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(收稿:2013-08-09;修回:2013-10-24)
(编辑 邓强庭
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文章编号:1000-5404(2014)02-0143-02 个案与短篇
竹节参总提物对 H2O2诱导 SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用
杨 莉，袁 丁，代艳文，狄国杰，张长城，刘朝奇，王 婷 (443002 湖北宜昌，三峡大学医学院中药药理科研三级实验室)
［关键词］ 竹节参总提物;H2O2;氧化应激;凋亡
［中图法分类号］ Ｒ285． 5 ［文献标志码］ B
［基金项目］ 国家自然科学基金(81100957);湖北省自然科学基金(2010CDB
10703) ;三峡大学博士启动基金(KJ2009B077)
［通信作者］ 王 婷，电话:(0717)6397466，E-mail:tingting0301@ 126． com
［优先出版］ http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /51． 1095． Ｒ． 20131012． 1813． 006．
html(2013-10-12)
神经退行性疾病是一类严重危害人类健康的常见病。氧
化应激在神经退行性疾病的发病中发挥着重要作用［1］。竹节
参是我国常见的中草药，有研究［2 － 3］表明竹节参总提物(Panax
Japonicus extract，PJE)具有较好的抗氧化活性及清除自由基的
功效。本研究采用体外培养 SH-SY5Y 细胞，给予 PJE 后用
H2O2刺激，观察其保护作用，为抗神经退行性疾病药物的研发
提供理论基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
人神经瘤母瘤细胞(SH-SY5Y)由华中科技大学惠赠。
PJE:取竹节参根茎粗粉，用乙醇加热回流后浓缩干燥。双氧水
(H2O2，北京化工厂生产);MTT(Sigma 公司);活性氧检测试剂
盒(碧云天生物技术研究所) ;Annexin Ⅴ /PI 试剂盒(欣博盛生
物科技有限公司);SOD、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究
所)。荧光倒置显微镜(Nikon TP1020)。
1． 2 方法
取对数生长期的细胞接种于孔板中，培养 24 h，分别加入不
同浓度(0． 1、1、5、20 μg /mL)的 PJE 培养12 h，再加入 H2 O2
(600 μmoL /L)继续培养 12 h。正常组细胞在培养 24 h以后每
隔12 h 换液 1次。模型组直接加入 600 μmoL/L H2O2处理 12 h。
MTT法检测细胞活力:收集细胞，制成细胞悬液，取处理后各孔
同时加入 MTT，37 ℃ 孵育，弃上清，加入 DMSO，酶标仪上
570 nm测定光密度值。SH-SY5Y细胞的形态学变化:倒置显微
镜观察正常组、H2O2组、PJE 各剂量组保护后的细胞形态。酶
生化法检测 LDH释放量、SOD 活力和 MDA 含量:参照 LDH 试
剂盒检测细胞上清 LDH 的活性。参照 SOD、MDA 试剂盒检测
细胞 SOD活力及 MDA的含量。细胞内活性氧荧光检测:参照
活性氧检测试剂盒进行处理，在荧光显微镜下观察并拍照。流
式细胞仪检测细胞凋亡率:消化细胞，参照Annexin Ⅴ /PI 试剂
盒进行处理。
1． 3 统计学分析
采用 SPSS 13． 0 软件，对多组间差异的比较进行单因素方
差分析。检验水准为 0． 05。
2 结果
2． 1 PJE对 H2O2损伤的 SH-SY5Y神经细胞形态变化
的影响
正常组 SH-SY5Y细胞折光性强，细胞呈梭形，贴壁状态良
好;H2O2组细胞变圆，折光性变弱，贴壁不良;PJE 组细胞形态
较 H2O2组形态有所改善(图 1)。
A B C
A:正常组;B:H2O2组;C:H2O2 + PJE(20 μg /mL)组
图 1 PJE对 H2O2损伤的 SH-SY5Y神经细胞形态的影响 (× 100)
2． 2 PJE对 H2O2损伤的 SH-SY5Y神经细胞活力的影响
MTT实验结果表明 600 μmoL /L H2O2作用细胞 12 h后，细
胞存活率较正常组(1． 13 ± 0． 09)下降 50%左右，本实验确定
H2O2造模浓度为 600 μmoL /L。PJE 不同剂量组与 H2 O2组
(0. 47 ± 0． 02)比较，PJE 各剂量细胞存活率(分别为 0． 63 ±
0. 15、0． 81 ± 0． 05、0． 84 ± 0． 09、0． 91 ± 0． 07)较 H2O2组分别上
升了 14. 4%、29． 88%、32． 48%、38． 98%，且差异有统计学意义
(P ＜ 0． 05)。
(下转 169 页)
341
第 36 卷第 2 期
2014 年 1 月 30 日
第 三 军 医 大 学 学 报
J Third Mil Med Univ
Vol． 36，No． 2
Jan． 30 2014
DOI:10.16016/j.1000-5404.2014.02.004
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(收稿:2013-07-14;修回:2013-09-10)
(编辑 王 红
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(上接 143 页)
2． 3 PJE 对 H2O2损伤的 SH-SY5Y 神经细胞 LDH 释
放量的影响
H2O2组［(54． 70 ±9． 30)U/L］较正常组［(33． 43 ± 7． 32)U/L］
LDH的释放量升高 1． 64 倍(P ＜ 0． 05);PJE 剂量组［分别为
(39． 77 ± 7． 09)、(39． 09 ± 11． 04)、(21． 78 ± 8． 87)、(23． 14 ±
11． 52)U/L］较 H2O2组 LDH 释放量显著降低，其中5 μg /mL下
降 60． 19%，20 μg /mL下降 57． 71%(P ＜ 0． 05)。
2． 4 PJE 对 H2O2损伤的 SH-SY5Y 神经细胞 SOD 活
力和 MDA含量的影响
H2 O2组［(9． 48 ± 1． 09)mg /mL］较正常组［(17． 32 ±
5. 40)mg /mL］细胞 SOD 活力下降了 44． 24%(P ＜ 0． 01)，PJE
剂量组［分别为(13． 84 ± 0． 38)、(15． 76 ± 3． 85)、(14． 82 ±
0. 76)、(17． 15 ± 4． 74)mg /mL］较 H2O2组的 SOD活力上升，其
中 1、5、20 μg /mL 较 H2 O2组 SOD 活力分别升高了 66． 23%、
56. 35%、80． 92% (P ＜ 0． 05)。同时，H2 O2 组［(23． 43 ±
0． 60)nmol /mg］较正常组［(4． 82 ± 1． 23)nmol /mg］MDA 含量
升高了 4． 86 倍(P ＜ 0． 05)，PJE 剂量组［分别为(19． 80 ±
4. 61)、(11. 36 ±0． 93)、(3． 21 ± 1． 35)、(2． 92 ± 1． 26)nmol /mg］
较H2O2组的 MDA含量下降，其中 1、5、20 μg /mL MDA 含量分
别降低了 51． 53%、86． 28%和 87． 55%(P ＜ 0． 05)。
2． 5 PJE对 H2O2损伤的 SH-SY5Y神经细胞内活性氧
的影响
正常组细胞的荧光较为暗淡，H2 O2组细胞荧光增强;PJE
处理后，荧光强度较 H2O2组降低。
2． 6 PJE对 H2O2损伤的 SH-SY5Y神经细胞凋亡的影响
正常组细胞凋亡率为 3． 2%，活细胞占 96． 2%;H2O2组的
凋亡率为 53． 3%，活细胞占 30． 2%;PJE 用药组 5 μg /mL 和
20 μg /mL的凋亡率分别下降至 7． 8%和 3． 3%，活细胞上升至
65． 0%和 83． 6%。
3 讨论
SH-SY5Y细胞系是人神经母细胞瘤细胞，在药理实验中多
采用 H2O2诱导其凋亡作为神经退行性疾病模型。本实验给予
采用 H2O2作为外源性自由基生成系统，作用于 SH-SY5Y细胞，
模拟神经细胞氧化应激。从细胞形态上看，给予 PJE 预保护
后，形态改变明显减少。细胞活力显著上升，细胞膜的完整性
也有明显的改善。本研究结果显示，PJE 能有效降低 MDA 含
量和升高 SOD 活力;PJE 可以降低由 H2O2所致的细胞内 ＲOS
的含量，从而表明 PJE可以有效地减弱氧化应激损伤。流式实
验结果更好地验证了上述观点，活性氧的升高会耗竭内源性氧
化剂从而导致细胞凋亡，PJE 可以明显减少细胞凋亡程度，提
高细胞的存活率。本研究结果充分显示 PJE对 H2O2所致的细
胞氧化应激损伤具有保护作用，但对其作用靶点还有待进一步
研究。
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(收稿:2013-05-17;修回:2013-06-20)
(编辑 张 维)
961
第 36 卷第 2 期
2014 年 1 月 30 日
第 三 军 医 大 学 学 报
J Third Mil Med Univ
Vol． 36，No． 2
Jan． 30 2014