全 文 ：翻白草油对肝癌 HepG2细胞 CDK4蛋白的影响
李忠秀1, 2 ,王淑秋1 ,刘　蕾 1 ,王淑湘 1
(1.佳木斯大学基础医学院 ,黑龙江 佳木斯 154007; 2.鹤岗市人民医院 ,黑龙江 鹤岗 154101)
摘要: 目的:检测翻白草油对肝癌 HepG2细胞 CDK4蛋白表达的影响 ,探讨翻白草油抗肝癌的机制。方法: 翻白草油作用肝
癌 HepG2细胞后 ,用噻唑蓝 ( M T T)比色法检测 HepG2细胞增殖活性和 IC50; w estern blot法检测 CDK4蛋白的表达。结果: 翻
白草油能抑制 HepG2细胞增殖 ,且呈剂量依赖性 , IC50值为 2. 03mg /mL ,;翻白草油处理组 CDK4蛋白水平低于溶剂对照组
(P < 0. 01)。结论: 翻白草油可抑制人肝癌细胞 HepG2的增殖 ,可能与降低 CDK4蛋白的表达有关。
关键词: 翻白草油 ; 肝癌 HepG2细胞 ; CDK4
中图分类号: R735. 7　文献标识码 : A　文章编号: 1008- 0104( 2011) 02- 0025- 02
　　肝癌是我国常见的恶性肿瘤 ,死亡率居肿瘤第 2位。近年
来 ,尽管临床上肝癌的诊断治疗水平有所提高 ,但传统的外
科手术加化疗或放疗等方法都有其局限性 ,肝癌的生物治疗
尚不成熟 ,五年生存率仍无改善。翻白草为蔷薇科植物 ,在
中国传统的医药典籍和各国民间都有广泛的用途。人们对翻
白草的化学成分、毒理、病理、药理、生理等基础研究和翻白
草的药用、食用、饲用、生产化工原料等的应用研究都做了大
量的工作 ,并取得丰硕的成果 [1, 2]。但是对翻白草中挥发油诱
导肝癌细胞凋亡的研究尚未见报道。
1　 材料与方法
1. 1　 化学试剂
M TT、 BSA和 DM SO购买于 Sigma公司。兔抗 CDK4多
克隆抗体、β - actin和碱性磷酸酶标记的山羊抗兔 IgG抗体
购买于北京中杉金桥生物技术有限公司。翻白草油由本实验
室提取。胎牛血清、 RPM I1640培养液和青霉素 - 链霉素购自
美国英杰生命技术公司。
1. 2　 细胞株
HepG2细胞株由佳木斯大学病理生理学教研室保存。
1. 3　 细胞培养
HepG2细胞株在 10%细胞培养基 (含有 10%小牛血清、
青霉素 100U /m L、链霉素 100μg /m L) , 37℃ , 5% CO2条件下培
养 ,每 2～ 3天换液 1次 ,约 80% 融合时用 0. 25%胰蛋白酶消
化 ,按 1: 2比例传代 ,直至所需细胞数。
1. 4　 药物配制
用 RPM I1640培养液将翻白草油 ( DMSO溶解 )释成浓
度为 100mg /m L储备液 ,用 10%细胞培养液进行 2倍系列稀
释 , 0. 22μm微孔滤器抽滤除菌 , 4℃保存备用。
1. 5　 细胞活性的检测
0. 25%胰酶消化后收集细胞 ,调节细胞浓度为 5×
108 /L,按每孔 200μL接种于 96孔板上 ,常规培养 24h后 ,倒
掉培养液加入不同浓度翻白草油 ,培养 48h后弃液体 ,每孔
加 M TT( 5g /L ) 20μL ,继续孵育 4 h后弃液体 ,加入 DMSO
150μL,检测各组光密度值 ( A492)。实验重复 3次 ,每次、每浓
度均设 4个复孔。
细胞抑制率= ( 1-实验组 OD /对照组 OD)× 100%
1. 6　 实验分组
翻白草油组 (用 DM SO溶解后 ,以 10%培养液稀释成
0. 677, 1. 015 mg /m L) 。另设两个对照组: 一个为空白对照组
(仅加 1640培养液 ) ,一个为溶剂对照组 (加 1640培养液和
DM SO ,翻白草油的浓度为 0)。对照组及每个药物浓度组分
别培养 24h后进行指标检测。各组分别设 4个重复瓶。
1. 7　Western blot检测翻白草油对 HepG2细胞 CDK4蛋白
的影响
样品蛋白裂解液与 5×上样缓冲液混合 , 100℃变性
5min,经 SDS- PAGE电泳分离后 , 40V ,电转移到硝酸纤维
素膜。硝酸纤维素膜封闭过夜 , CDK4多克隆抗体 37℃ , 2h,
TBST缓冲液漂洗。碱性磷酸酶标记的山羊抗兔 IgG抗体 ,
37℃ , 1h, TBST缓冲液漂洗 , BCIP /NB T显色试剂显色。
1. 8　 统计学分析
数据用 SAS( 9. 13版 )软件处理 ,调用 Proc GLM过程进
行方差分析 ,实验组与各对照组的比较采用 dunnet t检验。
2　 结果
2. 1　 翻白草油对 HepG2癌细胞的作用
翻白草油处理组表现为肝癌细胞增殖缓慢、颗粒较多、
部分细胞破碎脱落。且随着药物浓度的降低 , 细胞存活率逐
渐增加。M TT结果表明 ,翻白草油作用 HepG2细胞的 IC50
值为 2. 03mg /m L(图 1)。
图 1　翻白草油浓度 ( mg /m L)
2. 2　Western blo t检测 CDK4蛋白表达
实验结束时测定 CDK4蛋白水平 ,翻白草油处理组
CDK4蛋白水平低于溶剂对照组 (P < 0. 01) (图 2)。
3　 讨论
目前 ,抗肿瘤药物的研究正从传统的细胞毒型药物向基
因治疗产品和针对癌症关键治病基因的特异性拮抗剂发展。
天然药物尤其是中草药毒副作用小 ,从中药中寻找抗恶性肿
瘤天然化合物 (新药 )越来越引起国内外学者的关注。精油
是指具有特殊香气的植物挥发油 ,具有健身祛病、调理情绪、
协调人体生理功能、激发人体自身潜能的作用 ,还有一部分
精油成份可抑制或杀灭细菌病毒、强化中枢神经系统、促进
新陈代谢、增强各器官的功能和人体免疫力。中药精油的作
用体现在抗癌、抗炎、抗菌、利胆、止痛等几个方面 [3]。翻白草
性味苦 ,平。应用历史悠久 ,《中国药植志》、《救荒本草》、《山
东中药》等多种医药典籍中均有记载 ,功用主治主要为祛风
湿 , 解毒。治痢疾、风湿筋骨疼痛、瘫痪、癫痫、疮疥等。本研
究 M TT结果发现 ,翻白草油能明显抑制 HepG 2细胞的增
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殖 ,抑制率随着药物浓度的增加而增加 ,具有剂量依赖关系 ,
说明翻白草油有抗肝癌 HepG 2细胞作用。为了进一步证明
翻白草油抗肝癌 HepG 2细胞机制 ,测定了 CDK4蛋白。参与
调控的因子包含起正调控作用的 cyclin和 CDK基因产物 ,
还有起负调控作用的 CDK抑制因子 ( CK Is)对细胞的凋亡诱
导细胞周期的启动与进程受到严格调控。真核细胞增生及分
化调节大部分发生于细胞周期的 G0 /G1期和 (或 ) G1 /S期
的转变期。cdk4的功能是作为 G1期正调控因子 ,使细胞周期
通过 G1 /S调控点进入 S期。细胞周期失控是癌细胞异常增
殖的一个重要原因 [4]。近年来人们对调控细胞周期进程的
CDK4在癌细胞中的变异及异常表达进行了广泛的研究 ,并
发现 CDK4在癌细胞中的变异和过表达普遍存在 [5 ]。在本研
究中 ,当翻白草油降低肝癌 HepG2细胞 CDK4的表达 ,实验
结果表明翻白草油通过降低 CDK4表达水平 ,抑制细胞周期
进行的正调控作用。
图 2　 Western blot检测 CDK4蛋白表达
* * ,与溶剂对照组比较 , P < 0. 01
1: 空白对照组 , 2: 溶剂对照组 , 3: 翻白草油 0. 677mg /mL, 4:翻白草油 1. 015mg /m L
　　参考文献:
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cer Res, 2010, 70( 22) : 9473- 9482
(收稿日期: 2010- 11- 20)
基金项目: 黑龙江省卫生厅课题 ,编号: 2007- 513;
佳木斯大学人才培养基金项目 ,编号: RC2009- 028。
作者简介: 李忠秀 ( 1969～ )女 , 黑龙江鹤岗人 , 主任医师 , 在读硕士研究生。
通讯作者: 王淑秋 ( 1956～ )女 ,黑龙江佳木斯人 ,教授 ,硕士研究生导师。E- mail: wang- shuq@ 163. com。
Effect of Radix oil on CDK4 protein expression in HepG2 cells
LI Zhong - xiu1, 2 , W ANG Shu- qiu1 ,L IU Lei1 ,W ANG Shu- x iang1
( 1. College of Basic Medicine , Jamusi Universi ty, Jam usi 154007, China; 2. Hegang People s Hospital, Hegang 154101, China)
Abstract: Objective: To investigate the role of Radix oil in the expression of CDK4 protein in the human
hepa toma cell line HepG2.Methods: M T T assay w as used to test the inhibi tory ef fect of Radix oi l on the human
hepa toma cell line HepG2 in v itro at different concentrations and IC50 w as calculated and the expression of
CDK4 protein w as detected by Weston blot. Results: After Radix oi l t reatment, the human hepatoma cell line
HepG2 show ed proliferation blocking and a positiv e correlation with the concentration of Radix oil. IC50 w as
2. 03mg /mL and the CDK4 pro tein expression in the Radix oil t reatment g roup was obviously lower than that
in the control g roup (P < 0. 01) . Conclusion: Radix oil has anti- human hepatoma cell line HepG2 activi ty in
vit ro , and is probably rela ted to the down- regulation of CDK4 expression.
Key words: Radix oil; human hepatoma cell line HepG2; CDK4
·26·　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　黑龙江医药科学　 2011年 4月第 34卷第 2期