全 文 ：东南大学学报(医学版)
J Southeast Univ(Med Sci Edi) 2016，Apr;35(2):228
-231
手术损伤引起的应激反应等。因此，本研究均在术后
第 7 天抽血复查循环骨髓干细胞水平，以避免手术创
伤对研究结果的影响。
本研究结果显示，胃癌患者循环骨髓干细胞水平
较对照组明显升高，根治性切除术后胃癌患者循环骨
髓干细胞水平明显下降。说明循环骨髓干细胞水平可
以作为诊断胃癌及判断胃癌手术治疗效果的一个重要
指标。然而由于循环骨髓干细胞水平受多种因素影
响，而流式细胞技术又相对复杂，限制了流式细胞技术
检测循环骨髓干细胞水平在临床中的应用;另外循环
骨髓干细胞水平与肿瘤浸润程度、放化疗效果及远期
生存率等指标是否相关，尚需进一步研究证实。
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［收稿日期］2015-10-10 ［修回日期］2015-12-01
［基金项目］江苏省科技厅高技术研究计划基金(BG2007607);南通大学校级自然科学类科研基金一般项目(12Z020)
［作者简介］王成牛(1985-)，男，江苏南京人，实验师，医学硕士。E-mail:wangchengniu@ 163． com
［通信作者］朱俐 E-mail:zhulili65@ 126． com
［引文格式］王成牛，冯展波，彭彬，等．藁本内酯对低灌注大鼠水迷宫成绩的改善和对海马神经元保护作用［J］．东南大学学报:医学版，2016，35
(2):228-231．
·论 著·
藁本内酯对低灌注大鼠水迷宫成绩的
改善和对海马神经元保护作用
王成牛1，冯展波2，彭彬2，李洁佳1，陆亚鹏2，朱俐2
(1．南通大学医学院 基础医学研究中心，江苏 南通 226001;2．南通大学 航海医学研究所，江苏 南通 226001)
·822·
［摘要］目的:研究藁本内酯对低灌注大鼠水迷宫成绩的改善和对海马神经元的保护作用，探讨其神经元保
护的作用机制。方法:取健康雄性 SD大鼠 24 只(体重 260 ～ 280 g)，随机分为对照组、低灌注组和藁本内酯
组，每组 8 只。对低灌注组和藁本内酯组大鼠行双侧颈总动脉永久性结扎术，对照组不结扎。术后第8 天，
藁本内酯组大鼠灌胃给予藁本内酯(以大豆油为溶剂，每日剂量 80 mg·kg －1)，另外两组大鼠予相同体积的
大豆油灌胃。所有大鼠连续灌胃 21 d后进行水迷宫实验，观察各组大鼠水迷宫成绩(即潜伏期的长短)的差
异。水迷宫实验结束后处死大鼠，采用尼氏染色观察各组大鼠海马 CA1 和 CA3 区神经元尼氏小体阳性细胞
数量的变化，采用免疫荧光和免疫组化法观察各组大鼠海马 CA1 和 CA3 区神经元的神经元特异性核蛋白
(NeuN)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶 3(Caspase3)表达变化。结果:
藁本内酯组大鼠水迷宫成绩较低灌注组明显提高(P ＜ 0． 05)，海马 CA1、CA3 区尼氏小体阳性细胞数量较低
灌注组明显增加，海马 CA1、CA3 区 GFAP和 Caspase3 阳性细胞数量较低灌注组明显减少。结论:藁苯内酯
能够改善低灌注大鼠水迷宫成绩，并对海马区神经元具有较好的保护作用。
［关键词］藁本内酯;脑低灌注;神经保护;海马;凋亡
［中图分类号］Ｒ966 ［文献标识码］A ［文章编号］1671-6264(2016)02-0228-04
doi:10． 3969 / j． issn． 1671-6264． 2016． 02． 019
藁本内酯(Ligustilide)可透过血脑屏障，改善脑微
循环、抗氧化损伤、抑制炎症反应，并可提高胆碱乙酰
转移酶活性，有利于改善记忆功能［1
-6］。本课题中，我
们研究藁本内酯对低灌注大鼠水迷宫成绩的改善和对
海马神经元的保护作用，并探讨藁本内酯神经保护作
用的机制，为其临床应用提供实验参考。
1 材料与方法
1． 1 实验动物与模型制备
健康雄性清洁级 SD大鼠 24 只(260 ～ 280 g)，由
南通大学医学实验动物中心提供。将大鼠随机分为对
照组、低灌注组和藁本内酯组，每组 8 只。对低灌注组
和藁本内酯组大鼠行双侧颈总动脉永久性结扎术，对
照组不结扎。术后第 8 天，藁本内酯组予藁本内酯灌
胃(以大豆油为溶剂，每日剂量 80 mg·kg －1)，另外两
组大鼠予相同体积的大豆油灌胃。
1． 2 主要试剂和器材
藁本内酯(本实验室制备，纯度:95% ～ 97%)，鼠
抗 GFAP一抗、鼠抗 NeuN一抗(Millipore，美国)，兔抗
Caspase3 一抗、FITC羊抗鼠二抗及 TＲITC 羊抗兔二抗
(Bioworld，美国)，抗鼠 /兔二抗试剂盒(北京中杉金
桥)，其他试剂为国产分析纯。荧光显微镜、冰冻切片
机(莱卡，德国)，水迷宫(北京，中国药物科学院)。
1． 3 实验方法
大鼠连续灌胃 21 d 后进行连续 5 d 的水迷宫实
验，实验流程见本课题组前期报道［7］，由电脑自动记
录大鼠潜伏期时间。水迷宫实验结束后处死大鼠取
脑，制备冰冻切片，切片厚度 25 μm。取切片行尼氏染
色，观察各组大鼠海马 CA1 和 CA3 区神经元尼氏小体
阳性细胞数量的变化;采用免疫荧光和免疫组化法观
察各组大鼠海马 CA1 和 CA3 区神经元的神经元特异
性核蛋白(neuronal specific nuclear protein，NeuN)、神
经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，
GFAP)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶 3(cysteinyl
aspartate specific proteinase 3，Caspase3)表达变化。
1． 4 统计学处理
利用 Image-Pro Plus Version 6． 0(IPP 6． 0)软件对
大鼠海马 CA1 和 CA3 区尼氏小体阳性细胞、GFAP阳
性细胞和 Caspase3 阳性细胞进行统计:观察和计数面
积为 0． 2 mm ×0． 2 mm，双侧计数，每组至少统计 3 只
不同大鼠的脑切片。大鼠水迷宫潜伏期以电脑记录数
据为统计数据。尼氏小体阳性细胞、GFAP 阳性细胞
和 Caspase3 阳性细胞统计数据为各组数据与对照组
平均值的比值。各组数据以 x ± s表示，利用 SPSS 13． 0
进行方差分析，P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2． 1 藁本内酯能有效提高低灌注大鼠水迷宫成绩
见图 1。
与对照组比较，a P ＜ 0． 01;与低灌注组比较，b P ＜ 0． 05
图 1 各组大鼠水迷宫潜伏期结果
·922·王成牛，等．藁本内酯对低灌注大鼠水迷宫成绩的改善和对海马神经元保护作用
图 1 显示，随着实验天数的增加，各组大鼠的潜伏
期出现差异。从第 3 天开始，低灌注组大鼠的潜伏期
较对照组大鼠的潜伏期明显延长(P ＜ 0． 01)，即水迷
宫成绩变差;从第 4 天起，藁本内酯组大鼠的潜伏期较
低灌注组大鼠的潜伏期明显缩短(P ＜ 0． 05)，即水迷
宫成绩提高。
2． 2 藁本内酯能有效抑制低灌注大鼠海马尼氏小体
阳性细胞数量的减少
见表 1。
表 1 各组大鼠海马 CA1、CA3 区尼氏小体阳性细胞
数量与对照组平均值的比值
组 别 海马 CA1 区 海马 CA3 区
对照组 1 ± 0． 03 1 ± 0． 03
低灌注组 0． 42 ± 0． 08a 0． 56 ± 0． 07a
藁本内酯组 0． 94 ± 0． 04b 0． 91 ± 0． 03b
与对照组比较，a P ＜ 0． 01;与低灌注组比较，b P ＜ 0． 01
表 1 显示，低灌注组大鼠海马 CA1、CA3 区尼氏小
体阳性细胞数量与对照组平均值的比值较对照组明显
减小(P ＜ 0． 01)，藁本内酯组海马 CA1、CA3 区尼氏小
体阳性细胞数量与对照组平均值的比值较低灌注组明
显增大(P ＜ 0． 01)。
2． 3 藁本内酯能有效抑制低灌注大鼠海马 GFAP 阳
性细胞的增加
见表 2。
表 2 各组大鼠海马 CA1、CA3 区 GFAP 阳性细胞数
量与对照组平均值的比值
组 别 海马 CA1 海马 CA3
对照组 1 ± 0． 06 1 ± 0． 08
低灌注组 1． 65 ± 0． 12a 1． 5 ± 0． 12a
藁本内酯组 1． 09 ± 0． 07b 1． 14 ± 0． 11b
与对照组比较，a P ＜ 0． 01;与低灌注组比较，b P ＜ 0． 01
表 2 显示，低灌注组大鼠海马 CA1、CA3 区 GFAP
阳性细胞与对照组平均值的比值较对照组明显增大
(P ＜ 0． 01)，藁本内酯组海马 CA1、CA3 区 GFAP 阳性
细胞数量与对照组平均值的比值较低灌注组明显减小
(P ＜ 0． 01，表 2)。
2． 4 藁本内酯能有效减少低灌注大鼠海马 Caspase3
阳性细胞的增加
见表 3、图 2。
表 3 各组大鼠海马 CA1、CA3 区 Caspase3 阳性细胞
数量与对照组平均值的比值
组 别 海马 CA1 海马 CA3
对照组 1 ± 0． 21 1 ± 0． 09
低灌注组 7． 12 ± 11． 2a 3． 2 ± 0． 36a
藁本内酯组 3． 24 ± 0． 18b 1． 75 ± 0． 13b
与对照组比较，a P ＜ 0． 01;与低灌注组比较，b P ＜ 0． 01
A ～ C为海马 CA1 区，D ～ F为海马 CA3 区;A和 D为对照组，B和 E为低灌注组，C和 F为藁本内酯组
图 2 大鼠海马区 NeuN和 Caspase-3 免疫荧光双标结果
·032· 东南大学学报(医学版) 2016 年 4 月，35(2)
表 3 显示，低灌注组海马 CA1 和 CA3 区 Caspase3
阳性细胞与对照组平均值的比值较对照组明显增大
(P ＜ 0． 01);藁本内酯组海马 CA1 和 CA3 区 Caspase3
阳性细胞数量与对照组平均值的比值较低灌注组明显
减小(P ＜0． 01)。NeuN 和 Caspase-3 免疫荧光双标结
果显示，低灌注大鼠的 Caspase3 阳性细胞与 NeuN 阳
性细胞基本重叠。
3 讨 论
大鼠水迷宫成绩(即潜伏期的长短)是反映大鼠
空间学习记忆功能的一项重要指标;而学习记忆功能
的正常发挥与海马神经元的活力和数量密切相关。尼
氏小体是神经元糙面内质网的核糖体，也是神经细胞
功能活性的形态指标。当神经元的轴突被切断或受到
过分的刺激时，尼氏小体会逐渐消失。NeuN是一种成
熟的神经元标记物，不与星形胶质细胞和小胶质细胞
发生交叉反应，其阳性细胞数量的多少，能更加准确地
代表神经元的数量。本实验中，藁本内酯组大鼠海马
CA1、CA3 区尼氏小体阳性和 NeuN 阳性细胞数量(数
据未给出)与对照组平均值的比值明显大于低灌注组
大鼠，说明藁本内酯治疗后的大鼠海马 CA1、CA3 区神
经元的活力和数量指标较低灌注大鼠更好。藁本内酯
组大鼠水迷宫成绩较低灌注组大鼠明显提高，正是这
种生理性差异的直接体现。
在中枢神经系统中，炎症因子 NF-κB 可广泛表达
于神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。其在大鼠脑
缺血神经细胞中表达升高。有研究发现，在脑出血神
经元中 Caspase3 的表达与 NF-κB的表达呈正相关［8］。
本研究中，我们发现藁本内酯能够有效减少低灌注大
鼠海马 CA1、CA2 区域 GFAP和 Caspase3 阳性细胞，推
测藁本内酯通过减少该区域 Caspase3 阳性细胞使炎
症因子 NF-κB的表达减少，但是其确切的机制还需要
进一步的实验进行验证。
综上所述，藁本内酯能够有效改善低灌注大鼠水
迷宫成绩，这种改善作用可能是通过抑制低灌注大鼠
海马 CA1、CA3 区域尼氏小体阳性细胞的减少，并且抑
制该区域 GFAP 和 Caspase3 阳性细胞的增加实现的。
虽然关于藁本内酯的神经保护作用机制不断被发现和
阐明，但是更深入的药理机制仍有待进一步的研究，比
如给药后海马区域正常神经元是来自于缺血前，还是
缺血后的再生，还是两者都有的问题尚未得到解决，这
将是我们今后进一步研究的课题。
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·132·王成牛，等．藁本内酯对低灌注大鼠水迷宫成绩的改善和对海马神经元保护作用