全 文 ：中国肿瘤生物治疗杂志 http:/ /www． biother． org
Chin J Cancer Biother，Feb． 2011，Vol． 18，No． 1
DOI:10． 3872 / j． issn． 1007-385X． 2011． 01． 011 ·基础研究·
海芒果种子提取物 nerifolin对人肝癌细胞系 HepG2 增殖和凋亡的影响
陈若华1，蒲瑾1，戴焱焱1，黄才国2△，楼国良1(1． 第二军医大学 长海医院 特需诊疗科 上海 200433;2． 第二军医大
学 基础部 生化与分子生物学教研室，上海 200433)
［摘 要］ 目的:观察来源于海芒果种子的皂苷类化合物 nerifolin 对人肝癌细胞 HepG2 增殖及凋亡的影响，初步探讨其作
用机制。方法:MTT法检测不同质量浓度 nerifolin对 HepG2 细胞增殖的影响，流式细胞术检测 nerifolin对 HepG2 细胞周期和
凋亡的影响。Caspase试剂盒检测 nerifolin对 HepG2 细胞 caspase-3 酶活化的影响。结果:Nerifolin可时间和剂量依赖性地抑
制 HepG2 细胞增殖，作用 24、48、72 h的 IC50分别为(2． 34 ± 0． 08)、(0． 13 ± 0． 01)、(0． 06 ± 0． 01)μg /ml。随着 nerifolin(0． 1
μg /ml)作用时间的延长，HepG2 细胞 S期百分比逐渐增多，而 G0 /G1 期百分比逐渐减少(P ＜ 0． 01) ，nerifolin阻滞 HepG2 细胞
于 S期。Nerifolin作用后，HepG2 细胞早期凋亡率上升至 22． 65%，caspase-3 活性比对照组明显升高(P ＜ 0． 01)。结论:Neri-
folin可通过 S期阻滞抑制 HepG2 细胞的增殖，通过 caspase-3 依赖途径诱导 HepG2 细胞的凋亡。
［关键词］ 肝癌 HepG2;nerifolin;增殖;凋亡;细胞周期;caspase-3
［中图分类号］ R735． 7;R730． 54 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1007-385X(2011)01-0051-04
［基金项目］ 国家高科技研究发展计划(863 计划)项目资助(No． 2006AAD9Z447)。Project supported by the National High Science and Technol-
ogy Research and Development Program (863 Program)of China (No． 2006AAD9Z447)
［作者简介］ 陈若华(1964 －) ，浙江省宁波市人，主任医师，教授，主要从事临床肿瘤治疗的研究
［通信作者］ 楼国良(LOU Guo-liang，corresponding author) ，E-mail:Drlougliang@ hotmail． com;黄才国(HUANG Cai-guo，co-corresponding au-
thor) ，E-mail:huangcaig@ hotmail． com。△共同通信作者
［网络出版］ 2011-01-25;http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /31． 1725． R． 20110125． 1120． 017． html
Effects of nerifolin，an isolate from seeds of Cerbera manghas L．，on prolifera-
tion and apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells
CHEN Ruo-hua1，PU Jin1，DAI Yan-yan1，HUANG Cai-guo2△，LOU Guo-liang1(1． VIP Clinical Department，Changhai
Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China;2． Department of Biochemistry and Molecular
Biology，College of Basic Medical Sciences，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)
［Abstract］ Objective:To investigate the effects of nerifolin，an isolate from the seeds of Cerbera manghas L．，on the
proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 and the related mechanism． Methods:
Effect of nerifolin on the proliferation of HepG2 cells was examined by MTT assay，and its effects on cell cycle and apopto-
sis of HepG2 cells were assessed by flow cytometry． Effect of nerifolin on caspase-3 activation in HepG2 cells was exam-
ined by caspase detecting kit． Results:Nerifolin inhibited the proliferation of HepG2 cells in a dose-and time-dependent
manner，with the IC50 values being (2． 34 ± 0． 08) ，(0． 13 ± 0． 01)and (0． 06 ± 0． 01)μg /ml after nerifolin treatment
for 24，48，and 72 h，respectively． The proportion of HepG2 cells in S phase increased with the prolongation of nerifolin
treatment，and the proportion in G0 /G1 phase gradually decreased (P ＜ 0． 05) ，indicating that nerifolin blocked HepG2
cells in S phase． Early apoptosis rate of HepG2 cells increased to 22． 65%，and caspase-3 activity was significantly in-
creased after nerifolin treatment (P ＜ 0． 01)． Conclusion:Nerifolin can inhibit the proliferation of HepG2 cells by indu-
cing S phase arrest and can trigger apoptosis via caspase-3 dependent pathway．
［Key words］ liver cancer HepG2;nerifolin;proliferation;apoptosis;cell cycle;caspase-3
［Chin J Cancer Biother，2011，18(1) :51-54］
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中国肿瘤生物治疗杂志，2011 年 2 月，18(1)
从海洋生物及其代谢产物中筛选和提取具有特
异化学结构的天然活性物质已成为抗肿瘤药物开发
的重要来源。红树植物(mangrove plants)是热带、
亚热带海区特有高等植物［1］，我国利用红树植物作
药用已有较长的历史，尤其民间用药［1］。海芒果
(Cerbera Manghas L．)是分布在海岸边的一种红树
林植物，前期研究［2］显示，海芒果提取物对体外培
养的乳腺癌、肺癌、表皮样癌细胞都有很强的增殖抑
制作用。本研究以海芒果的果实中提取的皂苷类化
合物 nerifolin 为研究对象，研究其对肝癌 HepG2 细
胞的作用及可能的抗肿瘤机制。
1 材料与方法
1． 1 细胞株和主要试剂
人肝癌细胞株 HepG2购自中国科学院生物化学
与细胞生物学研究所细胞库，常规培养于 MEM培养
基(含 10%灭活的胎牛血清、100 U/ml 青霉素和 100
μg /ml链霉素) ，置于 37 ℃、5%CO2 饱和湿度培养箱
中培养，取对数生长期细胞用于实验。MTT、DMSO、
5-FU均购自 Amresco 公司。MEM、青霉素 /链霉素混
合液(青霉素 100 U/ml，链霉素 100 μg /ml)购自 Gib-
co公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有
限公司。碘化丙啶(propidium podide，PI)、AnnexinV-
FITC购自晶美生物公司，Caspase-3 活性检测试剂盒
购自碧云天公司。
1． 2 Nerifolin的配制方法
海芒果样品采于我国广西北海，由中国科学院
上海药物研究所沈金贵副研究员鉴定为海芒果
(Cerbera manghas L．)。海芒果中皂苷类化合物
nerifolin的分离纯化由中国科学院上海生命科学研
究院药物研究所国家新药研究重点实验室郭跃伟研
究员课题组完成，nerifolin结构如图 1［3］所示。液相
色谱与质谱联用(LC-MS)分析表明，nerifolin的纯度
大于 99%。Nerifolin用 DMSO溶解，再用 PBS稀释，
使 DMSO终质量分数小于 0． 1%。
图 1 Nerifolin的化学结构
Fig． 1 Chemical structures of nerifolin
1． 3 MTT法检测 nerifolin 对 HepG2 细胞存活率的
影响
参照文献［4］，取对数生长期 HepG2 细胞，经
0. 25%胰蛋白酶消化，再加入含有 10%胎牛血清的
MEM培养基，以每孔 1 × 104 个细胞铺于 96 孔培养
板中，在 37 ℃、5% CO2 饱和湿度培养箱中培养，24
h后换液。Nerifolin 组加入 nerifolin 使其终质量浓
度分别为 0． 05、0． 1、0． 5、1、2、4、8 μg /ml，另设 5-FU
(25 μg /ml)阳性对照组、不加药物的阴性对照组和
不接种细胞的空白对照组。每个浓度、每个时间点
均设 5 个复孔。分别培养 24、48、72 h 后;每孔加入
MTT溶液(1 mg /ml)50 μl，37 ℃孵育 4 h 后弃培养
基;每孔加入 150 μl DMSO振荡 10 min，使结晶物完
全溶解，用酶标仪在 550 nm 处测定光密度值(D)。
细胞存活率(%)= ［(药物处理组 D550 － 空白组
D550)/(阴性对照组 D550 －空白组 D550) ］× 100%。
1． 4 流式细胞术检测 nerifolin 对 HepG2 细胞周期
的影响
取对数生长期的 HepG2 细胞，以每孔 1 × 106 细
胞接种于 6孔培养板中，细胞贴壁后，弃上清，各组加
入终质量浓度为 0． 1 μg /ml 的 nerifolin，孵育 0、12、
24、48 h。然后，用 0． 25%胰酶消化收集所有细胞，用
预冷的 0． 1 mol /L PBS(pH 7． 4)清洗 1次，弃上清，加
入1 ml预冷的70%乙醇固定，4 ℃过夜。收集所有固
定细胞标本，离心弃上清，用 PBS 清洗 1 次，加入 1
mg /ml的RNase A，用 PI染液(50 μg /ml)室温下避光
染色 30 min，流式细胞仪进行细胞周期分析。
1． 5 Annexin V-PI 法检测 nerifolin 对 HepG2 细胞
凋亡的影响
将 6 孔板中的各处理组 HepG2 细胞用 0． 25%
胰酶消化，1 500 × g离心 15 min，然后用 4 ℃预冷的
PBS洗细胞 1 次，用 250 μl 结合缓冲液重新悬浮细
胞，调节细胞密度至 1 × 106 /ml;取 100 μl的 HepG2
细胞悬液于 5 ml 的流式管中，加入 5 μl 的 Annex-
inV-FITC和 20 μg /ml的 PI 10 μl，混匀后室温避光
孵育 15 min，然后加入 400 μl PBS，流式细胞仪进行
检测。
1． 6 HepG2 细胞 caspase-3 活性的检测
取对数生长期的 HepG2 细胞，以每孔 1 × 106
的数量接种于 6 孔培养板中，各组加入终质量浓度
为 0． 1 μg /ml的 nerifolin，孵育 3、6、12、24 h后，使用
caspase-3 活性检测试剂盒检测 caspase-3 活性，按试
剂盒说明书进行操作。
1． 7 统计学处理
计量数据以 珋x ± s 表示，采用 SPSS10． 0 统计软
件，组间比较采用 t检验，P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01 为差
异有统计学意义。
·25·
陈若华，等． 海芒果种子提取物 nerifolin对人肝癌细胞系 HepG2 增殖和凋亡的影响
2 结 果
2． 1 Nerifolin抑制 HepG2 细胞的增殖
MTT结果显示，不同质量浓度 Nerifolin 处理后
分别培养 12、24、48、72 h，Nerifolin对 HepG2 细胞增
殖具有抑制作用，且其抑制作用具有时间和剂量依
赖性(图 2)。Nerifolin对 HepG2 细胞的半数抑制质
量浓度 IC50在 12、24、48、72 h 时分别为(2． 34 ±
0. 08)、(0． 13 ± 0． 01)、(0． 15 ± 0． 01)、(0． 06 ±
0. 01)μg /ml。
图 2 Nerifolin抑制 HepG2 细胞的增殖
Fig． 2 Nerifolin inhibited proliferation of HepG2 cells
2． 2 Nerifolin对 HepG2 细胞细胞周期的影响
流式细胞仪检测 nerifolin对 HepG2 细胞周期的
影响，结果如图 3 所示，与对照组相比，0． 1 μg /ml
nerifolin 作用于肝癌 HepG2 细胞 12 h 后，S 期的
HepG2 细胞开始累积(27． 58%) ，这种累积作用一
直持续到 nerifolin 处理细胞 48 h(71． 4%，P ＜
0. 01)。同时也观察到与对照组相比，G2 /M 期
HepG2 细胞也相应增加，其中处理 48 h时，G2 /M期
HepG2 细胞比例(22． 9%)与对照组(4． 87%)相比
显著增加(P ＜ 0． 01) ，G0 /G1 期的 HepG2 细胞比例
减少(P ＜ 0． 01)。提示 nerifolin 可以阻遏 HepG2 细
胞从 S到 G2 以及 G2 到 M期的进入，使肝癌 HepG2
细胞阻滞在 S 与 G2 /M 期，抑制 HepG2 细胞的有丝
分裂，且这种阻滞作用具有时间依赖性。
2． 3 Nerifolin诱导 HepG2 细胞凋亡
Annexin V 是检测细胞早期凋亡的灵敏染色
剂之一［5］，为了进一步证实 nerifolin 是否能诱导
肝癌 HepG2 细胞凋亡，通过 Annexin V-PI 双染色
进行检测。结果(图 4)显示，随着 nerifolin 作用
时间的延长，HepG2 细胞早期凋亡率逐渐升高，
nerifolin 处理 6 h 时，HepG2 细胞的凋亡并不明
显;在处理 24 h 后与对照组(3 ． 04%)相比，neri-
folin 组的早期凋亡细胞比例明显升高(9 ． 69%) ;
处理 48 h 后与对照组(4 ． 46%)相比，nerifolin 组
的早期凋亡细胞比例继续上升(22 ． 65%)。以上
结果说明，nerifolin 能诱导 HepG2 细胞凋亡，且该
作用呈时间依赖性(图 4)。
图 3 Nerifolin对 HepG2 细胞周期分布的影响
Fig． 3 Effect of nerifolin on cell cycle
distribution of HepG2 cells
* P ＜ 0． 5，＊＊P ＜ 0． 01 vs G0 /G1
图 4 Nerifolin作用诱导 HepG2 细胞早期凋亡
Fig． 4 Nerifolin induced apoptosis
in early stage of HepG2 cells
* P ＜ 0． 5，＊＊P ＜ 0． 01 vs contrl
2． 4 Nerifolin诱导 HepoG2 细胞中 caspase-3 活化
Caspase-3 活性检测结果显示，0． 1 μg /ml 的
nerifolin处理 HepoG2 细胞 3 h 时，caspase-3 酶的活
性显著增加(为对照组的 3． 33 倍，P ＜ 0． 05) ，且随
着 nerifolin 作用时间的延长，caspase-3 活性明显增
加，在 6、12、24 h 时 caspase-3 活性分别为对照组的
5． 26、(P ＜ 0． 05)、12． 25(P ＜ 0． 01)、和 23． 84 倍
(P ＜ 0． 01)。
3 讨 论
红树植物为耐盐、常绿乔木或灌木，全球有红树
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植物约 24 科 83 种(或变种) ，主要分布于东南亚各
国，其中我国分布约 20 科 37 种［1］。近年来对红树
植物海芒果提取物抗肿瘤作用的研究已引起了广泛
的关注［9］。本课题前期研究［10-12］显示，海芒果提取
物对体外培养的乳腺癌、肺癌、表皮样癌细胞都具有
很好的增殖抑制作用，而对人正常肝细胞 Chang
Liver 显示较低的毒性。本实验发现，海芒果提取物
nerifolin可诱导人肝癌 HepG2 细胞凋亡，其作用具
有时间和剂量依赖性，这一特点使 nerifolin 有可能
成为新一代的抗肿瘤药物。
细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡是药物抑制肿瘤
细胞增殖的两大主要机制。MTT结果显示，nerifolin
在质量浓度为 0． 1 μg /ml时，随着作用时间的延长，
G0 /G1 期的 HepG2 细胞减少，S 进入与 G2 /M 期的
细胞增加，说明 nerifolin 可以阻遏细胞周期从 S 进
入 G2 和 G2 进入M期，可抑制 HepG2 细胞的有丝分
裂，造成 HepG2 细胞在 S与 G2 /M期阻滞，且这种阻
滞具有时间依赖性。
细胞凋亡是机体为维持内环境稳定，由基因调
控的细胞自主的、有序的死亡，是为更好地适应环境
而进化出的一种主动死亡［6］，它涉及一系列基因的
激活、表达以及调控等。细胞凋亡有其非常精巧的
自杀通路，采用诱导细胞凋亡的方法抑制肿瘤细胞
比非凋亡方式具有优势，在凋亡基础上的癌症治疗
策略成为近年来研究的热点［7-8］。
细胞凋亡涉及一系列特殊的蛋白酶，由这些蛋
白酶构成的级联反应是凋亡的核心过程［13］。这一
类蛋白酶具有半胱氨酸蛋白酶活性，统称为
“caspase”。在细胞凋亡过程中，caspase-3 处于该级
联反应的下游，是细胞凋亡级联反应中的关键调节
点，通过降解细胞内相应底物诱导细胞凋亡［14-15］。
在外源性细胞凋亡途径中，细胞膜上特定的死亡受
体与配体结合(如 Fas受体与 FasL配体)后，通过跨
膜信号转导把死亡信号转导入细胞内，通过一系列
接头蛋白(adaptor) ，引起 caspase-8 酶原的水解和激
活，激活后的 caspase-8 可以继续激活下游 caspase-
3，使细胞发生凋亡。nerifolin 能使 HepG2 细胞
caspase-3 活性升高，说明其可能通过外源性途径诱
导 HepG2 细胞凋亡。
总之，本研究发现，nerifolin 可通过 S 期阻滞抑
制 HepG2 细胞增殖，通过 caspase-3 依赖途径诱导
HepG2 细胞凋亡。
［参 考 文 献］
［1］ 林鹏，傅勤． 中国红树林环境生态及经济利用［M］． 北京高
等教育出版社，1995:12．
［2］ Laphookhieo S，Cheenpracha ，Karalai C，et al． Cytotoxic carde-
nolide glycoside from the seeds of Cerbera odollam［J］． Phyto-
chemistry，2004，65(4) :507-510．
［3］ Abe F，Yamauchi T． Studies on Cerbera． I． Cardiac glycosides in
the seeds，bark，and leaves of Cerbera manghas ［J］． Chem
Pharm Bull，1977，25(25) :2744-2748．
［4］ Mosmann T． Rapid colorinetric assay for cellular growth and sur-
vival application and cytotoxicity assays ［J］． Immunol Met，
1983，65(1 /2) :55-63．
［5］ 毛咏秋，李喜荣，雷松． 几种抗肿瘤药物诱导 Jurkat细胞凋亡
的研究［J］． 中国实验血液学杂志，2006，14(4) :681-685．
［6］ Reed J C． Apoptosis-regulating proteins as targets for drug discov-
ery［J］． Trends Mol Med，2001，7(7) :314-319．
［7］ Frankfurt OS，Krishan A． Apoptosis-based drug screening and de-
tection of selective toxicity to cancer cells［J］． Anticancer Drugs，
2003，14(7) :555-561．
［8］ Pettersson F，Colston KW，Dalgleish AG． Differential and antago-
nistic effects of 9-cis-retinoic acid and vitamin D analogues on pan-
creatic cancer cells in vitro［J］． Br J Cancer，2000，83(2) :
239-245．
［9］ Leng CC，Joell JG，Krishna PLB，et al． Activity-guided isolation
of constituents of Cerbera manghas with antiproliferative and an-
tiestrogenic activities ［J］． Bioorg Med Chem Lett，2000，10
(21) :2431-2434．
［10］Wang GF，Guo YW，Feng B，et al． Tanghinigenin from seeds of
Cerbera manghas L． induces apoptosis in human promyelocytic leu-
kemia HL-60 cells ［J］． Environ Toxicol Pharmacol，2010，30
(1) :31-36．
［11］冯波，郭跃伟，黄才国，等． GHSC-73 对人肝癌细胞系 HepG2
细胞增值及细胞周期的影响［J］． 第二军医大学学报，2009，
30(9) :1110-1114．
［12］Feng B，Huang CG，Chen RH，et al． 2-Epi-2-O-acetylthevetin B
induces apoptosis partly via Ca2 + -mediated mitochondrial pathway
in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells［J］． Cell Bio Int，
2009，33(6) :918-925．
［13］Shah S，Gapor A，Sylvester P W． Role of caspase-8 activation in
mediating vitamin E-induced apoptosis in murine mammary cancer
cells［J］． Nutri Cancer，2003，45(2) :236-246．
［14］ Poter AG，Janicke RU． Emerging roles of caspase-3 in apoptosis
［J］． Cell Death Differ，1999，6(2) :99-104．
［15］Earnshaw WC，Martins LM，Kaufmann SH． Mammalian caspases:
Structure，activation，substrates and functions during apoptosis
［J］． Annual Rev Biochem，1999，68(2) :383-424．
［收稿日期］ 2010 － 10 － 20 ［修回日期］ 2010 － 12 － 22
［本文编辑］ 韩 丹
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