，对各种组织生长都适用;Eagle’s 和
MEM适合于细胞株的传代培养;DMEM 有利于细胞的分裂
增殖;Ham’s F12能促进细胞的分化。也有学者将不同培养
基混合应用，得到较好的培养效果。在该研究中主要采用
RPMI-1640和 DMEM。结果表明，在培养 Hepa1-6 细胞过程
中，RPMI-1640优于DMEM。目前，还没有关于RPMI-1640和
DMEM培养 Hepa1-6细胞的差异性比较研究，但李欣等［7］对
人肝癌细胞 HepG2 研究表明，采用 RPMI-1640培养肝癌细胞
HepG2 要比采用 DMEM 和 MEM 培养生长状态好。细胞接
种密度也是影响细胞传代是否成功的重要因素，首次传代的
细胞，接种密度应该大一些，经传代后的细胞可以适当降低
接种密度［8］。该试验中，采用了 3 个密度梯度，结果表明采
用 4 ×104 个 /cm2 接种密度的效果最为理想，细胞密度太小，
不易贴壁，密度太大，悬浮的死细胞比较多，影响细胞的增
殖。双抗浓度对于细胞传代的影响并不是很大，有人建议在
条件控制比较好的情况下可以不加抗生素，尤其在药物筛选
过程中，抗生素过高对试验结果有一定影响，但为了防止污
染，通常将抗生素控制在 100 U /ml 左右。同时，试验中还设
计了漂洗次数对传代细胞的影响，观察发现，在传代过程中，
漂洗 1 ～2次就可以杜绝残留培养液中血清对酶的抑制。胰
蛋白酶的浓度和消化时间是影响消化效果的关键，Hepa1-6
细胞贴壁较为牢固，该研究发现 0. 125%胰蛋白酶室温条件
下在 3 min内很难使贴壁的细胞脱落;0． 25%胰蛋白酶在 3
min内可以使 50%的细胞脱落;0. 5%胰蛋白酶在 2 min内就
可以使其完全变圆脱落;消化不够充分的细胞吹打脱落传
代，聚集到一起的细胞较多，贴壁不均匀，影响细胞增殖。因
此，采用较高浓度的胰蛋白酶短时间消化，传代可以达到很
好的效果。
综上所述，在细胞传代培养过程中，很好地把握影响细
胞贴壁与增殖的关键因素，探索出所培养细胞的最佳培养条
件，既能够降低细胞培养的成本，又能够节约时间，从而为试
验的顺利开展奠定基础。
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443 －450．
(上接第 15503 页)
加倍为多倍体植物的进化准备了充足的物质基础。多倍体
植物被认为在进化上优于其二倍体亲本，且常生长于与亲本
不同的生境［6］。多倍体植株在营养生长方面常常优于二倍
体亲本，表现为营养物质及次生代谢物质积累量的增加。作
为一种常见中药，天然四倍体紫花地丁的药用价值可能要高
于二倍体，所以具有较高的研究及利用价值。下一步，笔者
将对其减数分裂情况进行研究，以更好地了解四倍体紫花地
丁的细胞学特征。
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