全 文 ：genesisImurineSVRendothelialcelline[ J] .PlautaMed,
2003, 69(1):26-32.
[ 9] 　倪力军 ,邬科芳,张立国.加热方式对丹酚酸提取物质量的影
响 [ J].中药新药与临床药理 , 2006, 17(1):55-57.
[ 10] 　张　军 ,王凤云 ,詹丽玲 ,等.丹参药材提取液中丹酚酸 B稳
定性影响因素的考察[ J] .中国中药杂志 , 2005, 30(10):789-
790.
[ 11] 　余德然 ,王康才 ,王峥涛 ,等.丹参中丹参素 、原儿茶醛来源的
初步研究 [ J] .中国天然药物 , 2005, 3(3):148-150.
[ 12] 　倪力军 ,顾海昕 ,高秀蛟 ,等.一种从丹参中提取丹酚酸 B的
新工艺 [ J] .华东理工大学学报, 2006, 32(8):964-966.
[ 13] 　倪力军 ,顾海昕 ,张立国.提取-吸附耦合富集丹酚酸 B的制
备方法及其装置 [ P] .CN1010774221A,公开日:2007-11-21.
卷柏总黄酮纯化工艺研究
冯志毅 1 , 　赵献敏 2 , 　王彦志2 , 　魏　悦 2 , 　郭永慧 2 , 　张　冰 1 , 　郑晓珂 2＊
(1.北京中医药大学 ,北京 100029;2.河南中医学院 , 河北 郑州 450008)
收稿日期:2008-02-02
基金项目:河南省高校新世纪优秀人才支持计划(2006HANCET-08);河南省重大公益性科研计划项目(08110091800)
作者简介:冯志毅(1973-),男 ,博士 ,研究方向:临床中药学 , Tel:(0371)65575963
＊通讯作者:郑晓珂(1963-),女 ,博士 ,教授 ,研究方向:中药活性成分及其作用机理。 Tel:(0371)65575963
关键词:卷柏;总黄酮;纯化工艺;聚酰胺
摘要:目的:研究聚酰胺富集卷柏总黄酮的工艺参数。方法:以总黄酮和阿曼托双黄酮的含量以及总黄酮的收率为考察
指标 , 经聚酰胺吸附柱富集后 , 分别采用紫外分光光度法和高效液相色谱法测定。结果:纯化工艺条件为:卷柏提取物与
聚酰胺比为 50∶3(mg/mL),树脂径高比为 1∶6, 用 10倍量柱体积的 50%乙醇除杂 , 用 6倍量柱体积的 80%乙醇洗脱 ,
洗脱流速为 1.0 mL/min。结论:本法富集纯化卷柏总黄酮工艺稳定可行。
中图分类号:R284.2　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2009)04-0544-03
　　卷柏为卷柏科植物卷柏(Selaginelatamariscina
(Beauv.)Sping)或垫状卷柏(Selaginelapulvinata
(hook.etGrev.)Maxim)的干燥全草 ,其性辛平 ,具
有活血通经之功效 [ 1] 。现代药理学研究证实 ,卷柏
所含的阿曼托双黄酮 、扁柏双黄酮 、新柳杉双黄
酮 [ 2 ～ 4]等化合物 ,属天然多酚类抗氧化剂 ,具有抗脂
质过氧化和清除自由基的作用 [ 5 -7] 。
本研究采用聚酰胺吸附法纯化卷柏总黄酮 ,以
总黄酮和阿曼托双黄酮的含量以及总黄酮的收率为
考察指标 ,为确定卷柏总黄酮的纯化工艺提供实验
依据。
1　仪器与试药
AB204-N型万分之一电子天平 , AE240型十万
分之一电子天平 ,岛津 UV-2201型紫外分光光度
计 , ShimadzuLC-10AT高效液相色谱仪 , SK2200H
型超声波清洗器 (上海科导超声仪器有限公司),
DZKW-4电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限
公司), SB-1000型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限
公司),聚酰胺树脂(浙江省台州市路桥四甲生化塑
料厂)。
乙腈为色谱纯(天津市四友精细化学品有限公
司),乙醇等其它试剂均为分析纯 ,水为超纯水。
药材卷柏购自本草国药堂 ,经河南中医药药学
院生药学科陈随清教授和董诚明教授鉴定为卷柏科
卷柏属卷柏 Selaginelatamariscina(Beauv.)Sping
的全草。阿曼托双黄酮为本实验室自制 ,纯度达到
98%以上 。
2　方法和结果
2.1　样品制备
取卷柏药材适量 ,用 10倍量的 70%乙醇回流
提取 2次 ,每次 2 h,趁热过滤 ,减压回收乙醇 ,真空
干燥至恒重 ,即得。
2.2　聚酰胺的预处理
取聚酰胺粉适量 , 95%乙醇浸泡 24 h,装柱 ,用
4倍量柱体积的 95%乙醇洗脱 ,洗至洗脱液透明并
在蒸干后无残渣 ,再用 3倍量柱体积的 5% NaOH
水溶液冲洗 ,最后用蒸馏水洗脱至中性 。
2.3　纯化工艺因素考察
2.3.1　聚酰胺粒径考察　取已预处理的(14 ～ 30)
目 、(30 ～ 60)目 、(60 ～ 100)目 、(100 ～ 200)目 4种
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不同规格的聚酰胺树脂 ,分别装于同一径高比的 4
根层析柱中 ,取相同重量样品 ,用 95%乙醇溶解后 ,
聚酰胺拌样上柱 ,用水洗至洗脱液无色 ,继用 95%
乙醇洗脱至无色 ,测定 95%乙醇洗脱液中总黄酮和
阿曼托双黄酮的含量 ,计算总黄酮收率 (卷柏总黄
酮收率 =洗脱液中总黄酮量上样总黄酮量 ×100%)。由于 (100
～ 200)目的聚酰胺流速过慢 ,舍弃 ,其他规格的聚
酰胺考察结果见图 1。
图 1　聚酰胺粒径考察
　　由图 1可以看出 ,随着聚酰胺粒径的增大 ,卷柏
总黄酮和阿曼托双黄酮的含量以及总黄酮的收率均
有上升趋势 ,确定聚酰胺树脂的粒径为(60 ～ 100)
目 。
2.3.2　层析柱径高比考察　取预先处理过的(60
～ 100)目聚酰胺树脂 ,分别装于径高比为 1∶4、1∶
6、1∶8的 3根层析柱中 ,取相同重量样品 ,用 95%
乙醇溶解后 ,聚酰胺拌样上柱 ,用水洗至洗脱液无
色 ,继用 95%乙醇洗脱至无色 ,测定 95%乙醇洗脱
液中总黄酮和阿曼托双黄酮的含量 ,计算总黄酮收
率 。结果见表 1。
表 1　 层析柱径高比考察
径高比 总黄酮的含量 /% 阿曼托双黄酮的含量 /% 总黄酮收率 /%
1∶ 4 57.47 22.75 74.33
1∶ 6 62.00 33.64 81.62
1∶ 8 53.13 27.11 79.11
　　结果表明:树脂径向比为 1∶6时 ,卷柏总黄酮
的含量和收率以及阿曼托双黄酮的含量最高 ,故确
定树脂径高比为 1∶6。
2.3.3　样品上样量考察 　根据文献报道 [ 8] ,取
0.500 g、0.600 g、0.700g样品 3份 ,聚酰胺 30 mL,
样品用 95%乙醇溶解后 ,聚酰胺拌匀 ,上径高比为 1
∶6(1.85 cm×11 cm)的层析柱 ,先用水洗至洗脱
液无色 ,继用 95%乙醇洗脱至无色 ,测定 95%乙醇
洗脱液中总黄酮和阿曼托双黄酮的含量 ,计算总黄
酮收率。结果见表 2。
表 2　 样品上样量考察
样品号 总黄酮的含量 /% 阿曼托双黄酮的含量 /% 总黄酮收率 /%
样 1 61.04 34.42 82.54
样 2 60.11 32.73 79.67
样 3 60.48 33.63 72.26
　　由表 2可以看出 ,随着上样量的增大 ,卷柏总黄
酮收率有下降趋势 ,所以确定上样量为 0.5 g/30
mL,即卷柏提取物与聚酰胺比为 50∶3(mg/mL)。
2.3.4　除杂溶剂浓度考察　取 0.500 g样品 5份 ,
用 95%乙醇溶解 ,聚酰胺拌样 , 上径高比为 1∶6
(1.85cm×11 cm)的聚酰胺柱 , 分别用水 、 10%、
30%、50%、60%乙醇洗脱至无色 ,继用 95%乙醇洗
脱至无色 ,测定 95%乙醇洗脱液中总黄酮和阿曼托
双黄酮的含量 ,计算总黄酮收率。结果见图 2。
图 2　除杂溶剂浓度考察
　　由图 2可以看出 , 50%乙醇作为除杂溶剂时 ,总
黄酮的含量和收率最高 ,指标性成分阿曼托双黄酮
的含量达到最大 ,确定以 50%乙醇为除杂溶剂 。
2.3.5　除杂溶剂体积考察　取 0.500 g样品 8份 ,
用 95%乙醇溶解后 ,聚酰胺拌样 ,上径高比为 1∶6
的聚酰胺柱 (1.85 cm×11 cm),分别用 2、 4、6、8、
10、12、14、16倍量柱体积的 50%乙醇除杂 ,继用
95%乙醇洗脱至无色 ,测定洗脱液中总黄酮和阿曼
托双黄酮的含量 ,计算总黄酮收率 。结果见图 3。
图 3　除杂溶剂体积考察
　　由图 3可以看出 ,随着除杂溶剂体积的增大 ,卷
柏总黄酮和阿曼托双黄酮的含量有上升趋势 ,但当
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体积超过 10倍量柱体积时 ,总黄酮收率开始呈现下
降趋势 ,综合考虑三项指标确定 10倍量柱体积为卷
柏的最佳除杂溶剂体积。
2.3.6　洗脱溶剂浓度考察　取 0.500 g样品 3份 ,
用 95%乙醇溶解后 ,聚酰胺拌样 ,上径高比为 1∶6
(1.85cm×11cm)的聚酰胺柱 ,用 10倍量柱体积的
50%乙醇除杂 ,然后分别用 70%、80%、95%乙醇洗
脱至无色 ,测定洗脱液中总黄酮和阿曼托双黄酮的
含量 ,计算总黄酮收率 。结果见表 3。
表 3　 洗脱溶剂浓度考察
洗脱剂(乙醇)
浓度 /%
总黄酮的
含量 /%
阿曼托双黄酮
的含量 /%
总黄酮
收率 /%
70 58.92 27.20 77.89
80 66.65 34.70 82.56
95 49.51 32.68 70.41
　　由表 3可以看出 , 80%乙醇洗脱时 ,卷柏总黄酮
含量和收率以及阿曼托双黄酮的含量较高 ,故确定
80%乙醇为洗脱溶剂。
2.3.7　流出曲线　取 0.500g样品 4份 ,用 95%乙
醇溶解后 ,聚酰胺拌样 ,上径高比为 1∶6(1.85 cm
×11 cm)的聚酰胺柱 ,用 10倍量柱体积的 50%乙
醇除杂 ,再用 80%的乙醇洗脱 ,洗脱流速分别为 0.5
mL/min(V1)、1.0 mL/min(V2)、1.5mL/min(V3)、
2.0mL/min(V4),分段收集洗脱液 。每 1 BV收集
1份 ,共收集 10份。测定 ,绘制流出曲线 ,结果见图
4。
图 4　流出曲线图
　　由图 4可以看出 ,洗脱流速分别为 0.5、1.0、
1.5、2.0 mL/min时 ,流出曲线的变化趋势无明显差
异 ,即洗脱剂用量为 6BV时 ,已基本洗脱完全 ,将不
同流速下 6BV的洗脱液合并 ,测定洗脱液中总黄酮
和阿曼托双黄酮的含量 ,计算总黄酮收率 ,见表 4,
结果显示流速为 V2即 1.0 mL/min时 ,总黄酮含量
和收率最高 ,阿曼托双黄酮的含量达到最大 ,故确定
洗脱流速为 1.0mL/min。
表 4　 流速考察
流速 总黄酮的含量 /% 阿曼托双黄酮的含量 /% 总黄酮收率 /%
V1 62.45 33.91 77.25
V2 67.53 39.72 82.26
V3 60.74 31.36 79.65
V4 58.97 32.82 69.94
3　总　结
综上得出卷柏有效部位纯化工艺为:卷柏提取
物与聚酰胺比为 50∶3(mg/mL),树脂径高比为 1∶
6,用 10倍量柱体积的 50%乙醇除杂 ,用 80%乙醇
洗脱 ,洗脱剂用量为 6倍量柱体积 ,洗脱流速为 1.0
mL/min。
4　讨论
4.1　目前文献报道对黄酮类成分的富集多用大孔
吸附树脂 ,但由于卷柏总黄酮中含有大量脂溶性成
分 ,难以完全溶解于水 ,产生大量沉淀 ,经测定沉淀
中总黄酮含量达 30%,总黄酮损失较多 ,致使转移
率较低 ,限制了大孔吸附树脂在卷柏总黄酮纯化上
的应用。聚酰胺树脂可干法装柱 ,获得的总黄酮成
分损失小 ,故采用聚酰胺吸附法纯化卷柏总黄酮 。
4.2　聚酰胺对卷柏总黄酮具有良好的吸附性能 ,在
其纯化工艺条件下 ,获得的卷柏总黄酮含量大于
60%,指标性成分阿曼托双黄酮含量大于 30%,总
黄酮收率大于 75%。
4.3　本实验采用紫外分光光度法测定总黄酮与高
效液相色谱法测定指标性成分阿曼托双黄酮相结
合 ,增加了因素选择的准确性和可靠性 。
参考文献:
[ 1] 　中国药典 [ S] .一部.2005:157.
[ 2] 　毕跃峰 ,郑晓珂 ,冯卫生 ,等.卷柏属植物化学成分与药理活性
[ J] .国外医药-植物药分册 , 2002, 17(3):97-100.
[ 3] 　毕跃峰 ,郑晓珂 ,冯卫生.卷柏中化学成分的分离与结构鉴定
[ J] .药学学报 , 2004, 39(1):41-45.
[ 4] 　郑晓珂 ,毕跃峰 ,冯卫生 ,等.卷柏中化学成分 [ J] .药学学报 ,
2004, 39(14):228-266.
[ 5] 　MilardDR.Theislandflapincleftpalatessurgery[ J].Surg
GynaecolObstet, 1993, 116:297.
[ 6] 　熊国强 ,雷荣昌.析因设计在腭裂修复动物实验中的应用 [ J].
中国现代医学杂志 , 2002, 12(16):18-20.
[ 7] 　徐　智 ,贾素洁 ,谭桂山 ,等.垫状卷柏中双黄酮药理活性的研
究 [ J] .中国现代医学杂志 , 2004, 14(14):88-100.
[ 8] 　张广强 ,黄世德.分析化学 [ M].北京:学苑出版社 , 2001:342.
546
2009年 4月
第 31卷　第 4期
中 成 药
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