全 文 ：收稿日期:2008-10-31;　修订日期:2009-07-29
基金项目:新疆建设兵团科技攻关计划医药卫生专项资金资助项目(No.
2006GG52)
作者简介:芮　鸣(1981-),男(汉族),安徽涡阳人 ,现为石河子大学药学
院在读研究生 ,主要从事天然药物分析及制剂研究工作.
＊通讯作者简介:唐　辉(1967-),女(汉族),重庆人 ,现任石河子大学药学
院教授 ,硕士研究生导师 ,博士学位 ,主要从事药物分析及新药研究工作.
天山花楸叶中总黄酮超声提取工艺研究
芮　鸣 ,唐　辉＊ ,王鲁石 ,马伟伟 ,王玉梅
(新疆特种植物药资源省部共建教育部重点实验室 ,石河子大学药学院 ,新疆 石河子　832002)
摘要:目的 研究天山花楸中总黄酮最佳提取工艺。方法 采用正交实验 , 分别以比色法测定总黄酮提出率和高效液相色
谱(HPLC)图谱中总黄酮相对积分峰面积为指标 ,考察提取温度 、料液比 、醇浓度对天山花楸叶中总黄酮提出率的影响。
结果 最终确定天山花楸叶中总黄酮的最佳提取条件为:温度 60℃,醇浓度为 60%,料液比 1∶10(g∶ml), 其中超声功率
60 kHz, 时间 30 min, 在相同条件下连续提取两次。结论 该提取工艺合理 , 总黄酮提取率高 , 质量易于控制。
关键词:天山花楸 ;　超声提取;　总黄酮;　高效液相色谱图谱;　相对积分峰面积
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)12-3038-02
StudyontheExtractingTotalFlavanoidsfromSorbusTianshanicaRupr
RUIMing, TANGHui＊ , WANGLu-shi, MAWei-wei, WANGYu-mei
(ColegeofPharmacology, ShiheziUniversity, KeyLaboratoryofXinjiangPhytomedicineResources, Xinjiang
Shihezi, 832002, China)
Abstract:ObjectiveTostudytheoptimumextractionprocessoftotalflavonoidsfromSorbustianshanicaRupr.MethodsWith
yieldoftotalflavonoidsandthesumintegralrelativepeakareaoftotalflavonoidsinHPLCchromatogramsastheindex, orthogonal
experimentwascarriedtoinvestigatefactorsoftemperature, solid-liquidleachingrate, concentrationofalcohol, whichimpact
theyieldoftotalflavonoidsfromSorbustianshanicaRupr.ResultsTheresultsoftheorthogonalexperimentshowedtheoptimum
conditionsforultrasonicextractionwereidentifiedasthefolows:temperature60℃, 60% ethanol, solid-to-liquidratio1/10
g/ml, andextract2 timesat60 kHzofacousticpowerfor30 minutes.ConclusionTheextractiontechnologyisreasonable, the
yieldoftotalflavonoidsishighandthequalityiseasilycontroled.
Keywords:SorbustianshanicaRupr;　Totalflavonoids;　HPLCchromatograms;　 Integralrelativepeakarea
　　天山花楸 SorbustianshanicaRupr为蔷薇科(Rosaceae)花楸
属植物(Sorbus),系新疆维吾尔族和哈萨克族民间用药 , 常用于
治疗肺结核 、哮喘 、咳嗽 、胃痛等症 [ 1]。 实验研究表明天山花楸
叶具有平喘镇咳祛痰 、依赖性地抑制心肌收缩和保护心肌缺血等
作用 [ 2] 。本课题组药效筛选实验发现天山花楸中有效成分主要
为黄酮类化合物。
天然来源的生物黄酮分子量小 , 能被人体迅速吸收 , 能通过
血脑屏障 , 能进入脂肪组织 ,是许多中草药的有效成分 ,具有很高
的药用价值。黄酮类化合物具有消除疲劳 、保护血管 、预防动脉
硬化 、扩张毛细血管 、疏通微循环 、抗脂肪氧化 、活化大脑及其他
脏器细胞的功能 [ 3] 。 药理作用表现为抗炎镇痛 、抗病毒 , 抗辐
射 、抗癌抗肿瘤 [ 4] ,抗氧化 、抗衰老 、抗心脑血管疾病 [ 5] , 免疫调
节 、降血糖 、治疗骨质疏松等。传统的黄酮提取方法有浸渍法 、索
氏法 、回流法等 ,提取时间较长 , 并影响提出率。超声提取是目
前比较新的技术 , 超声波产生的强烈振动 、高的加速度 、强烈的空
化效应 、搅拌作用等 ,都可加速药物有效成分进入溶剂 ,从而提高
了有效成分提出率 , 缩短了提取时间 , 节约了溶剂 , 并且避免了
高温对有效成分的影响 [ 6] , 因此把超声技术用于中药有效成分
的提取越来越受到重视。
1　材料
美国 AgilentHP1100型高效液相色谱系统(配有:四元泵 ,紫
外检测器 , HP1100化学工作站);日本岛津 UV2401(PC)紫外光
谱仪;德 国 SartoriusBP211D十万 分之一电 子分析 天平;
SK5200HP超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司);甲醇 、乙
腈为色谱纯 , 水为纯净水 ,磷酸 、乙醇及其它试剂均为分析纯;芦
丁对照品由中国药品生物制品鉴定所提供;天山花楸供试品采自
新疆玛纳斯林场 ,海拔 2 000 ～ 2 500 m, 由石河子大学药学院成
玉怀高级实验师鉴定为蔷薇科(Rosaceae)花楸属植物(Sorbus)。
2　方法与结果
2.1 　亚硝酸钠 -硝酸铝比色法测样品中总黄酮含量 芦丁标准
曲线的绘制:精密称取芦丁对照品 20mg于 50ml量瓶中 , 超声溶
解 , 用 60%乙醇定容至刻度 , 摇匀备用。分别精密移取上述对照
品溶液 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0 ml于 25 ml量瓶中加
60%乙醇至 6.0 ml,加 5%亚硝酸钠溶液 1.0ml放置 6 min, 加入
8%硝酸铝溶液 1.0ml放置 6 min, 加入 5%氢氧化钠试液 10 ml
定容 , 放置 15 min后以试剂空白为参比溶液于 510 nm测吸光
度。得回归方程为:Y=12.05 8X-0.002 8, r=0.999 9, 芦丁在
0.016 2 ～ 0.072 7 mg/ml浓度范围内呈良好线性关系。 其平均
加样回收率为 98.0%;RSD(n=3)为 0.95%。
2.2　 HPLC分析
2.2.1　色谱条件 WatersC18柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm);检
测波长 360 nm;温度 25 ℃;运行时间 30 min;平衡时间 10 min;
进样量 20μl,梯度洗脱条件见表 1。
表 1　HPLC梯度条件
运行时间
t/min 甲醇(%) 乙腈(%)
0.3%磷酸水
(%)
流速
v/ml· min-1
0 2 12 86 0.6
20 17 17 76 0.8
30 28 51 21 1.0
2.2.2　HPLC图谱 在上述 HPLC色谱条件下 ,样品中各组分的
色谱峰分离度良好。结果见图 1。
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 12期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.12
A-绿原酸 、芦丁 、金丝桃苷混合对照品图谱
B-醇提样品图谱　C-醋酸乙酯提取样品图谱
1.绿原酸　2.芦丁　 3.金丝桃苷
图 1　HPLC图谱
2.2.3 　HPLC分析指标建立 本课题组药理实验证明 , 醋酸乙
酯提取物为药理实验有效部位。经理化鉴定及 TLC分析结果显
示该有效部位呈黄酮类化合物阳性反应。通过对比图 1中各样
品 HPLC图谱 , 在 20 ～ 30 min其共有峰保留时间和整体图貌具有
良好的一致性。色谱分析中 , 化合物保留时间 , 取决于化合物特
定的色谱行为 , 可以确定 20 ～ 30 min一系列色谱峰为黄酮类化
合物色谱峰。因此 ,本实验选择积分 HPLC图谱 20 ～ 30min各组
分色谱峰 , 计算相对积分峰面积(各组分积分峰面之和与样品质
量的比值 , 记作:A/μg), 对指标进行量化 ,并以此分析样品。
2.3 　正交实验设计 结合预实验实际情况 , 选提取温度(A)、料
液比(B)和乙醇浓度(C)为影响总黄酮提出的主要因素 , 每个因
素取 3个水平(见表 2),选用 L9(34)正交实验表安排实验 , 其中
超声功率 60kHz,时间 30 min, 连续提取两次。 精确称取天山花
楸叶干粉 2.0 g, 加入不同溶剂系统 , 平行提取条件下操作 , 按
“ 2.1”项测定并计算总黄酮含量及相对积分峰面积。
表 2　因素水平
因素 A温度 T/℃
B
料液比C/g· ml-1
C
醇浓度(%)
1 25 1/8 50
2 45 1/10 60
3 60 1/12 70
2.4　正交实验结果及分析 由表 3 ～ 4结果分析表明 , 以总黄酮
含量为指标时 , 因素 A对总黄酮提取实验影响显著 , 影响顺序为
A>B>C, 最佳提取工艺条件为 A2B3C3;由表 3, 表 5分析表明 ,
以 HPLC图谱相对积分峰面积为指标时 , 因素 A、C对总黄酮提
取实验影响显著 , 影响顺序为 A>C>B, 最佳提取工艺条件
为 A3B1C2。
2.5 　最佳工艺条件验证实验 通过以上实验 , 综合分析考虑 ,
最终选用相对积分峰面积为指标 , 最佳提取工艺条件确定为
A3B2C2, 即提取温度为 60℃ , 料液比为 1/10 g/ml, 乙醇浓度为
60%, 其中超声功率 60 Hz,时间 30 min, 连续提取两次。在此最
佳工艺条件下平行进行 3次实验 , 总黄酮提取率较高且稳定。
3　讨论
3.1 　浸提溶剂的选择 黄酮类化合物的游离黄酮苷元和黄酮
苷极性皆较大 , 因此较易溶于极性较大甲醇和乙醇以及相应的水
溶液中 , 提出率较高;而醋酸乙酯和丙酮极性较小 ,相对提出率较
低。乙醇相对甲醇而言毒性小 , 且本身具有杀菌作用 , 提取样品
不易发霉变质 , 所以本实验选取乙醇为提取溶剂。
3.2 　检测波长的确定 精密移取芦丁对照品溶液 2.0 ml于 25
ml量瓶中加 60%乙醇至 6.0 ml, 加 5%亚硝酸钠溶液 1.0 ml放
置 6min,加入 8%硝酸铝溶液 1.0ml放置 6min,加入 5%氢氧化
钠试液 10ml定容 ,放置 15 min后于 400 ～ 800 nm波长范围进行
紫外扫描。结果表明 ,芦丁显色后在 510 nm处有最大吸收峰。
3.3　显色条件考察 在预实验中参考有关文献的亚硝酸钠 -
硝酸铝比色法测定总黄酮含量时 ,发现短时间内样品吸光度值变
化较大 , 准确度 、精密度 、重现性及回收率结果均较差。故本实验
又重新考察了显色剂加入量 、显色温度和显色时间 ,对比色条件
进行了改进 ,确立了新的测定条件 , 即 “ 2.1”项中测样品中总黄
酮含量的方法。经重复性 、回收率等实验分析表明 ,以此方法测
定天山花楸中总黄酮含量 ,能够取得较为满意的结果。
表 3　结果与极差分析
实验
号
A
温度 T/℃
B
料液比C/g· ml-1 C醇浓度(%)
总黄酮
含量(%)
相对积分峰
面积(A/μg)
1 1 1 1 5.88 27.8
2 1 2 2 6.65 28.76
3 1 3 3 7.27 25.53
4 2 1 2 8.59 31.27
5 2 2 3 8.55 28.55
6 2 3 1 8.74 30.56
7 3 1 3 8.5 31.01
8 3 2 1 8.53 30.83
9 3 3 2 8.75 31.4K1 19.80 22.97 23.15
82.09 90.08 89.19K
2 25.88 23.73 23.99
90.38 88.14 91.43K3 25.78 24.76 24.32
92.24 87.49 85.09k1 6.60 7.66 7.72
27.36 30.03 29.73k2 8.63 7.91 8.00
30.13 29.38 30.48k3 8.60 8.25 8.11
31.08 29.16 28.36
R 2.03 0.59 0.39
3.72 0.87 2.12
表 4　总黄酮含量为指标方差分析
离差来源 离差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
A 8.08 2 32.06 4.32 ＊
B 0.54 2 2.20 4.32C 0.24 2 0.99 4.32
误差 0.49 4
　　＊为显著性
表 5　相对积分峰面积为指标方差分析
离差来源 离差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
A 22.36 2 16.20 4.32 ＊
B 1.21 2 0.88 4.32
C 6.89 2 4.99 4.32 ＊
误差 2.76 4
　　＊为显著性
3.4 　分析指标的确定 本实验以芦丁为对照品加入显色剂于
400 ～ 800 nm波长范围内扫描 ,其在 510 nm具有最大吸收 ,主要
原因是其具有邻二酚羟基可与显色剂显色。但天山花楸叶醇提
液中 , 除含有黄酮类化合物 , 绿原酸含量也较高 [ 7] 。绿原酸也具
有邻二酚羟基可与显色剂显色 ,对天山花楸叶中总黄酮含量测定
产生干扰 [ 8] 。实验表明以芦丁为对照品 , 以 NaNO2 -Al(NO3)3-NaOH为显色剂 ,在 510 nm测定天山花楸叶醇提液中总黄酮
含量的方法专属性不强 、有局限性 、准确性较差。而 HPLC图谱
显示 , 样品中各组分的色谱峰分离度良好 , 可以避免样品中其它
组分干扰目标化合物的分析 , 专属性较强。且经初步实验验证
20 ～ 30 min为一系列黄酮类化合物的色谱峰。因此 ,本实验选择
以 HPLC图谱 20 ～ 30min相对积分峰面积为指标来分析天山花
楸叶提取样品。
3.5 　最佳工艺条件的确定 通过实验 , 以 HPLC图谱中总黄酮
相对积分峰面积为指标 ,确定了天山花楸叶中总黄酮的最佳提取
工艺条件 ,其中料液比为 1/8 g· ml-1。但考虑到干燥花楸叶粉
末吸水性较大 ,影响样品流动性 , 不利于循环超声提取 ,且由表 5
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.12 时珍国医国药 2009年第 20卷第 12期
可知 , 料液比对总黄酮的提取无显著性影响 , 综合分析考虑将料
液比确定为 1/10g· ml-1。
3.6 　结论 与比色法测定总黄酮含量为指标相比 , 以 HPLC图
谱中黄酮类化合物相对积分峰面积为指标对样品的分析方法具
有专属性强 、准确度高 、重复性好等特点 ,易于生药及制剂质量控
制。以其确定的天山花楸叶总黄酮提取工艺合理 ,提取率稳定。
参考文献:
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收稿日期:2008-12-24;　修订日期:2009-07-29
基金项目:广东省中医药管理局项目(No.2007352)
作者简介:符少莲(1984-),女(汉族),广东湛江人 ,现任暨南大学组织部
组织科科员 ,学士学位 ,主要从事党务 、党校管理工作.
＊通讯作者简介:周光雄(1962-), 男(汉族),安徽绩溪人 , 现任暨南大学
药学院教授 ,博士学位 ,主要从事天然药物化学与生药学研究工作.
菱角皮提取物中鞣酸类化合物
的含量测定及其指纹图谱研究
符少莲 ,周光雄＊ ,黄美燕
(暨南大学药学院 ,广东 广州　510632)
摘要:目的 建立菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣质类化合物的 HPLC含量测定方法 , 并对提取物 HPLC指纹图谱条件进行
研究分析。方法 采用反相 C
18
柱(4.6mm×200 mm, 5 μm), 甲醇 -0.5%乙酸水溶液为流动相 ,梯度洗脱 , 柱温为 25℃,
流速为 0.8 ml/min, 在 276 nm下进行检测。结果 菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣质类化合物 1, 2, 6-三没食子酰 -β -D-
葡萄糖的含量为 85.7mg/g, 加样回收率为 92.49%;1, 2, 4, 6-四没食子酰 -β -D-葡萄糖的含量为 244mg/g, 加样回收
率为 96.41%;初步探讨了菱角皮提取物的指纹图谱条件。结论 采用高效液相法测定菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣质类
化合物的含量 , 简便 、快速 、准确;初步得到分离菱角皮提取物各特征峰的色谱条件 , 为以后建立指纹图谱和制定菱角皮
药材及其活性提取物的质量标准提供了依据。
关键词:菱;　果皮;　鞣酸;　高效液相色谱;　指纹图谱
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)12-3040-03
DeterminationofTanninCompoundsinExtractfromtheFruitCrustofTrapabispinosa
RoxbanditsFingerprint
FUShao-lian, ZHOUGuang-xiong＊ , HUANGMei-yan(ColegeofPharmacology, JinanUniversity, Guangzhou, 510632, China)
Abstract:ObjectiveToestablishdeterminationmethodoftannincompoundsfrombioactiveethylacetateextractofthefruitcrustof
TrapabispinosaRoxbbyHPLC, andtostudyonanalysisconditionsofHPLCfingerprintoftheextract.MethodsUsereversephaseC18column(4.6mm×200mm, 5μm), detectionwave-lengthat276 nm, columntemperatureat25℃, flowrateata0.8 ml/min, and
gradientaqueousmethanolsolutioncontaining0.5%aceticacidasamobilephase.ResultsThedeterminationoftannicacidcompound
1, 2, 6-tri-galoyl-β -D-glucosefromtheextractwas85.7mg/g, andtheaveragerecoverieswas92.49%;thedeterminationof
tannicacidcompound1, 2, 3, 6-tetra-galloyl-β -D-glucosewas244mg/g, andtheaveragerecoverieswas96.41%;aprelimi-
narystudyonconditionsofHPLCfingerprintforthebioactiveextractwascariedout.ConclusionThedeterminationmethodforthe
tannincompoundsfromethylacetateextractofthefruitcrustoftheplantbyHPLCissimple, fastandaccurate.Chromatographiccondi-
tionsofethylacetateextractoftheplantwasinitiallyobtained, whichprovidethebasisforestablishmentoftheHPLCfingerprintand
makingqualitystandardofthecrudedruganditsbioactiveextractfromtheplant.
Keywords:TrapabispinosaRoxb;　Fruitcrust;　Tannin;　 HPLC;　Fingerprint
　　菱 TrapabispinosaRoxb, 一年生浮水或半挺草本 ,属菱科。我
国有 15种和 11变种 ,产于全国各地 , 以长江流域亚热带地区分
布与栽培最多 [ 1] 。其性甘味凉 , 无毒 , 入肠 、胃二经 , 有清热祛
暑 、除湿祛风 、益气健脾之功 [ 2] 。菱壳 , 为菱科植物菱或其同属
植物的果皮。其作为药物始载于 《本草纲目拾遗》。据 《中华药
海》所载 , 其性味微苦 、涩 , 凉 , 入肺 、脾 、大肠三经 , 具有解毒疗
疮 、涩汤止泻 、清化湿热的功效 [ 2] 。
经查阅文献得知 ,东北菱 T.manshuricaFlerov菱角的提取物
确实有一定的抗肿瘤活性 [ 3 ～ 5] 。在我们的前期工作中 , 选取菱
TrapabispinosaRoxb的菱角皮作为研究对象 ,采用 MTT法对菱角
皮提取物抗肝癌 HepG2细胞活性成分进行活性追踪 ,采用液 -
液萃取提取物各极性部位 , 也证实了菱角皮醋酸乙酯提取物对
HepG2细胞有一定的抑制作用;采用反相 C18柱层析和 sephadexLH-20排阻层析分离活性成分 ,得到两个鞣质类化合物 1, 2, 6
-三没食子酰 -β -D-葡萄糖(1)和 1, 2, 4, 6-四没食子酰 -
β -D-葡萄糖(2), 对该两个化合物进行了抗癌活性实验 , 证实
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 12期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.12