全 文 ：第 40 卷第 15 期
2012 年 8 月
广 州 化 工
Guangzhou Chemical Industry
Vol． 40 No． 15
August． 2012
HPLC法测定天山花楸叶提取物黄酮苷的含量
郑永刚1，郁长治1，王 欢2，唐 辉1
(1 新疆特种植物药资源省部共建教育部重点实验室，石河子大学药学院，新疆 石河子 832002;
2 新疆武警边防总队医院，新疆 乌鲁木齐 830000)
摘 要:为了建立天山花楸叶中总黄酮苷含量的测定方法，对样品酸水解处理再进行 HPLC 分析，色谱柱为 Waters － C18
(150 mm ×4． 6 mm，5 μm) ，柱温 25 ℃，使用可变波长检测器;流动相为甲醇 －乙腈 － 0． 4%磷酸水溶液，梯度洗脱程序为 0 min(12∶
20∶68)－10 min(52∶0∶48)－18 min(72∶0∶28);流速 1． 0 mL/min，检测波长为 360 nm。结果表明:槲皮素浓度在 5． 98 ～47． 84 μg /mL之
间与色谱峰面积呈良好的线性关系，回归方程 A = 66． 96C － 5． 9964，r = 0． 9995。平均回收率 94． 86%，RSD = 1． 9%;山柰素浓度在
4． 04 ～ 28． 28 μg /mL之间与色谱峰面积呈良好的线性关系，回归方程 A = 50． 114C － 19． 529，r = 0． 9999，平均回收率 93． 89%，RSD =
2． 7%;其黄酮苷百分含量为(12． 62 ± 0． 40)%。该方法干扰少，灵敏，简便，重现性好，可为天山花楸叶的药用开发利用提供质量控制
方法。
关键字:天山花楸;黄酮苷;槲皮素;山柰素;HPLC
中图分类号:R284． 1 文献标识码:A 文章编号:1001 － 9677(2012)15 － 0161 － 03
作者简介:郑永刚(1985 －) ，男，汉族现为石河子大学药学院在读硕士研究生，主要从事天然药物分析及制剂研究。
通讯作者:唐 辉(1967 －) ，女，汉族现任石河子大学药学院教授，博士学位，硕士生导师，主要从事药物分析及新药研究。
Determination of the Content of Flavonoid Glycosides Extracted from
Sorbus tianschanica Leaves by HPLC
ZHENG Yong － gang1，YU Chang － zhi1，WANG Huan2，TANG Hui1
(1 College of Pharmacy，Shihezi University，Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Resources，Xinjiang Shihezi
832002;2 Armed Police and Frontier Corps Hospital of Xinjiang Autonomous Region，Xinjiang Urumqi 830000，China)
Abstract:An method for determination of the content of flavonoid glycosides extracted from Sorbus tianschnica was
established． The samples，which were hydrolyzed with acid，were analyzed by RP － HPLC． The analysis was carried out
on a waters － C18(4． 6 mm ×150 mm，5 μm)column，The mobile phase was composed of A(methanol)－ phase B(ace-
tonitrile)－ phase C(0． 4% phosphoric acid water solution)in gradient elution 0 min(12∶20∶68)－ 10 min(52∶0∶
48)－ 18 min(72∶0∶28)by flow rate of 1． 0 mL /min in this method，the detection wave length was set at 360 nm，the
VWD was used and the column temperature was 25 ℃． The linear relationship of quercetin was good 5． 98 ～47． 84 μg /mL，
A =66． 96C － 5． 9964，and r = 0． 9995． The average recovery was 94． 86%，(RSD = 1． 9%) ，the linear relationship of
kaempferol was good 4． 04 ～ 28． 28 μg /mL，A = 50． 114C － 19． 529，and r = 0． 9999． The average recovery was 93．
89%，(RSD =2． 7%)． The content of flavonoid glycosides was(12． 62 ± 0． 40)% ． This method was simple，sensitive
and less interference，reproducible，the utilization of quality control method with the leaf of Sorbus tianschanica．
Key words:Sorbus tianschanica;flavonoids;quercetin;kaempferol;HPLC
天山花楸(Sorbus tianshanica Rupr．)为蔷薇科(Rosaceae)花
楸属植物(Sorbus) ，系新疆维吾尔族和哈萨克族民间用药，常用
于治疗哮喘，咳嗽等病症［1］。实验研究表明天山花楸叶、果具有
平喘镇咳祛痰，依赖性地抑制心肌收缩和保护心肌缺血等作
用［2 － 8］。实验发现天山花楸中有效成分主要为黄酮类化合
物［4 － 6］。因此，用 RP － HPLC 法对天山花楸叶黄酮提取物中总
黄酮苷含量进行了测定，为天山花楸叶的原料药及制剂研究提
供有效的质量控制标准及控制方法。
1 仪器与材料
美国 Agilent HP1100 型高效液相色谱系统(配有:四元泵，紫
外可变波长检测器，ChemStations 色谱工作站) ;德国 Sartorius
BP211D十万分之一电子分析天平;上海科导 SK5200HP 超声清
洗器。
槲皮素，山柰素对照品(中国药品生物制品检定所，批号分
别为 100081 － 200406，110861 － 200808) ;甲醇，乙腈为色谱纯
(Fisher Scientific) ，水为双蒸水;磷酸、甲醇(样品溶剂)、盐酸及
其它试剂均为分析纯。
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天山花楸叶黄酮提取物(比色法测定其总黄酮含量
61． 2%) :天山花楸叶阴干粉碎成末，提取温度为 60 ℃，料液比
为 1/10 g /mL，乙醇浓度为 60%，其中超声功率 60 Hz，时间 30 min，
连续提取 2 次，过滤、回收滤液、旋转蒸发浓缩，再经 AB － 8 大孔
吸附树脂除杂纯化、真空冷冻干燥而得［9］。
2 溶液制备
2． 1 对照品溶液
分别精密称取槲皮素 14． 95 mg和山柰素 10． 10 mg，甲醇溶
解、摇匀定容到50 mL容量瓶，稀释5倍制得浓度为59． 80 μg /mL和
40． 40 μg /mL的对照品溶液，备用。
2． 2 样品溶液
称取天山花楸叶黄酮提取物约 75 mg，加甲醇 30 mL，25%
(V/V)HCl 5 mL，使其溶解于 50 mL磨口锥形瓶中，沸水浴回流
水解 60 min，冷却，转移至 50 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容;再
精密量取其 5 mL移至 10 mL 的容量瓶中，用甲醇稀释定容，用
0． 45 μm微孔滤膜过滤作为样液，即得。
3 HPLC色谱条件
Waters C18柱(150 mm ×4． 6 mm，5 μm) ;检测波长 360 nm;温
度 25 ℃;流动相为甲醇 －乙腈 － 0． 4%磷酸溶液组成，采用梯度
洗脱，运行时间 25． 00 min;平衡时间 10． 00 min;进样量 20 μL，
流速为 1． 0 mL /min。其梯度洗脱条件见表 1。
表 1 HPLC梯度条件
Table 1 gradient program of HPLC
运行时间 /min 甲醇 /% 乙腈 /% 0． 4%磷酸水 /%
0． 00 12 20 68
10． 00 52 0 48
18． 00 72 0 28
图 1 对照品(A)、样品(B)HPLC图谱
Fig． 1 HPLC chromatograms of reference substance (A) ，sample (B)
1． 槲皮素(quercetin) ;2． 木犀草素(luteolin) ;
3． 山柰素(kaempferol) ;4． 异鼠李素(isorhamnetin)
在此色谱条件下，精密吸取对照品溶液、样品溶液进样，结
果槲皮素、山柰素的保留时间分别为 14． 04，17． 33 min;分离度均
大于 1． 5;理论塔板数按槲皮素峰计算值算应不低于 41000;结果
样品中各组分的色谱峰分离度良好，结果见图 1。
4 方法学考察
4． 1 线性关系的考察
精密量取 2． 1 项下的两种对照品溶液 1 mL，2 mL，3 mL，
4 mL，5 mL，6 mL，7 mL，8 mL至 10 mL的容量瓶中，用甲醇稀
释定容。分别以 20 μL量进样，以浓度 C(μg /mL)对色谱峰面积
A进行线性回归，可得标准曲线，其回归方程、相关系数及线性
范围如表 2。
表 2 线性关系
Table 2 linear relationship
对照品 回归方程 相关系数(r) 线性范围 /(μg /mL)
槲皮素 A =66． 96C － 5． 9964 0． 9995 5． 98 ～ 47． 84
山柰素 A =50． 114C － 19． 529 0． 9999 4． 04 ～ 28． 28
4． 2 精密度试验
取同一对照品溶液(槲皮素，山柰素的浓度分别为 11． 96，
4． 04 μg /mL) ，在上述色谱条件下连续进样 6 次，计算槲皮素，山
柰素的峰面积的 RSD分别为 1． 1%，1． 2% 。
4． 3 重复性试验
精密称取同批号天山花楸叶黄酮提取物样品 75 mg，共 6
份，按照“2． 2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下分
别进样测定。结果样品中总黄酮的平均含量(n = 6)为 12． 65%;
RSD为 1． 9% 。
4． 4 稳定性试验
取同一供试品溶液分别在 0，2，4，6，8，10 h 进样测定，结果
天山花楸叶黄酮提取物中总黄酮的含量 RSD(n = 6)为 0． 27% 。
表明供试品溶液中的黄酮在 10 h内稳定。
4． 5 回收率试验
精密称取天山花秋叶黄酮提取物 38 mg，分别加入 6 mL
浓度为 0． 2002 mg /mL 的槲皮素，5 mL 浓度为 0． 2004 mg /mL
的山柰素对照品标准溶液，按样品处理方法，分别测定槲皮素，
山柰素的加样回收率，每次进样 20 μL，结果槲皮素，山柰素的
平均回收率(n = 6)分别为 94． 86%，93． 89%;RSD 分别为
1． 9%，2． 7%。
4． 6 样品含量测定
由于天山花楸叶中有七、八种黄酮类化合物［10］，难以一 一
定量测定单个成分，从药效学角度，也只要测定总黄酮含量。从
水解后的 HPLC图上也可看出主要为槲皮素，山柰素两种苷元。
故选择他们作为定量的标准。采用测量峰面积外标法，2 种主要
的水解苷元分别以槲皮素，山柰素作为对照，计算样品水解后各
苷元的含量;参照目前较成熟的银杏黄酮苷定量方法的相关文
献［11 － 12］，可用分子量为 610 的芦丁对槲皮素的转换因子 2． 02 和
分子量为 534 的山柰素糖苷(经 LC － MS － MS 分析获得相应苷
的相对分子量，推断其为山柰素 －葡萄糖苷 －丙二酸酯)对山柰
素转换因子 1． 87 通过下面的转换关系来计算天山花楸黄酮苷
的含量。
第 40 卷第 15 期 郑永刚等:HPLC法测定天山花楸叶提取物黄酮苷的含量 163
天山花楸黄酮苷的含量 =槲皮素量 ×2． 02 +山柰素量 ×1． 87
= 3． 112 × 2． 02 + 1． 678 × 1． 87
= 9． 426(mg)
天山花楸黄酮苷(%)=黄酮苷量 /样品量 × 100%
=9． 426 /74． 71 × 100%
=(12． 62 ± 0． 40)%
5 讨 论
5． 1 HPLC实验条件的选择
天山花楸叶黄酮提取物水解后主峰为槲皮素、山柰素。本
实验选用甲醇 －乙腈 －磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱。
本实验发现:采用梯度洗脱与等度洗脱相比，基线未见明显漂
移，但岀峰更加敏锐，峰形尖锐，改善了分离效果，使后出的峰扩
散程度减小。由于本法是以槲皮素和山柰素作为定量标准，故
减小峰扩张更显得重要。梯度洗脱对于其他组分的峰也分离的
较清楚，便于更好地了解产品的全貌，以利于生产过程的控制。
5． 2 水解实验条件的选择
①水解时间，天山花楸黄酮提取物在本样品制备条件下可
水解完全，水解 60 min与 90 min所得结果无显著性差异。通过
考察了同一批样品，在其他条件一致的情况下，分别测定了
30 min、60 min和 90 min 3 个时间点的总黄酮苷的含量，分别为
(10． 10 ± 0． 18)%，(12． 62 ± 0． 40)%和(12． 86 ± 0． 27)%(n =
4)。30 min 与 60 min，90 min 的含量间有显著性差异(P ＜
0． 05)。由于 30 min的水解时间太短，样品水解不完全，从而导
致含量偏低。②盐酸浓度，对同一批样品分别在 25． 0%，
12． 5%，6． 25% 盐酸液中水解，结果总黄酮苷的含量分别为
(12． 62 ± 0． 40)%，(9． 87 ± 0． 21)%和(7． 33 ± 0． 13)%(n = 4)。
三者间有非常显著的差异(P ＜ 0． 05)。实验结果表明 25%(V/
V)盐酸浓度较合适。如果降低盐酸浓度，会导致水解不完全，造
成测定的含量偏低。但是盐酸浓度也不宜再增加，否则会影响
色谱柱的寿命。
5． 3 样品稳定性
在实验中发现，槲皮素对照品溶液稳定性确实较差，日久颜
色变深，而样品的酸水解液却相当稳定。而山柰素对照品溶液
稳定性很好。
5． 4 天山花楸黄酮苷
天山花楸的黄酮苷成分十分复杂，难以直接测定各种黄酮
苷的含量;而这些黄酮苷经水解发现其苷元主要为黄酮醇类槲
皮素和山柰素。采用水解法，得到苷元(槲皮素、山柰素)经
HPLC分离检测，用外标法测得各苷元量分别乘转换因子，得出
黄酮苷含量。本法干扰少，重现性好，可在一定程度上反映天山
花楸叶黄酮提取物及制剂的质量。
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